臺灣大學獸醫學研究所學位論文
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在我國，現行與獸醫相關的法律條文中，對獸醫醫療行為、獸醫職責、醫療業務的定義與規範既不明確且又缺乏；同時，專科獸醫師的認證或繼續教育的準則亦不存在；可見獸醫相關法律的訂立，在我國是不足夠的，且易造成醫療糾紛與其它缺點。因此，參考先進國家立法精神，制定一套獸醫專門醫療法來規範上述事宜，是急切且勢在必行的。目前也已在政府機關指示下，組織成立法委員會進行相關事務的推動，並且已完成初步草案的擬訂。獸醫醫療法在準備進入立法程序前，必需事先評估分析此立法對各界的影響，包括產業界、獸醫界、法界、社會大眾，此乃法規影響分析（regulatory impacts analysis，RIA）的原則；而此可透過問卷來進行各界對該法律初步意見的調查，並藉法規影響分析中的社會影響評估（social impacts analysis，SIA）概念，進行各項量化意見的分析；在隨機抽樣的問卷調查之後，可利用統計分析方法如卡方檢定（chi-square test）、次數分配長條圖，將量化的數據結果提供給各相關層級及立法委員會，以此作為制定及修改獸醫醫療法草案之初步依據。針對獸醫醫療法現有的草案內容，將主要涵蓋的四大主體分類成開/執業獸醫、獸醫相關規範執行機構、一般使用獸醫醫療服務者、獸醫相關科系學生，依此各別進行問卷調查以及數據的統計分析。結果發現，各界對本法中各條文精神的看法與意見，差異相當大，僅少數幾則條文是一致被接受的。而透過問卷調查之後的訪談，本研究收集到更具體且細微的資料。本研究即根據統計分析的量化結果，以及訪談得到的非量化資料，於此提出獸醫醫療法創立的建議作法。
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大麻二酚是大麻生物鹼中主要不具中樞活性的成份，具有許多的藥理作用，包括免疫調節及抗發炎。本實驗的主旨在探討大麻二酚對初代免疫細胞，包括脾臟細胞及微膠細胞之促凋亡作用及其潛在之作用機制。在小鼠脾臟細胞，大麻二酚會誘發細胞凋亡、產生活性氧化物、降低細胞內glutathione（GSH）之含量，並且促進caspase-8的活化。上述大麻二酚之作用，在給予thiol類抗氧化劑N-acetyl-L-cysteine（NAC）後，即被回復。給予caspase-8的抑制劑也可以有效地回復大麻二酚誘發之凋亡作用，但是不影響大麻二酚造成的活性氧化物之生成。上述實驗結果說明大麻二酚於初代淋巴球細胞誘發之凋亡作用和氧化性壓力造成之caspase-8的活化密切相關。 由於大麻二酚已被證實可被微粒體中的酵素轉變成hydroxyquinone類的代謝物HU-331，並和細胞內的GSH形成鍵結物。為了進一步釐清大麻二酚誘發脾臟細胞凋亡之機制，本研究接著測試HU-331是否會經由造成脾臟細胞內GSH的流失而誘發凋亡。結果顯示HU-331會誘發脾臟細胞之凋亡及細胞內thiol和GSH的逐漸流失；給予thiol類抗氧化劑NAC及N-(2-mercaptopropionyl) glycine可以回復前述HU-331致凋亡及GSH流失之作用，而非thiol類的抗氧化物catalase及pyruvate則無效。在脾臟細胞也觀察到類似的結果，即大麻二酚的凋亡作用能被thiol類抗氧化劑回復，而非thiol類的抗氧化物則無效。上述結果說明大麻二酚可能是經由其活性代謝物HU-331造成細胞內thiol之流失而導致脾臟細胞的凋亡。 在小鼠初代微膠細胞，大麻二酚會誘發細胞凋亡及活化caspase-8及caspase-9，機制研究顯示抗氧化劑NAC和GSH、GPR55致效劑abnormal-CBD及vanilloid受體、CB1和CB2受體拮抗劑均無法回復大麻二酚所誘發之凋亡作用。相反地，脂筏破壞劑methyl-β-cyclodextrin (MCD)則可有效地降低大麻二酚誘發之微膠細胞凋亡和caspase的活化。此外，大麻二酚會誘發lipid raft coalescence，增加GM1 ganglioside 和caveolin-1表現，這些作用也可被MCD所回復。上述結果說明大麻二酚會經由誘發lipid raft coalescence、增加GM1 ganglioside和caveolin-1的表現而導致初代微膠細胞的凋亡。 綜合上述，本研究顯示大麻二酚分別經由thiol流失及脂筏相關之機制，誘發初代脾臟細胞及微膠細胞之凋亡，本研究首度證實大麻二酚會誘發不同之初代免疫細胞凋亡，拓展了大麻二酚促凋亡作用之範疇，並且對大麻二酚誘發免疫細胞凋亡之機制提供了新的見解，誘發免疫細胞之凋亡可能是大麻二酚免疫調節及抗發炎作用之一個重要機制。
