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抗口蹄疫病毒結構蛋白VP1單源抗體應用於酵素連結免疫吸附試驗

口蹄疫疫苗免疫後，主要是透過血清中和試驗 (serum neutralization test, SN test) 來了解免疫動物獲得中和抗體保護力的情形，但SN test必須使用口蹄疫的活病毒，因而衍生許多的不便及限制。本實驗室使用口蹄疫病毒O/TW/97所製備的單源抗體Q10E-3，已被證明能夠精準辨認口蹄疫病毒涵蓋RGD的中和抗原決定位Site 1序列；利用此單源抗體為tracer Ab，搭配原核系統所表現的口蹄疫重組結構蛋白VP1，建構一個重組結構蛋白VP1阻斷型酵素連結免疫吸附試驗 (recombinant VP1 blocking enzyme-linked immunosorbent assays, rVP1- bELISA)，來檢測免疫動物體內的抗體，並以SN test作為黃金標準 (gold standard)。試驗樣本包含不同物種及不同SN力價的血清，分別為豬血清674個、牛血清100個及羊血清100個。結果顯示，以樣本PI值 (percentage inhibition value) 與SN力價所繪製的標準曲線圖，可看出兩個試驗在三種種別動物樣品皆有極顯著的相關性 ( p < 0.001)。而試驗血清所得之cut-off值、敏感性及特異性，在豬血清樣本為20%、58.8% (173/294)、92.9% (353/380)，牛血清樣本為10%、66.7% (40/60)、67.5% (27/40)，羊血清樣本則為30%、73.3% (44/60)、67.5% (27/40)。推測同一組SN力價血清樣本經過rVP1-bELISA檢測後PI值的差異，可能是因為血清樣本中含有抗不同中和抗原決定位的抗體，或是血清樣本影響了tracer Ab與rVP1的結合所致。本實驗的結果證明了rVP1-bELISA與SN test的正相關性，或許未來可以嘗試加入口蹄疫病毒的其他結構蛋白，再篩選出抗各個中和抗原決定位的單源抗體去搭配組合作用，以獲得更佳的敏感性及特異性，而更能精準地呈現出SN test的檢測結果。

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Caudal Nucleus Tractus Solitarius (NTS)在針灸改變睡眠所扮演的角色

