臺灣大學獸醫學研究所學位論文
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泌尿道病原性大腸桿菌為犬隻泌尿道感染最常見的病原之一，當其演變為持續性泌尿道感染時，將增加治療的困難度。為了能在泌尿道成功入侵與定殖，大腸桿菌會攜帶許多毒力因子與致病島嶼。本研究目的為：調查持續性與非持續性泌尿道感染大腸桿菌分離株，其所攜帶的毒力因子、致病島嶼與親緣族群分佈，以及抗藥性的表現，是否有差異。 本實驗由2010年7月到2011年11月，自臺灣大學附屬動物醫院收集36個犬隻大腸桿菌泌尿道感染病例，其中14個為持續性泌尿道感染病例。持續性泌尿道感染多發生在已結紮的母犬，而非持續性泌尿道感染則多發生在未結紮的公犬。絕大多數的泌尿道感染病患有其他潛在的病因，而持續性泌尿道感染的潛在病因多為不容易治癒的疾病，如：後肢癱瘓與膀胱腫瘤。而非持續性泌尿道感染病畜，則較多為可使用外科手術治癒之疾病，如泌尿道結石與赫尼亞。持續性泌尿道感染的分離株，攜帶P型纖毛、S型纖毛與α溶血素的比率，低於非持續性泌尿道感染。其致病島嶼Ⅱ的攜帶率亦較低。在抗藥性表現中，持續性與非持續性泌尿道感染的分離株，其抗藥性比率並沒有顯著的差異。 綜合以上實驗結果，可以發現於持續性泌尿道感染所分離之大腸桿菌，其致病性較低。此情況可能源自持續性泌尿道感染病患多有未治癒的潛在疾病，使致病性較弱的大腸桿菌，有機會造成持續的感染。另一個可能原因為，感染成立後，許多毒力因子並非大腸桿菌生存所必須，而經由致病島嶼或質體的刪除機制移除。此外，抗藥性的提升，並非造成持續性泌尿道感染治療無效的原因。是否能成功的治癒或良好的控制潛在的病因，更是持續性泌尿道感染治療的關鍵。
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本研究的目的是以小鼠模式評估PCV2 DNA疫苗的免疫原性。有學者研究指出以原始的PCV2 ORF2轉譯出來的核衣蛋白(Cap)其轉形量低，且不論是在原核或真核系統都不易偵測到PCV2核衣蛋白的表現量。文獻指出刪除核衣蛋白的核定位訊號(nuclear localization signal；NLS)區域，能使修飾過的核衣蛋白具有較高的表現量。因此，本研究將依此建構PCV2核衣構築，分別建構含有人類細胞巨大病毒啟動子之真核表現載體(pcDNA3.1/V5-His-TOPO)，以及含有T7 RNA聚合酶啟動子之大腸桿菌表現載體(pET 21)，而構築出重組表現質體，並藉由西方墨點法來確認細胞內蛋白的表現且進一步評估在小鼠模式的的免疫原性。共設計四組不同的DNA構築，分別為(1)PCV2a亞型原始cap gene(pcDNA-2a)；(2)PCV2b亞型原始cap gene(pcDNA-2b)；(3)PCV2a 亞型修飾過的cap gene(pcDNA-Δ2a)；(4)PCV2b 亞型修飾過的 cap gene(pcDNA-Δ2b)。將上述四組構築載入真核表現系統之載體(pcDNA3.1/V5-His TOPO)內，作為DNA疫苗使用，再將此四組疫苗以100 μg/次肌肉注射的方式免疫小鼠四次，每次間隔兩週，藉以評估其誘發之免疫反應，於實驗期間收集小鼠之血清作為PCV2 特異性抗體檢測之用，並於小鼠犧牲時收集其脾臟細胞作為淋巴細胞增殖反應檢測之用。結果顯示以大腸桿菌表現蛋白誘導之蛋白質電泳，經 Coomassie blue 染色可見以0.1和 0.5 mM IPTG誘導之pET-Δ2a和 pET-Δ2b 有明顯之蛋白質表現，目標產物分別為24 kDa 及22 kDa。而在西方墨點法僅有 pET-Δ2a有微量之蛋白質表現；而以間接螢光免疫分析上述四組構築真核表現載體轉染至PK-15 細胞質內皆有陽性的綠色顆粒樣螢光訊號，經Coomassie blue染色和西方墨點法分析可見四組載體皆呈現微量之蛋白質表現。而經DNA接種四次之小鼠，MTS assay呈現微弱之淋巴球增殖反應，且各組間並無顯著差異(p>0.05)，而以流式細胞儀分析各組間雖無顯著差異(p>0.05)，但各組內之陽性對照組(Concanavalin A)與病毒刺激組和未處理組有顯著差異(p<0.05)。以商用ELISA套組檢測各組小鼠血清中IgG抗體均為陰性，將注射構築之四組DNA疫苗以間接螢光免疫分析(IIFA)，在螢光顯微鏡下觀察到各組小鼠血清IgG抗體亦皆為陰性。顯示雖然在各構築有可見之蛋白表現，唯在活體測試的小鼠模式，並未激發特異之免疫反應。