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一般商業化之家禽流行性感冒病毒之疫苗對於不同HA亞型之家禽流行性感冒病毒感染無交叉保護力。因此，本實驗以發展具交叉保護之疫苗為目的，利用複製缺陷腺病毒 (replication deficient adenovirus) 作為載體，建構帶有不同亞型間保守度高之M2基因片段的重組腺病毒 (Ad/M2)，再將Ad/M2免疫雞隻。Ad/M2感染之293A細胞及轉導之Vero細胞以間接螢光免疫分析皆有陽性訊號產生。在Ad/M2免疫雞隻的實驗結果顯示，補強後2週CD4+及CD8+ T cell相較於初次免疫有顯著增加；抗M2特異性抗體則於初次免疫後2週有顯著增加，但補強後的抗體上升效果則不明顯。於攻毒後第4天及第7天採集的喉頭拭子之real time RT-PCR結果顯示免疫組與對照組之間的AIV含量沒有差異，而攻毒後免疫組與對照組死亡率分別為40%及33.3%，給予Ad/M2之組別並無法對抗AIV感染。
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癲癇，為一種可能發生在任何年齡且分布在世界各地之慢性神經疾病。現有治療癲癇策略包括抗癲癇藥、切除性手術和迷走神經電刺激法；儘管如此，仍有約三分之一的病患無法藉由這些方式得到良好的癲癇發作控制。此類難以控制之癲癇型態，又稱為頑性癲癇（refractory epilepsy）。近年來，學者提出，視丘前核之腦深層電刺激術（deep brain stimulation of anterior thalamic nucleus, ATN DBS）為治療頑性癲癇的可能方法。DBS有四個可調整參數，分別是刺激目標、刺激強度、刺激頻率與刺激時機。目前經過數國許可為癲癇治療的刺激目標，只有ATN。在刺激條件中，現有文獻已指出高頻率、高強度的雙側電刺激有較佳治療效果。但治療癲癇之最佳刺激條件尚未有定論。 刺激時機依照刺激方式，又可分為連續式或間斷式之開放性刺激（open-looped）與閉鎖式刺激（closed-looped stimulation）。閉鎖式刺激係指根據大腦發出的訊號線索，只在癲癇快要發作前才給予電刺激的方法。為了找出治療頑性癲癇之適當閉鎖式刺激條件，我們利用pilocarpine這種化合物誘發大鼠癲癇。Pilocarpine誘發之癲癇發作能模擬人顳葉型癲癇，又具有可預期發作時間之優點，適合用於閉鎖式電刺激參數之研究。 本研究以腦波作為判斷癲癇發作之主要依據，並搭配行為影像紀錄。實驗第一天先手術植入腦波圖記錄電極，並將電刺激電極植入左側視丘前核，將其固定在大鼠頭部，到第八天時以腹腔注射方式給予大鼠280-290 mg/kg pilocarpine以誘發癲癇發作。刺激流程為，在給藥前不同的時間點，開始連續ATN DBS，且電刺激設定條件為每個脈衝時間90 μs、強度50 μA，刺激頻率200 Hz。結果發現，給藥前60分鐘開始連續給予大鼠單側ATN DBS能成功抑制癲癇發作活性。抑制效果包括閾值增加，腦波和行為上發作時間延遲，而且發展為癲癇重積（status epilepticus）的大鼠數目減少。在腦組織切片中，僅有不等程度之植入傷害引起的發炎反應。總括上述，本研究顯示長時間高頻率、低電流之單側ATN DBS也能具有癲癇抑制效果，此刺激條件對於神經組織僅具輕微傷害性。