電針刺激可以有許多治療功用，例如止痛、消炎、治療睡眠障礙。電針刺激改善睡眠的機制目前還不明瞭。在中醫理論裡：安眠穴，是一個可以改善失眠的穴道。之前發現10Hz電針刺激安眠穴可以使孤獨徑核 (nucleus tractus solitaries, NTS) 的乙醯膽鹼性神經活化，造成大鼠在暗期的非快速動眼睡眠(non-rapid eye movement sleep; NREM sleep) 上升。我們假設除了乙醯膽鹼類神經外，內生性嗎啡也可能是影響電針在睡眠的作用。本研究結果顯示，10Hz電刺激安眠穴增加了暗期的非快速動眼睡眠但是不影響快速動眼睡眠 (rapid eye movement sleep; REM sleep)，且這些增加的NREM可以被注射到NTS的naloxone (opioid receptor antagonist) 和naloxonazine (μ-opioid receptor antagonist拮抗) 抑制。而注射natrindole (σ-opioid receptor) 和 nor-binaltrophimine (κ-opioid receptor) 則沒有作用。除此之外β-endorphin的表現量在10Hz電針刺激後於腦幹和海馬迴都有上升且會被注射到NTS的muscarinic antagonist: scopolamine拮抗。我們的結果顯示10Hz電刺激安眠穴增加的非快速動眼可能是藉由乙醯膽鹼活化後使opiodergic 神經分泌β-endorphin增高，作用在μ-opioid receptor。 解剖上，從 NTS 來的神經投射到 parabrachial nuclei (PBN)，再投射到視丘的腹內側神經核 (ventromedial nucleus of the thalamus; VM)；或直接由 NTS 投射到視丘的腹內側神經核。清醒時腦中皮質的神經突觸活性較強，但在睡眠時的神經活動基本上會減少這些突觸的活性。從 NTS 到 PBN 以及 VM 的嗎啡類神經藉由嗎啡類受體過極化了PBN 以及 VM 中的神經。因此我們假設 10 Hz 電針刺激增加 NTS 的突觸活性，造成PBN 以及 VM 的過極化，導致增加睡眠的現象。我們接著研究10 Hz 電針刺激安眠穴後，NTS 和 VM 的突觸密度和長度的改變。我們發現 10 Hz 電針刺激安眠穴後 NTS 和 VM 的突觸密度都有增加，但是突觸總長度只有在 NTS 部位有顯著改變。這實驗結果可能代表了電針刺激會增加興奮性突觸的長度以及密度來增強 NTS 的突觸強度，並且在 VM 增加抑制性突觸的密度來減低 VM 的突觸強度，並藉此達到電針安眠穴增加睡眠的作用。 有報告指出不同頻率的電針刺激可以增加不同種的內源性嗎啡，且作用在不同的類嗎啡受體上。因此我們接著使用100 Hz的電針刺激安眠穴發現也增加非快速動眼睡眠，但不會影響快速動眼睡眠。100Hz電刺激增加的非快速動眼睡眠會因為注射naloxone (opioid receptor antagonist)和nor-binaltrophimine (κ-opioid receptor)到NTS而抑制，但注射naloxonazine (μ-opioid receptor antagonist拮抗) 和natrindole (σ-opioid receptor) 不會影響非快速動眼睡眠。我們的結果顯示高頻率100 Hz的電針刺激可能會藉由NTS的κ-opioid receptor增加非快速動眼睡眠。這些結果顯示低頻率 (10Hz) 以及高頻率 (100Hz) 電刺激安眠穴均會增加非快速動眼睡眠，其機轉和電針止痛在脊髓的機制類似，低頻刺激增加β-endorphin在NTS釋放，作用在μ-receptor；而高頻刺激則是藉由κ-receptor。

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使用活體內以及活體外模式探討豬第二型環狀病毒於免疫細胞以及淋巴組織的感染

