臺灣大學獸醫學研究所學位論文
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呼吸/肺功能檢查是在臨床醫學中用以評估慢性氣道疾病、協助診斷、分級麻醉風險、瞭解病程變化與治療反應的客觀量化方法。在人類醫學中，呼吸/肺功能評估已是一項例行實施的臨床檢查；但小動物病患不可能如人類般可主動配合，因此無法使用在人類所實施之檢查方式，所以在獸醫目前仍缺乏呼吸/肺功能評估之廣泛應用。獸醫學上雖具有可直接測量肺順應性與氣道阻力之方法來獲取通氣機械性相關資料，然而這樣的測量方式需要全身麻醉與插管，對罹患呼吸系統疾病的小動物臨床病患而言具有風險，無法為多數伴侶動物飼主接受。因此，發展非侵入性的肺功能檢查方法是小動物呼吸臨床醫學的重要課題。 在過去二、三十年中，陸續有研究團隊評估不同的設備、技術是否有做為犬貓非侵入性呼吸肺功能檢查的潛力，這些嘗試包括了首先為嬰兒所設計發展的潮氣呼吸流速-容積環 (tidal breathing flow-volume loop, TBFVL)，以及在實驗鼠應用之氣壓式全體箱描述器 (barometric whole body plethysmography, BWBP)。然而這些方法均有其缺點，因此限制了在臨床犬貓病患廣泛應用以評估呼吸肺功能之可能性。此學位論文之目標即為研究分析自然潮氣呼吸訊號的其他方法，尋求一個可安全實施於小動物臨床病患、在臨床上適用、非侵入性的呼吸肺功能檢測方法。 研究成果呈現了一個以自然潮氣呼吸分析法為基礎，臨床上適用的非侵入性呼吸肺功能檢測方法。對呼吸訊號波形進行同步目視檢查可協助鑑定與去除干擾假波，並有助於記錄穩定的真實潮氣呼吸訊號。在整合之前不同設備、分析方法之優缺點後，自然潮氣呼吸可使用氣壓式全體箱描述器進行記錄，然後以不同於傳統氣壓式全體箱描述器分析方法、類似於傳統潮氣呼吸流速-容積環方法進行分析量化。在對呼吸訊號圖形的目視檢查下，經由偽氣流、偽容積的描繪，呼吸模式可以被定性化辨認；在正常與罹病動物間，自然潮氣呼吸模式有差異性存在。在特定疾病分類下，可尋找某些具有臨床意義的量化指標；以貓下呼吸道疾病為範例模式，某些特定參數可用以評估疾病嚴重度以及監測治療反應。藉由定性與定量自然潮氣呼吸訊號，可以評估呼吸系統/肺的機械性並用以作為一項非侵入性的呼吸肺功能檢測方法。
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生醫用雞胚胎蛋生產模式根據疫苗種類、製程與實驗目的之需求不同，可分為無特定病原與傳統清淨兩種不同等級。為了解決生醫用胚胎蛋「生產規範不明」與「供需不平衡」之問題，本研究希望援引國際規範與認證標準、國內實驗動物相關準則與國內畜牧營業相關法規，並酌情產業現況以建立可規模化之生醫用雞胚胎蛋生產模式，希望提供訂定生產規範時之參考並按其建造與營運特性分類，進一步以淨現值法、情境分析法與Kaldor-Hick’s 補償原則來探討其投資與產業之經濟效益，並提出評價與決策建議。 關於整體成本特性的探討，無特定病原等級生產模式無論建造或營運成本均高於清淨等級生產模式。隨著飼養數量增加，無特定病原等級的建造成本增長性小於清淨等級，營運成本增長性則大於清淨等級。兩種方案邊際成本皆遞減，其中又以無特定病原的遞減幅度較大，直到飼養4千羽以上遞減效率最佳。除了探討不同等級生產成本，並可依據近5年國內市場研究資料假設積極投資與保守投資兩種生產規模，進而探討其20年內淨現值與回本情況。 關於投資經濟效益的評估，對決策者有利的方案由高至低分別為清淨等級積極投資模式(飼養115,051羽，年產1,700萬枚)、清淨等級保守投資規模(飼養87,981羽，年產1,300萬枚)、無特定病原等級積極投資模式(飼養8,798羽，年產130萬枚)，並分別於第6、6、12年回本，且無特定病原等級生產模式的預期未來需求量不得超過現有需求量之1.17倍，清淨等級不得大於1.44倍；而無特定病原等級保守投資模式(飼養677羽，年產10萬枚) 則造成虧損。對國內其他胚胎蛋生產業者無論任何方案皆因業務競爭而造成損失；對國產疫苗廠商有利的方案由高至低分別無特定病原等級積極投資模式、無特定病原等級保守投資規模；而清淨等級積極與保守投資規模若在目前的競爭訂價情況下則無影響。