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犬乳腺腫瘤（Canine mammary gland tumors, cMGTs）是雌犬最常發生之腫瘤，其惡性機率從26 %至73 %；目前年齡及卵巢荷爾蒙被認為扮演重要的角色。犬乳腺腫瘤大多延誤治療時機；早期發現且接受正確治療，可避免腫瘤之擴散或轉移。在腫瘤發展進程中，有許多的生物因子可成為惡性腫瘤的生物標記 (Biomarker)，因此，針對可能具有潛在的相關生物標記進行研究，以探討是否可以成為生物標記，有其必要性。 本實驗針對176例犬乳腺腫瘤病例作分析，依照WHO犬乳腺腫瘤分類系統與臨床系統分級，配合P63、KLF2、KLF4、KLF5及KLF6等新興蛋白質的表現，結果與Ki-67蛋白質的表現、組織病理學分級及臨床上預後做比較。 初步研究結果發現組織病理學下分類與預後有顯著差異 (P < 0.0001) ，說明正確分類可以達到預測預後之效果。但有時亦混淆的情況下，需要輔助性診斷工具，較常使用的為評估細胞增生因子的Ki-67可以成為區分乳腺腫瘤之良惡性輔助工具；與預後比較，認為大於40 %的Ki-67表現量可以預測其預後較差。Ki-67亦與臨床上分級、組織病理學分類、腫瘤分化與預後皆有顯著相關性。KLF4、KLF5及KLF6在細胞核的表現與惡性腫瘤有相關性，推論這些新興抗體在腫瘤演進過程中，扮演重要角色。將Ki-67與KLF2、KLF4、KLF5及KLF6在細胞核表現情形比較結果皆有非常顯著之相關性 (P < 0.0001)。
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幾年來的教學經驗讓作者體會到教育的重要以及教師對學生的影響力，尤其是年幼的學生。動物在兒童的成長過程中扮演重要的角色。近年來動物保護意識提高，人民逐漸體認到動物為生命個體，非只是商品或物品。新時代興起的跨領域學門，致力於研究動物及人類之間的各種關係。提倡動物福利及權利必須從人民的同理心開始教育起，人們若能夠設身處地替動物著想，就能夠體會尊重他們的生命。法律或規範能夠消極地防範動物虐待，但唯有教育能夠從根本出發，啟發人們用「心」關懷生命。 本研究分為兩大主題:第一個主題在探討一堂長度為一小時的人道教育的實施情形及成效。本堂課的主題為「用同理心對待動物」，對象為107位來自台北市公私立小學的六年級學生。學生於課前及課後作答的問卷結果在本研究中探討並分析。第二個主題的對象為97位台北市某私立國小老師，旨在調查現任小學教師的動物同理心程度，並且藉由問卷調查，了解老師們對人道教育的態度及看法，從現行小學教育中，人道教育的實施現況、可預見的阻礙及困難，去探討今後及未來的發展方向。
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犬傳染性花柳性腫瘤(Canine transmissible venereal tumor, CTVT)是一個可在犬隻間藉由黏膜接觸而傳播的腫瘤；當CTVT細胞在實驗室被接種至健康犬隻身上後，會呈現一個自然生長期，但隨著時間發展又自行消退，因此這種腫瘤的發展模式就成為研究「腫瘤與宿主間免疫反應」的一種良好的實驗性腫瘤模式。但在過去的研究中我們發現，CTVT細胞無法再被接種至已經接種過CTVT且痊癒的犬隻身上，因此本研究擬藉由比較「未接種過CTVT犬隻」及「接種過CTVT犬隻」的周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，在經過與CTVT腫瘤細胞共同培養後的反應，來探討可能的免疫機制。在本研究中，我們首先將此兩種來源的PBMCs先進行淋巴細胞表現型的偵測，結果顯示無論CD3, CD4, CD8, CD21的表現量都無顯著差異。接著再將兩種犬隻來源的PBMCs分別與P期的CTVT細胞共同培養後，進行PBMCs增生試驗、IFN-γ分泌試驗、細胞毒殺試驗及數種細胞素如發炎前驅(Proinflammatory)細胞素(TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β)、第一類助手(Th1)細胞素(IL-2, IFN-γ)、第二類助手(Th2)細胞素(IL-4,IL-10)與細胞毒殺(Cytotoxic)蛋白(Granzyme B, Perforin)的mRNA表現量偵測等；結果發現兩種犬隻來源的PBMCs經與CTVT細胞共同培養後，除了IL-1β及IL-6兩種細胞素的基因在未接種過CTVT犬隻中的表現量較高外(p<0.05)，其它細胞素表現量及細胞學試驗，均無顯著差異。目前已知IL-1β與IL-6不僅是炎症反應的前驅分泌細胞素，在腫瘤發展過程中也是導致腫瘤發生的前驅因子，具有促腫瘤細胞增生、存活的功能，甚至可導致腫瘤血管增生及轉移；因此我們推測接種過CTVT犬隻的PBMCs再次遇到CTVT細胞時，可能因無法製造足夠量的IL-1β及IL-6，故不利CTVT的生長，但是後續仍需要更深入的研究來證實。