豬隻第二型環狀病毒(porcine circovirus type 2, PCV2)是一小型、無封套、單股、環狀DNA病毒，其感染廣泛地分布於世界各地。實驗室內以及田間的研究證據指出，PCV2是造成離乳後多系統消耗性症候群(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)，一種對養豬產業有重大影響的疾病的主要病原；然而，PMWS的發生仍有賴PCV2以外的因子參與。PMWS的特徵為大量的PCV2抗原以及核酸存在於淋巴系統內，伴隨著不等程度的淋巴細胞流失以及肉芽腫性炎症反應。至今，對於PCV2於免疫細胞內複製的確切機制以及PMWS的致病機轉仍不明確。因此，本研究建立一系列活體外（第二、三章）以及活體內（第四、五、六章）模式以嘗試釐清以上議題。 本研究第一部分首先假設免疫活化可誘導PCV2於活化的淋巴細胞內複製，因此利用cocanavalin A (Con A)刺激周邊血液淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes, PBLs)作為一活體外模式，以釐清豬隻淋巴細胞對於PCV2的感受性（第二章）；其次，藉由在此模式中添加單核球衍伸之樹突細胞(monocyte-derived dendritic cells, MoDCs)以及重組細胞激素，包括介白素(Interleukin)-2、IL-4以及干擾素(interferon-γ)，以探討淋巴細胞活化與PCV2複製之間的關聯性（第三章）。結果顯示，在經過致裂原刺激、PCV2感染的PBLs中，細胞內PCV2抗原�核酸帶原率、PCV2核酸量以及感染力價均呈上升的現象，顯示PCV2可感染並於活化的淋巴細胞內複製。藉由表面抗原鑑定顯示：單核球、T以及B細胞都對PCV2的具有感受性，其中又以帶有IgM的B細胞具有相對較高的PCV2陽性率（第二章）。相對於淋巴細胞為主要支持PCV2複製的細胞，MoDCs雖帶有明顯的PCV2抗原但並不顯著地支持PCV2的複製。進一步的研究顯示，IL-2以及樹突細胞的抗原呈現功能是淋巴細胞增生以及PCV2在受感染的淋巴細胞內複製的重要因子（第三章）。 本研究的第二部分探討田間的豬隻在不同程度的PCV2感染下其相關的淋巴結病理變化（第四、五章），並且進而推測其可能的機制（第五、六章）。研究推測，目前例行的原位雜交(in situ hybridization, ISH)以及�或免疫組織化學(immunohistochemical, IHC)染色技術，因受限於本身的靈敏度，可能不足以偵測少量存在於部分免疫細胞的病毒。因此，本研究利用將聚合酶鍊鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)以及ISH的步驟結合，建立起更加敏感的間接原位聚合酶鍊反應法(indirect in situ PCR, indirect ISPCR)。藉由ISPCR的建立與使用，可以更有效地偵測於組織內、尤其位於淋巴濾泡的生發中心(germinal center)內的PCV2核酸分布。此外，針對淋巴濾泡中PCV2的感染情形，建立了一套更詳細的分級系統（第四章），以做為後續研究中樣本選擇的標準（第五、六章）。 本研究使用高通量組織微陣列(tissue microarray, TMA)，結合半定量ISH/IHC染色以及統計分析模式，以更有效率地分析組織病理變化（第五章）。當PCV2、豬呼吸及生殖症候群病毒以及豬小病毒感染同時存在下，複回歸分析結果支持 不同病毒其各自的致病機制影響PMWS病變的產生，其中以PCV2的效應最為顯著。在PCV2感染所伴隨的淋巴結病變中，B細胞的流失以及巨噬細胞的增殖與浸潤是兩項主要的特徵。除了血循來源以外，淋巴結內T細胞以及巨噬細胞的增殖對於肉芽腫炎症反應的形成佔有重要的地位（第五章）。此外，選擇了7個來自健康、無臨床症狀、帶有PCV2感染的豬隻以及35個來自PMWS患病豬隻的淋巴結，藉由整合多次定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription PCR, q-rt-PCR)的結果，偵測92個特定免疫基因的表現（第六章）。階層式群集分析法結果顯示，在受到PCV2感染的淋巴結中基因表現呈相大致與不同免疫細胞族群所屬的功能相符合。PCV2感染所伴隨的病變，可歸因於免疫活化的失調以及Th1/Th2的失衡。以主成分分析處理92個選定的基因在42個淋巴結內的表現，顯示52.23%的數據變異性可以被前三項主成分所解釋，顯示PCV2感染所造成的疾病應源自少數主要的因子，但亦受許多次要的因子影響（第六章）。 本研究的證據支持淋巴細胞對於PCV2確實具有感受性（第二、三、四章），根據本研究以及前人的發現，PMWS可能的致病機制為：樹突細胞以及細胞激素所調控的免疫活化可誘發於淋巴細胞內PCV2的複製（第三章），而PCV2對於免疫調節的干擾有利於造成其他病原的共同感染。由於持續或重複抗原的刺激，免疫抑制以及活化之間平衡的失調更趨顯著（第六章），此時，隨著PMWS病程的演進，於淋巴結內呈現高量的PCV2伴隨著淋巴細胞流失以及肉芽腫性炎症反應（第五章）。