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氧化鐵奈米粒子普遍應用於中樞核磁共振成像的對比劑。微膠細胞為中樞神經系統中主要的免疫細胞，具有監督外來抗原入侵及引起適當炎症反應以消滅外來病原之功能。本研究的主旨在於探討當中樞感染與小鼠初代微膠細胞大量活化下，氧化鐵奈米粒子對其免疫功能是否造成影響。實驗結果顯示氧化鐵奈米粒子濃度低於每毫升100 微克的鐵（100 μg of Fe/mL）時，對小鼠微膠細胞並無細胞毒性，微膠細胞會快速將氧化鐵奈米粒子吞入細胞內，同時抑制微膠細胞的活化、吞噬能力、interleukin-1β (IL-1β)的分泌與IL-1β converting enzyme (ICE) 的活性，但tumor necrosis factor-α (TNF-α) 與TNF-α converting enzyme (TACE) 卻不受影響。此外，被攝入的氧化鐵奈米粒子會進入微膠細胞內的溶體，同時造成溶體鹼化與膜通透性上升，並抑制溶體分解蛋白質的能力及cathepsin B酵素的活性。進一步探討氧化鐵奈米粒子抑制免疫功能與溶體受損間的關係，顯示氧化鐵奈米粒子抑制cathepsin B的活性而減少ICE活性與IL-1β的分泌。綜合上述，本研究結果指出氧化鐵奈米粒子會抑制微膠細胞防禦性免疫功能，且傷害溶體正常功能，顯示氧化鐵奈米粒子抑制微膠細胞對抗病原感染能力。
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鴿子環狀病毒 (Pigeon circovirus, PiCV) 為在年輕鴿群中一新浮現性之疾病，並且被認為是幼鴿症候群 (Young pigeon disease syndrome)的重要因素之一。而環狀病毒在燕雀目鳥類 (order Passeriformes) 如金絲雀及其他雀科鳥類等所扮演的角色鮮少有報告，目前在台灣燕雀目鳥類為相當常見之鳥種，但並無相關環狀病毒盛行率之報告。此篇研究主要是調查台灣地區鴿子及燕雀目鳥類環狀病毒的盛行率及其親緣性分析，PiCV檢測部分自2009-2011年共蒐集台灣北部及中部共56個鴿舍736隻賽鴿及57隻種鴿之共泄腔拭子與全台391隻野鴿之糞便拭子，鴿舍之陽性率為 94.6 % (53/56)，賽鴿及種鴿之檢測陽性率分別為 68.5 % (504/736) 及38.6 % (22/57)，且PiCV陽性率與賽鴿具臨床症狀如下痢、食慾不振、體重下降或飛行表現不佳等呈極顯著之差異(p<0.01)；而野鴿之檢測陽性率為31%，且各地區之陽性率差異不大。將部分核酸產物經定序後，與基因庫 (GenBank) 中不同國家之PiCV序列比對，ORF V1之核酸序列及胺基酸序列比對結果相似度為94.3-99.6%及87.1-100 %，而另一個ORF C1與基因庫之比對結果相似度分別為74.2-99.2 %及73.2-99.8 %，且此台灣分離株與比利時株較接近，顯示台灣地區之鴿子可能由國外引進不顯性感染PiCV之健康鴿，並造成大規模之病毒傳播。另利用原位雜交法可見病毒核酸標記在肝、腎及肺的細胞質中。而在寵物鳥店之鳥類自2010-2011年共蒐集18場310隻鳥類之糞便拭子，寵物鳥店之環狀病毒陽性率為 88.9 % (16/18)，而其環狀病毒盛行率為54.8 % (170/310)，以燕雀目鳥類之綠繡眼陽性率最高為 91.9 % (102/111)。將ORF V1之部分核酸產物經定序後，與基因庫 (GenBank) 之不同鳥種之序列比對，其核酸序列相似性百分比為61.2-100 %，依其演化的距離及相異度可區分為4個分支，分別與Psittacine beak and feather disease virus (PBFDV), PiCV, Finch circovirus (FiCV) 及 Raven circovirus (RaCV) 較接近；將與PiCV分支相近之ORF C1與和GenBank中不同國家之鴿子環狀病毒分離株核酸序列及胺基酸序列相比，可得相似性百分比為77.2-99.6 %及76.4-100 %，顯示燕雀目鳥類可被跨鳥種之環狀病毒感染的可能性。由此研究可得知，環狀病毒藉由糞便水平傳播在台灣的鴿子及常見的燕雀目鳥類之間有高的盛行率，且由核酸序列、胺基酸序列及親緣性分析可得其病毒來源相當複雜。