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犬乳腺腫瘤(canine mammary gland tumor, cMGT) 是母犬最常發生的腫瘤疾病，而且有高達百分之五十的比例為惡性腫瘤。而且惡性腫瘤的患犬經過手術切除治療後能夠存活超過兩年時間的比例也不及百分之五十。而在現在的醫學技術上，仍然沒有對於惡性的乳腺腫瘤更好的治療方法，所以在本研究中針對可能造成惡性乳腺腫瘤的Kruppel-like factor 4 (KLF4)進行在MGT細胞中的研究，以確定此蛋白質與腫瘤惡性程度相關，以期望以後可以利用此蛋白質進行更深入的研究。在本研究中想要研究的蛋白質KLF4是屬於轉錄因子KLF家族的一員，最早在1996年被發現於腸道跟上皮具有豐富的表現，之後更被發現與細胞的生理功能: 增生、分化、移行或是凋亡有關。而在其中，KLF4在細胞分化的研究上，更被發現可以將已分化成熟的細胞而去分化為具多功能性分化的幹細胞。在本實驗中，我們利用比對大小鼠與人類的已知Klf4序列而設計引子對，而成功地解開844 bp的核酸序列，並且利用這段序列設計專ㄧ的引子對而使用於偵測不同細胞中的Klf4表現，我們發現了MGT細胞跟MDCK細胞都會表現Klf4。另一方面，我們利用了KLF4專ㄧ抗體在正常犬組織切片上進行KLF4的蛋白質標定，發現在犬的腸道跟皮膚上皮也確有較為豐富的表現。之後我們利用Kenpaullone (Ken)進行KLF4的抑制，發現給予Ken八小時後可以成功達到Klf4基因的抑制而在24小時後可以達到蛋白質的抑制。而在KLF4表現量被抑制後，MGT細胞所表現出來的腫瘤惡性程度像是細胞的增生、移行、與群落形成能力相對地下降並且觀察到有細胞週期休止的現象，而這些結果經過計算後也都具有統計上的意義。顯示KLF4對於MGT細胞具有提高腫瘤惡性化的功能。
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乳汁內包含許多豐富的蛋白質及維生素，對人類及動物是一個很重要的營養來源，但同時也提供一個很好的環境供微生物生長，尤其是細菌性病原。在人類的食物媒介性人畜共通傳染性細菌性疾病中，主要是由沙門氏桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌及大腸桿菌O157:H7所引起。藉由乳汁傳播引起疾病的病原也包含了牛型分枝桿菌及副結核分枝桿菌，且未經巴斯德滅菌的乳汁是一個重要的傳播媒介。由於巴斯德滅菌法無法將細菌所產生的毒素完全消滅，故市售鮮乳有其一定的風險性存在。鑒於上述，本研究目的主要為建立分子生物學的檢測方法，評估藉乳傳播細菌性疾病之病原菌及其毒素經由生乳及熟乳傳播的風險性。針對Mycobacterium spp.、Mycobacterium bovis、Mycobacterium paratuberculosis、Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium、Listeria monocytogenes、Campylobacter jejuni、Staphylococcus aureus及Escherichia coli O157的細菌或其毒素基因序列，依序包含HSP65、TbD1、IS900、InvA、PlcA、MapA、Nuc及Stx，設計特異性引子對及建立其聚合酶鏈鎖反應檢測是否有上述細菌存在乳汁中之風險。樣本的收集包含從2個牧場收集到12個皮內結核菌素陽性反應乳牛的乳汁樣本(群組I)、以及自5個牧場收集到461個皮內結核菌素陰性反應乳牛及山羊的乳汁樣本(群組II)。另外，也自5個廠牌共收集80個市售商品化的鮮乳樣本 (群組III)。