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豬第二型環狀病毒對兔化豬瘟疫苗效力之影響

從日據時代以來，豬瘟病毒（CSFV）始終嚴重困擾著國內豬隻畜牧業並造成嚴重經濟損失。此現象持續至李崇道及林再春博士研發出兔化豬瘟疫苗（LPC）後，方使整體豬瘟疫情獲得控制。由於此疫苗可藉由誘發體液性與細胞性免疫反應達到完全保護的功效，因此，LPC疫苗已被視為防治與控制CSFV的重要利器。近年，隨著豬第二型環狀病毒（PCV2）的入侵，國內養豬場幾乎皆已受到此病毒的侵襲，此病毒可導致離乳仔豬罹患離乳後多系統性消耗症候群（PMWS）與呈現嚴重的免疫抑制。由於PCV2主要感染25至120日齡之離乳仔豬，且此PCV2感受性年齡與國內推行的LPC疫苗免疫適期相互重疊，因此，本論文希望評估現行LPC疫苗效力是否會受到PCV2感染所影響。於動物試驗進行前，將先建立CSFV檢測法以提供後續研究使用，而為了讓此CSFV檢測法能夠廣泛被應用於田間樣品之檢測，本試驗發展單管多反轉錄反應之即時定量聚合酶反應（RT-MRT-PCR）以建立兼顧定量與基因型別鑑定之CSFV病毒檢測法。此CSFV RT-MRT-PCR並不會與其它豬隻病毒進行反應，且各基因型別間也無交叉反應，顯示其具有良好的特異性。於敏感性方面，其檢測極限可達1 viral copy/μl且與RT-nPCR具有相同的敏感性，此方法較病毒分離與RT-PCR敏感。另外，應用此檢測方法於豬瘟疫苗效力之測試，結果發現免疫E2次單位疫苗之豬隻，在暴露於具有強毒CSFV環境中，會出現CSFV病毒血症且較免疫LPC疫苗豬隻有較長的持續天數。此結果與先前其他學者之研究相似，顯示RT-MRT-PCR可被應用於豬瘟疫苗效力動物試驗之評估。在探索PCV2影響LPC疫苗效力的動物實驗研究結果顯示，於先有感染PCV2的LPC疫苗免疫豬隻，於強毒CSFV攻毒後會呈現短暫的發燒、病毒血症與從唾液與糞便排毒的現象。但在單純LPC疫苗免疫後接受野外強毒攻毒豬隻則無此現象。另外，藉由分析血液中不同淋巴球亞群與CSFV中和抗體力價，發現先前感染PCV2的LPC疫苗免疫豬隻，其IgM+、CD4+CD8-CD25+、CD4+CD8+CD25+、CD4-CD8+CD25+等亞群淋巴球數目與CSFV中和抗體力價均顯著低於單純免疫LPC疫苗豬隻。當進一步探討PCV2對CSFV特異性細胞性免疫反應之影響，以釐清PCV2干擾LPC疫苗效力的機制，結果顯示PCV2與UV-inactivated PCV2均具有干擾CSFV特異性周邊血液單核細胞增殖反應（CSFV-specific PBMC proliferation）的能力，且此具CSFV特異反應的PBMC其表面分子CD25的表現，也同樣受到PCV2所抑制。此種抑制CD25表現的干擾，同樣出現在先前曾感染PCV2的LPC疫苗免疫豬隻的淋巴球亞群。由於CD25是淋巴球活化與增生的重要指標，此結果顯示PCV2可藉由抑制淋巴球的活化與增殖來干擾疫苗所誘發的免疫反應。由於LPC是一種活毒減毒疫苗，其免疫接種後LPC必須於動物體內進行感染與複製，方可誘發完整的體液性與細胞性免疫反應，而達到完全保護的功效。為了釐清PCV2是否藉由干擾LPC疫苗病毒的感染與複製，來降低LPC疫苗誘發免疫反應的功效，本研究使用對PCV2與LPC具共同感受性的肺泡巨噬細胞來進行其相關實驗。結果顯示，PCV2具有干擾LPC病毒的感染與複製能力，但UV-inactivated PCV2並無此能力，顯示PCV2干擾機制可能與病毒複製過程使用的PCV2基因體，或與複製過程的病毒中間產物有關。在進一步測試PCV2基因體與病毒複製中間產物對LPC感染之影響，發現PCV2基因體中的C9 CpG-ODN與病毒複製中間產物（雙股全長PCV2 DNA）可以顯著抑制LPC的感染，然而此PCV2干擾LPC感染的機制與先前PCV2干擾CSFV-specific PBMC proliferation的機制不同，顯示不同的PCV2病毒成分具有不同的免疫干擾功能。綜合以上結果，PCV2確實可干擾LPC疫苗的效力，其主要經由干擾LPC感染與複製以降低LPC疫苗接種後所誘發的體液性與細胞性反應，最後導致LPC疫苗無法完全保護疫苗免疫豬隻。此結果在使用LPC疫苗防治CSFV的區域是一個重要的警訊，其可能導致現有使用LPC疫苗的防治CSFV計畫出現漏洞，並增加野外CSFV入侵豬場的風險與清除CSFV的困難度。