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丙烯醯胺 (Acrylamide；ACR) 為一具有神經毒性、基因毒性、繁殖毒性與致癌性的工業用化合物，廣泛運用於過濾飲水與蛋白質分析。由於胺基酸會與碳水化合物在高溫 (120－180oC) 下藉由梅納反應 (Maillard reaction) 生成副產物ACR，特別是富含天門冬胺酸與還原糖的日常食品中所產生的ACR更是一般飲水限制量的數百倍，此發現引發食品安全的疑慮。 在人類流行病學上以及實驗動物的證據皆能證實ACR能影響神經元並造成神經毒性，但對於膠細胞的研究卻十分局限。星狀膠質細胞成為近年來神經毒性研究的焦點，其在大腦的角色不再是被動、簡單的物理性支持，而是能影響神經生長、神經電位傳導以及控制整個大腦微環境 (micro-environment) 等等的重要細胞。Chen等 [2009, 2010]研究發現，ACR使人類膠胚母細胞株U-1240 MG的增生率受抑制、細胞存活率降低，造成基因毒性，進而影響DNA 傷害反應路徑相關蛋白如ATM/ATR、p53、p21、p27、Cdk2及cyclinD1，並使細胞週期停滯在G0/G1期，但ACR對不同細胞株 (U-1240 MG、U-87 MG與U-251 MG) 引發的效果不同，本研究因此探討上述細胞株與大鼠初代星狀膠質細胞經ACR暴露後之細胞毒理與凋亡反應之異同。 MTT assay結果顯示，四株細胞經1 mM ACR處理48及72小時與2 mM ACR處理 24至72小時，細胞存活率均顯著下降，但0.1 及0.5 mM低濃度僅對U-87 MG及初代星狀膠質細胞具有顯著影響。LDH leakage assay顯示，U-1240 MG與U-251 MG至72小時皆無顯著變化，但U-87 MG及初代星狀膠質細胞在2 mM ACR暴露48及72小時下顯著上升。流式細胞儀分析顯示，ACR引發所有細胞株與初代星狀膠質細胞之sub-G1期增加，且JC-1染色粒線體膜電位亦有明顯變化，意即具細胞凋亡反應。進一步利用西方墨點法偵測DNA傷害反應路徑 (如p53與pp53) 及細胞凋亡途徑相關蛋白分子 (如Bcl-2、Bax、pro-caspase 8、9與3)，U-1240 MG及U-251 MG細胞經2 mM ACR暴露48小時後，Bcl-2蛋白表現量顯著增加，而在U-87 MG及初代星狀膠質細胞中則顯著減少；初代星狀膠質細胞暴露不同ACR濃度，Bcl-2表現量也不同，其在低濃度組 (0.1及0.5 mM) 顯著增加，在高濃度組 (1及2 mM) 則顯著減少。Bax與pro-caspase 8、9及3蛋白表現量在不同細胞以及不同濃度皆無顯著差異，Bax蛋白為上升而pro-caspase 8、9及3蛋白皆為下降。而在DNA傷害反應路徑中，2 mM ACR 48小時的暴露也造成p53及pp53蛋白的增加，利用caffeine抑制劑共同處理抑制掉ATM/ATR後也可得到效果回復的結果。由於ACR引發U-87 MG之MTT、LDH、sub-G1 arrest、p53、pp53與Bcl-2蛋白表現等與初代星狀膠質細胞較相似，因此在考量動物犧牲與初代細胞的培養時間及相關技術要求前提下，建議以此細胞株取代星狀膠質細胞從事ACR之毒性機制研究。