對總體產業而言，具有公眾淨效益的方案僅有無特定病原等級積極投資模式。沒有任何方案能符合帕累圖最適狀態，諸方案皆會造成部分個體之損失。 關於決策建議，為達成投資決策人與產業最大淨效益，本研究建議決策者建立稍具規模化之無特定病原等級生產模式(飼養至少3,358羽)。抑或建立較小規模生產模式，但需具備較低成本的資源取得能力或經由政府補貼方案來分散投資風險。同時建議與疫苗業者共同研議配合生產計畫，甚至透過投資關係轉嫁成本而建立自有供應鏈，以達成最有效率的生產與應用。另外，建議投資人應與國內民間既有胚胎蛋生產業者進行行銷或技術開發之合作，避免直接競爭關係。本研究也建議政府應分別於政策面、體制面與資源面給予產業協助。透過國際化規範與聯盟的建立、完整公正的國家級第三方疾病檢驗單位的分工、關鍵技術的產學合作，與生獎勵補助方案與監督輔導機制等，貫徹實現我國生技疫苗產業鏈上下游的完整性、人才的培育與國際外銷策略的發展。期許在國民防疫安全的良好維護下，更能使台灣未來成為東亞、東南亞地區重要的疫苗與原料研發與供應核心。
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本研究的目的是調查台灣野生食肉目動物死亡與潛在病因，並針對發現的重要或有趣的疾病進行深入研究。在2011年8月至2015年1月期間共收集51例救傷死亡或路死的食肉目動物屍體，經由詳細解剖與組織病理學檢查、分子與免疫學分析、微生物學及寄生蟲學檢測等進行病因分析。這些案例包括31例台灣鼬獾(TWFBs) (Melogale moschata subaurantiaca)、12例白鼻心(MPCs) (Paguma larvate taivana)、5例麝香貓(SCCs) (Viverricula indica pallida)及3例食蟹獴(CEMs) (Herpestes urva)。人畜共通狂犬病與致死性犬瘟熱分別於4例台灣鼬獾與3例白鼻心被確診。 台灣鼬獾狂犬病的特徵性病理變化為非化膿性腦膜腦脊髓炎、神經節炎及形成典型的細胞質內包涵體- Negri bodies，受影響的中樞神經系統以腦幹病變最為嚴重。此外，大腦皮質部、丘腦與腦幹的神經元與神經氈具有不同程度的海綿狀變性。在非神經組織的代表性病變包括腎上腺壞死與間質淋巴球性唾液腺炎。經由免疫組織化學染色法(IHC)與螢光抗體試驗(FAT)，病毒抗原可在神經組織的神經元細胞與軸突/樹突等區域，以及全身不同組織間的巨噬細胞中被偵測到。結果顯示，腦幹、大腦皮質部、海馬角、丘腦與下視丘是台灣鼬獾狂犬病分子診斷的理想的採樣區。我們利用不同單位提供的2004-2012年間福馬林固定、石蠟包埋的舊有台灣鼬獾腦組織，進行免疫組織化學染色回溯性研究，發現狂犬病陽性案例最早可追溯至2004年。 為了分析台灣鼬獾狂犬病病毒的源起，我們完成三株狂犬病病毒全基因體定序分析，並由公告的幾株狂犬病毒(RABV)核蛋白(N)與醣蛋白(G)序列進行親緣地理學分析顯示，台灣鼬獾狂犬病病毒（RABV-TWFB）來自亞洲譜系並已獨立演化，其近緣病毒株China I (包括中國鼬獾狂犬病病毒株; RABV-CNFB) 和菲律賓狂犬病病毒的分化年代在158-210年前，而台灣鼬獾狂犬病病毒株的最近共祖起源年代約在91-113年前。我們的研究顯示，此次地方性台灣鼬獾狂犬病病毒基因分析的古老親緣結果說明了台灣鼬獾的狂犬病病毒株可能隱晦的潛藏在環境中長期的慢慢傳播，而致一直未被檢出，此病毒與宿主間的交互作用及其潛存的機制值得進一步研究。