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大麻二酚引起人類單核球氧化壓力與細胞凋亡之機制

大麻二酚為一萃取自Cannabis sativa不具有中樞活性的天然生物鹼，具有抗發炎及免疫調節等藥理作用。目前已知大麻二酚對於多種癌化細胞及初代淋巴球、胸腺細胞以及單核球等具有促進凋亡的作用，且和氧化壓力有關。本研究目的為進一步探討大麻二酚造成人類單核球氧化性壓力以及引起細胞凋亡的機制。與先前報告結果一致，大麻二酚對於新鮮分離出的人類單核球具有凋亡效果，且具有時間與濃度相關性。時間相關性的實驗結果顯示，在給予大麻二酚後1-2小時會造成細胞內活性氧化物的增加。進一步比較後發現，在給予細胞大麻二酚5分鐘即造成粒線體膜電位去極化，且在15分鐘後造成粒線體內膜中心磷脂（cardiolipin）的氧化。大麻二酚也會造成粒線體中的細胞色素c（cytochrome c）釋放至細胞質，更加證明粒線體為大麻二酚的首要標的。除此之外，共軛膠顯微影像顯示，細胞內的氧化物螢光探針2’,7’-dichlorofluorescein與粒線體的螢光探針MitoTracker位置重和。流式細胞儀分析顯示，粒線體中鈣黃綠素（calcein）的螢光強度明顯減弱，證實大麻二酚會引起粒線體滲透性轉變。大麻二酚引起的凋亡和粒線體膜電位下降受到粒線體滲透性孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）抑制劑環孢靈（cyclosporine A）的回復，但不受到鈣調去磷酸酶（calcineurin）抑制劑FK506的影響。另外，環孢靈也可抑制大麻二酚引起的粒線體心磷脂氧化和粒線體滲透性的轉變。綜合上述，大麻二酚引起人類周邊血液單核球的氧化性壓力和凋亡作用為粒線體所媒介，且為粒線體滲透性孔依賴性機制。

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乳牛場飲水槽生物膜病原性分枝桿菌核酸偵測

威脅牛隻健康的病原性分枝桿菌包括造成牛結核病的Mycobacterium bovis (M. bovis)、伺機病原性的M. avium及引起副結核病的M. avium subsp. Paratuberculosis (MAP)。分枝桿菌細胞壁富含分枝酸，對環境中的物化因子具有抵抗性，目前已知腐生性的非結核分枝桿菌 (Nontuberculosis mycobacterium, NTM) 廣泛的分布於各種自然及人造的環境，而對絕對胞內寄生病原性的M. bovis在活體外存活情形有不同看法。分枝桿菌細胞壁的厭水屬性使其易在環境中形成生物膜，然M. bovis於乳牛場飲水槽生物膜媒介則尚無相關研究。本論文即設計分子生物學偵測技術以便探討病原性分枝桿菌於乳牛場飲水槽生物膜的存在。研究分為四個部份： (i) 設計Nested PCR合併限制酶切割作為偵測病原核酸的定性分析； (ii) 建立病原核酸定量法； (iii) 評估生物膜M. bovis、M. avium及MAP核酸的回收； (iv) 驗證檢測技術可行性。結果顯示： (i) Nested PCR可以區分M. bovis、M. avium、MAP及其他生物膜內常見的細菌，M. bovis的偵測極限為3 ×10-4 ng核酸； (ii) 經Melting curve analysis 確定Real time PCR-SYBR Green的特異性，M. bovis使用SYBR Green及TaqMan分析之偵測極限分別為1.95 ×10-6 ng及1.30 ×10-7 ng核酸； (iii) B/T Genomic DNA Extraction Miniprep System對生物膜內M. bovis、M. avium及MAP的核酸萃取回收率分別為 (53.7 ±32.4)%、 (28.7 ±21.3)%及 (26.7 ±25.7)%； (iv) 乳牛場飲水槽195個生物膜樣本以Nested PCR搭配限制酶切割分析，M. bovis核酸陽性率為28.72%，核酸濃度介於106-8 gene copies，最後一次採樣升至1011 gene copies。PCR偵測生物膜樣本NTM、M. avium及MAP核酸陽性率分別為54.87%、10.77%及3.59%；(v) 比較不同飲水槽材質，M. bovis陽性率於塑膠製飲水槽生物膜最低 (29.23%)，而NTM陽性率於塑膠製飲水槽生物膜最高 (72.31%)。總結本研究設計出生物膜樣本病原性分枝桿菌核酸快速檢測技術，並推論絕對胞內寄生病原M. bovis核酸可以普遍、持續存在於乳牛場飲水槽生物膜中。