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家禽白血病病毒（avian leukosis virus, ALV）為雞隻感染引起腫瘤性疾病之病原，在現場因使雞隻產能下降或淘汰增加造成經濟損失。目前市面上家禽白血病A亞群（subgroup A avian leukosis virus, ALV-A）使用全病毒塗鍍作為血清抗體之檢測方式，易因其他亞群抗體而造成檢測之敏感性與特異性不佳。本研究之目的為利用桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統進行ALV-A之表面醣蛋白gp85真核表現，並評估此真核表現重組蛋白質應用於免疫酵素連結吸附法之發展潛力。以台灣分離株TW-3577做為表現模板進行gp85基因之表現，建構帶有全段gp85基因的rgp85-baculovirus和全段gp85基因與前導序列之rgp85sp-baculovirus重組桿狀病毒進行Sf9昆蟲細胞之感染。收取重組桿狀病毒感染後之昆蟲細胞，進行西方墨點法分析可偵測到符合預期大小約75 kDa位置之重組gp85蛋白。重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞使用間接型免疫螢光染色法也同樣可偵測到重組gp85蛋白之表現。感染72小時之昆蟲細胞cell pellet經lysis後直接做為塗鍍抗原，與標準陽性和陰性血清進行ELISA初測試，確認ALV-A抗血清可造成ELISA讀值之明顯上升，SPF雞隻血清則否。最佳化之ELISA條件使用72個田間樣本血清進行測試，以血清中和試驗做為抗體檢測金標準，得到ELISA之敏感性為80％，特異性為83.3％。利用桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統進行之ALV-A gp85蛋白表現，由於重組蛋白無法純化，ELISA之敏感性和特異性略顯不佳，若能成功進行大量蛋白質表現與純化，將可能增加其發展潛力。
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微小核醣核酸（microRNAs, miRNAs）是一種長約18-25個核苷酸的小分子非編碼核醣核酸（non-coding RNA），廣泛存在於真核生物中。miRNA的表現具有細胞或組織特異性，能針對特定的基因群進行轉錄後抑制作用，進而調控細胞生長發育、分化以及凋亡。近年來，多方證據顯示，miRNA的異常表現和腫瘤的發生、生長和轉移息息相關。因此，發展以miRNA為基礎的生物標誌分子作為腫瘤疾病的診斷依據、預後指標，或是治療的標的已經漸成研究趨勢。犬傳染性花柳病 （canine transmissible venereal tumor, CTVT）是一種在犬間自然發生的傳染性腫瘤疾病。以實驗室方法接種CTVT細胞或組織團塊於犬隻，建立CTVT生長週期，能夠隨時間進行觀察到發展期（progressive phase）、穩定期（stable phase）、消退期（regressive phase） 等三個顯著不同的腫瘤時期。其中，CTVT獨特的自發性消退現象，正好可以提供一套由生長發展到死亡的完整腫瘤模式以作研究用途。我們計畫以CTVT作為研究miRNA的基礎，探討參與在腫瘤發生及腫瘤抑制的相關機制。在本研究中，我們以次世代定序技術（next generation sequencing, NGS）揭示了在CTVT不同生長時期所表現的特異miRNA族群，進而挑選出顯著表現於腫瘤消退期的miRNA序列，並以即時定量聚合酶鏈鎖反應（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）技術在不同個體來源樣品進行生物性重複測試，找到可能參與腫瘤自發性消退現象的miRNA，並配合CTVT轉錄體核酸探針微陣列（transcriptome microarray）及miRNA目標預測軟體，進一步找出潛在的下游調控路徑。我們期待藉由了解miRNA在腫瘤消退中所扮演的角色，在未來找到有效對抗腫瘤的方法。
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中文摘要 於台灣所分離到的家禽傳染性支氣管炎病毒毒株當中也有數個毒株經過神經胺酸酶的處理後會表現出血球凝集 (Hemagglutination, HA)的特性。其中一台灣一型家禽傳染性支氣管炎病毒2575-5在經過神經胺酸酶處理過後會表現出血球凝集的特性，但該毒株之減毒株在神經胺酸酶處理後則不會表現出血球凝集的特性，為瞭解此血球凝集特性之改變，本實驗將減毒株之S1蛋白基因進行選殖，另將2575-5的S1蛋白基因進行點突變，並將此點突變與選殖之產物放入pFastBacHT A質體中，接著利用同源重組將在pFastBacHT A內的S1醣蛋白轉移至bacmid上並轉染Sf-9細胞產生重組之桿狀病毒，以桿狀病毒蛋白表現系統進行表現蛋白，經過繼代三代後以蔗糖梯度離心純化重組之病毒之後進行血球凝集與血球吸附試驗，經由此實驗可以表現出所欲研究之S1蛋白並且將兩者進行比較來了解該蛋白上之特定胺基酸改變是否與其血液凝集特性改變有關，且可瞭解所表現之蛋白是否與傳染性支氣管炎之S1蛋白有相同之生物特性。