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水禽雷氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）感染症為水禽重要疾病之一，好發於3-4週齡雛禽，可經由呼吸道及破損皮膚感染禽隻，其感染率接近100%，致死率可高達75%，造成嚴重的經濟損失。RA共有21種血清型，其中台灣以第2血清型為最常見。RA目前對於其發病機制，特別是感染後宿主的生理反應，了解甚少。本研究目的在建立一套鴨隻肝臟體外的試驗模式，並將RA感染之且進行相關實驗，提供後續研究此病之基礎。本研究使用12-20週齡褐色菜鴨（Brown Tsaiya Duck）來進行研究，以膠原蛋白酶二階段肝灌流法（collagenase two step liver perfusion）來分離鴨隻初代肝臟細胞（Primary duck hepatocytes, PDHs），成功建立出一套鴨隻體外肝臟細胞培養模式。接著使用感染複數（Multiplicity of infection, MOI）為5、10及20來攻菌0-25小時來觀察其回收率，並且在MOI=5且攻菌後16小時有最高回收率為0.1‰。接著在即時定量反轉錄聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative reverse transcriptase PCR, qRT-PCR）實驗中，使用MOI=5攻菌後5及20小時來觀察PDHs之mRNA表現量，結果本篇研究所選擇的10個目標基因皆為向下調節基因。FGC（Fibrinogen gamma chain）與VASH1（Vasohibin）的表現量下降可能與凝血不易有關，FTH1（Ferritin, heavy polypeptide 1）、PIT54（PIT54 protein）與OTF（Ovotransferrin）的表現量下降則可能會導致肝細胞代謝功能受損，ApoA-I（Apolipoprotein A-I）與TTR（Transthyretin）則是肝細胞健康與否的指標，IL-6（Interleukin-6）與免疫有關，BRP44L（Brain protein 44-like）的表現量下降可能使細胞不易進行再生，OIH（Ovoinhibitor）則可能與產蛋率下降有關。這些基因所表現的蛋白質皆可能與RA感染症之臨床症狀有關。顯示在RA感染後，病原體與PDHs交互作用並抑制了菜鴨肝臟細胞相當程度的生理及免疫反應。另外為了觀察RA與PDHs間交互作用之形態，以MOI=40攻菌後3和6小時進行了掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM）試驗，並成功觀察到RA貼附以及鑲嵌在PDHs上，證實RA的感染模式主要為貼附宿主細胞後，影響細胞正常的基因表現，來達到感染及繁殖的目的。本篇研究所建立之PDHs體外試驗模式及實驗結果，可提供未來研究此病之相關幫助，對疾病的控制及疫苗開發有更多貢獻。
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金奈米粒子因具多項優越的物理特性，使其應用於生醫領域大受歡迎。近來研究指出，金奈米粒子作為腫瘤抗原載體及免疫佐劑，應用於腫瘤免疫治療極具潛力。然而，金奈米粒子對免疫系統之影響仍有待釐清。本研究利用卵白蛋白（ovalbumin; OVA）免疫小鼠之模式探討金奈米粒子對抗原專一性免疫反應之作用。商品化之奈米金粒子的粒徑為50奈米，其溶液需調整離子濃度以進行靜脈注射，此時會產生2種粒徑大小之團聚化金奈米粒子溶液，其粒徑分別為86奈米以及86奈米及309奈米混合之奈米金溶液。BALB/c小鼠於第1至10天每天以靜脈注射給予團聚化金奈米粒子(1 mg/kg)，於第2天給予OVA免疫，於第9天進行血清中OVA特異性抗體及T細胞反應性之分析。第10天於小鼠足墊皮下注射OVA誘發遲發型過敏反應。並於24小時後量測足墊腫脹變化及組織病理檢查。實驗結果顯示靜脈投予金奈米粒子增加脾臟指數（spleen index）及脾臟中CD11b+ 細胞的比例。金奈米粒子對脾臟細胞代謝活性並無影響，但促進脾臟細胞表現OVA專一性之IFN-γ。金奈米粒子也促進脾臟細胞以脂多醣(lipopolysaccharide; LPS)刺激所分泌之IL-1β、IL-10和TNF-α表現量。血清中OVA專一性抗體及遲發型過敏反應則未受影響。本研究之結果指出金奈米粒子影響OVA免疫小鼠之部分免疫反應，包含增加脾臟指數和脾臟CD11b的細胞族群，以及促進脾臟細胞表現IFN-γ、IL-1β、IL-10和TNF-α。