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山藥皂苷元抗過敏及益生素之效用

傳統中醫藥典籍及科學文獻記載山藥具有改善免疫及消化功能之效用，本研究之目的在於利用小鼠食物過敏模式，探討山藥中主要免疫活性成份之一〝山藥皂苷元〞的抗過敏及免疫調節作用。BALB/c小鼠分為無處理對照組、每天胃內灌服對照溶劑或山藥皂苷元之組別。除無處理對照組，其他組別小鼠皆以腹腔注射免疫卵白蛋白，並反覆胃內灌服卵白蛋白以誘發腸道過敏反應。口服給予山藥皂苷元顯著減緩卵白蛋白所誘發之腸道發炎，包括過敏性下痢的發生、杯狀細胞黏液的分泌及肥大細胞的浸潤和去顆粒。山藥皂苷元對於卵白蛋白所誘發腸道腺窩增生具減緩及保護之效用。給予山藥皂苷元可促進血清中卵白蛋白專一性抗體IgG2a生成，並促進卵白蛋白所刺激之脾臟細胞分泌細胞激素IFN-γ。然而，抗體IgE及細胞激素IL-4之生成則受到抑制。以免疫組織化學染色及逆轉錄聚合酶鏈式反應評估腸道免疫反應。結果顯示，給予山藥皂苷元可抑制IL-4及GATA3，但促進IFN-γ、T-bet、Foxp3及IL-10之表現。免疫組織化學雙染結果顯示，給予山藥皂苷元可有效回復十二指腸中因食物過敏所造成Foxp3+細胞數量之下降，並促進Foxp3+細胞分泌IL-10，但不影響TGF-β生成。以上結果證實，山藥皂苷元抗過敏之效用與促使Th1/Th2免疫平衡朝Th1為主之免疫反應及增強腸道發炎處調節型T細胞免疫反應相關。 基於山藥皂苷元與某些已報告之益生菌及益生素所表現之免疫調節效用相似，本研究分別以離體及活體試驗測試山藥皂苷元促腸內益生菌生長之效用。口服給予山藥皂苷元可有效回復因食物過敏所造成糞便中乳酸菌密度之下降。Lactobacillus murinus及L. reuteri為餵予山藥皂苷元小鼠糞便中所分離之主要乳酸菌。山藥皂苷元及其他結構相似之固醇類化合物對於此兩株乳酸菌之影響則以離體試驗測試。山藥皂苷元的添加可促進L. murinus及L. reuteri生長，但不影響enterococcus。結構活性關係分析顯示，C5-C6雙鍵及完整E和F環之結構可能為固醇類皂苷元之益生素活性所必需。總結可知，固醇類皂苷元為一可能之新型益生素。 本研究確認了山藥皂苷元抗過敏之效用並探討其可能之機制。實驗結果對於山藥改善消化及免疫系統之效用提供了科學證據，亦顯示山藥皂苷元為山藥中主要具免疫活性植物生化素之一。山藥皂苷元及其結構相似皂苷元之益生素活性未來具有應用及開發之潛力。