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中文摘要 貓冠狀病毒 (Feline coronavirus, FCoV) 廣泛存在於家貓及野生貓科動物，感 染雖大多僅出現輕微下痢或無臨床症狀，然有部分會發展為致死性之貓傳染性腹 膜炎 (Feline infectious peritonitis, FIP)。依血清型 FCoV 可被區分為第一與第二型， 兩型 FCoV 之感染皆可能發展成 FIP。為尋找有效抗病毒藥物與 FIP 致病機制探討 之需，本實驗自 2010 年至 2012 年間收集了 11 隻臨床上證實為 FIP 發病貓之新鮮 胸水及腹水，取其內之細胞與貓全胚胎細胞共同培養方式，其中一隻 10 月齡母貓 之腹水於繼代至第五代時，出現冠狀病毒感染所引起特異性細胞病變效應之多核 巨細胞，以抗 FCoV N protein 抗體對感染細胞進行免液螢光染色，結果可在多核 巨細胞質內發現強烈螢光訊號。此病毒經三次純化後，經核酸檢測確定為第二型 FCoV 並命名為 NTU204。以 Simplot 與 Bootscan 兩軟體分析 NTU204 之演化由來， 發現此病毒可能於基因體 13350nt 與 24800 nt 附近，透過第一型 FCoV 與犬或豬之 冠狀病毒經兩次重組而來，重組區域分別位於 RdRp 與 S 基因上。由於世界各地 FCoV 之感染，大多以第一型為主，相較於第二型此型病毒不易適應體外細胞培養 系統，因此分離工作相對困難。為提升第一型 FCoV 分離機率，本研究利用真核 表現載體將已被證實具提升 FCoV 感染能力之輔受器 fDC-SIGN 轉染至貓腎細胞， 將第二型 FCoV 病毒接種於此細胞時，發現在 1MOI 下表現 fDC-SIGN 之細胞確 實出現較高的病毒力價。證實此輔受器確實具提升病毒複製效應後，利用此細胞 嘗試進行第一型病毒之分離，則未能順利分離出來。
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貓傳染性腹膜炎 (Feline infectious peritonitis, FIP) 為貓冠狀病毒 (Feline coronavirus, FCoV) 所引起之一免疫媒介高度致死性疾病，目前尚無有效之疫苗及治療方法。本研究利用以severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) 及FCoV之棘蛋白(spike protein, S) heptad repeat 2 (HR2) 序列為基礎所合成之胜肽，藉由抑制FCoV感染之融合效應，測試其抑制病毒複製之效力。結果顯示在20 μM濃度下，SARS-CoV HR胜肽具33% 至55% 之抑制病毒效力，而FCoV-HR 胜肽之抑制病毒效力則可達到72% 至97%。此結果表示相較於SARS-CoV HR 胜肽，FCoV HR 胜肽對於FCoV之抑制更具特異性。進一步探討HR 胜肽與其他已知具抗FCoV複製藥物之加乘作用 (Synergistic antiviral effect)，將SARS-CoV HR胜肽與nelfinavir、Galanthus nivalis agglutinin (GNA) 合併未出現加乘作用，而與人源Interferon-α (IFN-α) 合併，則發現以20 μM FCoV HR胜肽與不同濃度之IFN-α合併後皆出現加乘抗病毒效應。探討此FCoV HR胜肽之抑制機制發現其主要是藉由干擾病毒與標的細胞之融合，進而抑制病毒之複製。總結本實驗之結果，FCoV HR 胜肽為一具有潛力可應用於FIP臨床預防及治療之藥物。
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