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H6N1及H5N2禽流感病毒 (avian influenza virus, AIV) 分別於1972及2003年出現於台灣並且流行至今，H6N1 AIV的分離株為低病原性，而H5N2 AIV在近幾年已經從感染的雞隻分離到高病原性的病毒，必須要發展出可以區分雞隻血清中帶有抗H5或H6亞型之抗體的檢測工具，以幫助AIV的監測與防疫。本研究以不活化的H5N2或H6N1 AIVs免疫BALB/c小鼠，待小鼠血清力價上升後，以融合瘤技術將脾臟細胞 (splenocytes) 與骨髓瘤細胞 (myelomas) 進行融合，並利用間接螢光抗體染色法 (indirect immunofluorescent assay, IFA)、血球凝集抑制試驗(hemagglutination inhibition test, HI test)、中和試驗 (Neutralization test, NT)、西方墨點法 (Western blot, WB) 及間接型酵素連結免疫吸附法 (indirect ELISA) 篩選出抗血球凝集素 (hemagglutinin, HA) 之單源抗體 (αHA MAbs)，同時鑑定αHA MAbs對H5與H6 AIV抗原之間沒有交叉反應；另一方面，我們使用福馬林不活化的A/chicken/Taiwan/1209/2003(H5N2) 全病毒，與桿狀病毒表現系統所表現的A/chicken/Taiwan/2838V/00(H6N1) HA蛋白 (rHAΔTM/H6N1) 作為抗原，搭配經過篩選的αHA MAbs，挑選出最佳的抗體組合，建立以1209/H5N2或rHAΔTM/H6N1為抗原的sandwich blocking ELISA (1209/H5N2 bELISA與rHAΔTM/H6N1 bELISA)。以HI test作為雞血清樣本中H5、H6亞型抗體存在與否的黃金標準 (golden standard)，以702個雞血清測試兩種bELISA，1209/H5N2 bELISA的臨界值為27%，敏感性為93.31% (265/284)，特異性為90.91% (380/418)；rHAΔTM/H6N1 bELISA的臨界值為28%，敏感性為95.11% (214/225)，特異性為96.44% (460/477)。此兩種bELISA相對於HI test具有較高的敏感性，可檢測到低HI力價的血清抗體，有助於提升國內禽流感血清檢測與防疫監測之成效。
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線毛是沙門氏菌表面毛髮樣的蛋白結構物，在細菌感染宿主時扮演了吸附宿主細胞如M細胞表面的重要角色。 沙門氏菌擁有數個線毛基因組，而最常見的是表現第一型線毛的fim基因組。第一型線毛可以吸附不同細胞，例如紅血球、白血球、呼吸道上皮細胞、腸道上皮細胞以及酵母菌等。根據研究，第一型線毛與細菌的致病機制有關，而且80%的沙門氏菌都會表現第一型線毛，表示第一型線毛可能在細菌感染的過程中扮演一個重要的角色。豬隻的沙門氏菌症由豬霍亂沙門氏菌以及鼠傷寒沙門氏菌兩種血清型，其中豬隻感染豬霍亂沙門氏菌會導致下痢、敗血症、四肢肢端發紺、泛發性血管內血液凝固症、壞死性肝炎、肉芽腫性腦炎、間質性肺炎、壞死性腸炎等症狀等。而鼠傷寒沙門氏菌主要造成豬隻的胃腸炎。感染宿主廣泛的鼠傷寒沙門氏菌分離株絕大部分都會產生第一型線毛，但是根據本實驗室目前的研究顯示大部分(97%)豬隻分離的細菌不表現第一型線毛。呈現如此的線毛表線型或許在演化上與豬霍亂沙門氏菌感染易造成全身性感染有關。本實驗把豬霍亂沙門氏菌第一型線毛表現株的線毛基因組 fim gene cluster，依照功能做成分段的重組基因，轉形回不表現第一型線毛之豬霍亂沙門氏菌，分析其不表現線毛的原因為何? 對於可能影響的因子做深入的探討。 在S. Choleraesuis 中 fim gene cluster並沒有發現轉錄以及轉譯的功能缺損，本實以分子選殖 (molecular clonin)的方式將重組質體以電穿孔的方式轉型回不表現第一型線毛之豬霍亂沙門氏菌，完成 fimH 6個點突變之後，結果在fimH G63V恢復第一型線毛的表現。推測是主要結構蛋白 FimH 可能有出現胺基酸的變異，造成其無法送出細胞表面外以至於第一型線毛無法生成，可能是該血清型在演化過程中的結果。