檢測結果發現，所有群組中主要的檢出細菌族群為分枝桿菌群及金黃色葡萄球菌，HSP65在各群組的陽性率為66.8%、14.1、及40.0%； ITT陽性牛隻生乳樣本的HSP65檢出率顯著高於其他群組，且市售鮮乳樣本的檢出率亦顯著高於ITT陰性牛隻的生乳樣本；另外，Nuc基因的陽性率在各群組為50.0%、16.5%及13.8%，且ITT陽性牛隻生乳樣本檢出率顯著高於ITT陰性牛隻生乳樣本及市售鮮乳樣本。除上述兩個主要細菌族群外，M. bovis可在一頭ITT陽性牛隻生乳樣本中檢測到，且S. Typhimurium則在一頭ITT陰性牛隻生乳樣本中被檢測到。由於HSP65及Nuc基因可在生乳及市售鮮乳中檢出，顯示乳汁受到細菌及(或)其毒素汙染的風險的確是存在的；然而活菌的存在與否仍需藉由傳統的細菌培養的方法以驗證之。實驗結果顯示M. bovis可在生乳樣本中檢測到，牧場工作者須重視初乳滅菌的重要性，以降低細菌藉由生乳傳播給小牛的風險性。本實驗可藉由分子生物學方法檢測到市售鮮乳樣本中有細菌核酸的存在，進一步推論現行的巴斯德滅菌法可能有滅菌不全的風險存在或在操作過程中有人為疏失；因此政府及企業應重視此問題並予以檢討並加強管理以確保消費者的安全。
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鮑氏不動桿菌 (Acinetobacter baumannii) 是一種分布廣泛的伺機性革蘭氏陰性菌，為人體皮膚上的常在菌叢（normal flora），目前也已在多種動物及相關的產品發現其存在。近年來，多重抗藥性鮑氏不動桿菌 (multidrug- resistant A. baumannii，MDRAB) 隨著抗菌劑的廣泛使用而出現，目前已成為醫療照護相關感染（healthcare associated infections，HAIs）中，難以控制細菌之一。由於MDRAB的出現，以及在藥理學上的重新認識，colistin再次的被用於臨床醫療，但抗藥性菌株也漸漸的開始出現。本研究自2010年9月至2011年3月間，自台灣北、中、南三區的傳統市場和超級市場進行檢體的逢機採樣，共216件。並以改良式Leeds Acinetobacter Medium（MLAM）培養基及馬康奇培養基進行初步分離。再以聚合酶鏈鎖反應增幅16S-23S核糖核酸基因內轉錄區，並搭配序列分析進行比對鑑定。結果共分離28/216（13％）株鮑氏不動桿菌，而傳統市場及超級市場的分離率分別為27/108（25%）及1/108（1％），北、中、南三區的分離率分別為6/36（17％）、10/36（28％）及12/36（33％），以及自台北地區醫院收集72株非重複之鮑氏不動桿菌。本研究亦進行抗菌劑感受性試驗及利用脈衝式電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）調查兩來源菌株的抗藥性及親緣性。由結果得知，市售雞肉來源的菌株對cefazolin外藥品都保持一定的感受性（0∼36％），而人類臨床菌株則有較高的抗藥性（72∼100％），僅對colistin（7％）與ampicillin/sulbactam（10％）保持較佳的感受性。親緣性分析的結果發現，市售雞肉與人類臨床來源的菌株並不共有相同的基因型，故兩來源間應鮮少發生菌株及抗藥性的交流。本研究另外以蛋白質體學方法比較鮑氏不動桿菌標準菌株ATCC 19003及人工誘導抗colistin菌株19003 CR間蛋白質體的差異，結果發現誘導colistin的抗藥性產生，並不會造成菌株基因型別上的變化。藉由二維蛋白質電泳與質譜儀鑑定差異性蛋白質的身分，並以即時定量聚合酶鏈鎖反應（real-time PCR，qPCR）測定這些蛋白質的表現量，結果發現外膜蛋白Omp38在標準菌株有較高的表現量；sensor protein QseC、kdsA蛋白和aacD蛋白則是在抗colistin菌株有較高的表現量，推測colistin抗藥性的產生與細胞膜的合成相關，並受到二元訊號轉導系統調控，但還需更進一步研究其發生的機制。
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