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IV 中文摘要 骨質疏鬆症是普遍存在且好發於骨骼上的疾病，其特徵為造成骨量減少和骨礦物質密度降低，進而容易導致骨骼受損影響的強度和提高機率產生骨折。 本研究建立了動物的卵巢切除術（OVX），利用小鼠模擬人類女性絕經後骨質疏鬆模式，並利用洋蔥，檸檬和骨碎補單方和複方進行飲食的影響治療。 手術後2週等其傷口復原進行8週的治療餵食(a)洋蔥0.7g(b)檸檬0.7g(c)骨碎補(d) 洋蔥0.25g/檸檬0.25g/骨碎補0.25g等呈顯著影響骨質量與所有其他組的OVX小鼠比較。最後使用微電腦斷層掃描造 影檢視相關骨質指標，發現經由治療後小鼠具有提高BV/TV(Bone volume/total tissue volume)、骨小樑數量(Trabecular Number)、骨小樑厚度(Trabecular Thickness)、BMD(Bone Mineral Density) 並能降低骨小樑分離度(Trabecular Separation)與OVX組小鼠相比。然而對於血清中的游離鈣及無機磷，數值顯示實驗中各組間無差異顯著。這些結果表示了利用單方或複方的洋蔥、檸檬、骨碎補能夠延緩因為雌激素缺乏造成的骨質疏鬆症及降低引發的骨缺損風險。
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膝蓋關節軟骨的受損一直被認為是導致骨關節炎(Osteoarthritis, OA)加速發病的一個重要的原因，因為軟骨沒有血管，所以限制了其內在的癒合和再生能力。因此，醫療上需要更新穎的修復療法來治療骨關節炎，並使軟骨再生(Cartilage regeneration)。在組織工程研究中，發展出促進關節軟骨再生的材料是重要的。 透明質酸(Hyaluronan, HA)，又稱為玻尿酸，是維持軟骨細胞外基質物理化學特性的關鍵分子之一。為關節滑液的主要成份，並發現能增加關節滑液的粘彈性，也是關節軟骨的重要組成部份，它能夠在軟骨細胞的周圍行保護的功能。 骨髓間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells derived from bone marrow or bone marrow stem cells, BMSC)是多能性幹細胞，具有分化成多種細胞類型的能力，包括：成骨細胞、軟骨細胞，和脂肪細胞。幹細胞(stem cell)有兩種特性，一是自我更新能力，二是分化的能力。 本實驗目的為關節內注射透明質酸鈉鹽和骨髓間葉幹細胞，已驗證是否能夠達到治療膝蓋骨關節炎和關節軟骨再生修復的療效。 在這項研究中，使用紐西蘭大白兔作為實驗動物，將實驗分為四組，每一組各六隻，總共使用二十四隻動物。第一組為對照組;第二組為注射骨髓間葉幹細胞3×106 cells /0.5ml PBS;第三組為注射透明質酸鈉鹽0.1ml/kg；第四組為注射透明質酸鈉鹽0.1ml/kg混合骨髓間葉幹細胞3×106cells/0.2ml PBS。 手術在無菌操作下進行，製造出右後肢股骨關節內髁軟骨缺損，軟骨缺損範圍為直徑3mm、深度2mm的圓柱形傷口，縫合關閉傷口。手術後一週傷口癒合拆線，同時於手術部位的關節囊內注射實驗材質，隔一週後再次注射實驗材質一次，並且於術後十四週犧牲實驗動物，取下膝關節內髁進行軟骨修復狀況的評估。 研究的結果顯示出，在兔軟骨缺損模式中，移植透明質酸結合骨髓間葉幹細胞，配合組織工程(Tissue engineering)的原理，可以達到良好的組織修復再生能力，並且減緩手術誘導的骨關節炎的發展過程，以及可能應用在兔子OA的早期治療。 在治療組和對照組之間能觀察出統計學上的顯著性差異，最接近的正常的軟骨組織結構的第四組(HA+BMSC)，隨後則是第三組(HA)。這些實驗結果也能提供未來進一步支持組合療法的使用，例如幹細胞療法在其他疾病的應用上，以及對於骨關節炎的預防和治療，可以提供實質上的參考。