臺灣大學獸醫學研究所學位論文
國立臺灣大學,正常發行
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肝損傷為國人重要的醫療問題，許多疾病都可導致肝損傷，包括外科手術或肝臟移植之治療方式所引發的肝損傷和代謝症候群導致的肝損傷。近年來代謝症候群日趨盛行，且經證明會造成肝代謝異常、肝癌及肝內膽囊癌的發生。本研究目的旨在探討肝臟的預防效應，首先利用蛋白質體學分析龍眼花水萃物 (Longan flower water extract, LFWE) 前置處理預防高果糖飲食誘導大鼠代謝症候群之肝臟影響。結果顯示，高果糖飲食會誘導大鼠代謝症候群中蛋白質變化，如：增加果糖代謝、醣解作用、脂肪生成、內質網壓力及發炎反應；減少脂肪酸氧化、抗氧化能力，而導致代謝症候群的發生；使用LFWE處理後，則降低脂肪堆積、發炎反應；提高抗氧化能力，改善血脂異常，顯示出LFWE可經由上述作用路徑抑制高果糖飲食誘導大鼠的代謝症候群。另進一步評估龍眼花萃取物 (Longan flower ethyl acetate extract, LFEE) 和白花水竹草萃取物 (Bracteanolide A) 是否可降低大鼠肝臟缺血再灌流的損傷，評估Aspartate aminotransferase、Alanine aminotransferase、Interleukin-1β、Interleukin-6、Interleukin-10、Tumor necrosis factor-α、Inducible nitric oxide synthase和Cyclooxygenase-2的活性，其數值在缺血再灌流後會顯著的增加，而給予LFEE或Bracteanolide A會有顯著的降低。此外，缺血再灌流會顯著降低肝臟Glutathione濃度，而給予LFEE或Bracteanolide A則可顯著的改善。病理組織學的結果也發現給予LFEE或Bracteanolide A可以有效改善缺血再灌流導致的損傷。因此，LFEE或Bracteanolide A的前置處理可為肝臟缺血再灌流的損傷過程中，如肝臟手術或移植，提供一個新的治療方式。
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骨質疏鬆症是一種漸進性疾病，其特徵是骨骼組織的質量和數量異常，進而導致骨骼強度受損和易增加骨折的風險。雖然詳細的病理機制還需要更進一步去研究探討，但大致上可將骨質疏鬆症歸咎於雌性激素分泌降低，使得原本成骨細胞和破骨細胞之間保持的平衡急劇失衡，造成了骨質疏鬆症的發生。 目前骨質疏鬆症的治療主要是著重在降低骨質耗損速率或是促進新骨質的生成，使用的藥物包括了雙磷酸鹽、降鈣素、雌激素和激素替代療法（HRT）…等。雖然這些藥物現在仍然在臨床上使用以預防或治療骨質疏鬆症，但往往有較大的副作用。例如HRT可以預防骨質疏鬆症，但這些藥物卻會刺激子宮內膜增生，增加罹患子宮內膜癌或乳腺癌的風險。因此目前迫切需要開發用於預防和治療骨質疏鬆的替代方法。 幹細胞是一種未分化的細胞，可以無限分裂成原始幹細胞系，也還有分化成其它類型細胞之潛能。我們收集了小鼠腿骨的骨髓幹細胞，經過流式細胞儀篩選後，於誘導分化為成骨細胞的環境中培養。 富血小板纖維蛋白（PRF）是一種天然生長因子的來源，裡面含有大量會影響骨質再生的生長因子。包含:TGFb-1(Transforming growth factor)、PDGF (platelet-derived growthfactor)、VEGF (vascular endothelial growth factor)及Matrix proteins (thrombospondin-1、fibronectin)。這些PRF所釋放的生長因子，會透過促進細胞增生、基質形成、骨質生成、膠原蛋白的合成等。最近研究顯示，富血小板纖維蛋白（PRF）會非常緩慢地釋放出生長因子至少持續7天甚至最長達28天，這意味著PRF可以在傷口癒合過程中對周圍環境造成長時間的刺激影響。 我們將富含血小板纖維蛋白釋放液（PRFr）添加在進行培養的小鼠骨髓幹細胞，以探討釋放液是否能提高幹細胞的增殖能力及促進細胞分化潛能。結果顯示加入釋放液組別的骨髓幹細胞增殖速率較快速，細胞存活率也高出許多。因此我們推斷富含血小板纖釋放液對骨髓幹細胞生長及分化有極大幫助。 在完成細胞實驗之後，我們接著利用動物實驗，去探討富含血小板纖釋放液對骨質疏鬆症之治療成效。骨質疏鬆症模型建立是利用卵巢切除（OVX）小鼠， 16週齡的 ICR小鼠隨機分配至不手術、卵巢切除或假手術三個類別，不手術組也就是做為Pos.Control的正常小鼠，假手術組是將皮膚劃開後再縫合回去，不摘除卵巢，卵巢摘除組則在卵巢摘除後，分別接受八種不同的治療方法:（1）對照組:不注射任何物質，作為Neg.Control;（2）注射ㄧ次BMSCs組 3x105 BMSCs/0.6ml PBS（3）注射ㄧ次PRFr組，0.6ml PRFr ;（4）注射ㄧ次BMSCs+ PRFr組，3x105 BMSCs/0.6ml PRFr;（5）注射四次BMSCs組 1.2x106 BMSCs/0.6ml PBS ;（6）注射四次PRFr組，2.4ml PRFr;（7）注射四次BMSCs+ PRFr組，1.2x106 BMSCs/2.4ml PRFr ;（8）骨內注射四次BMSCs+ PRFr組，1.2x106 BMSCs/2.4ml PRFr。所使用的骨髓間葉幹細胞是從健康同種異體小鼠取得，而富含血小板纖維蛋白釋放液PRFr則是從健康兔子抽取血液製備而成。治療時將幹細胞或富含血小板纖維蛋白釋放液注射至小鼠的薦尾靜脈中，以調查其用於骨量恢復與骨質再生的治療潛力。 完成注射後之小鼠會再飼養八週，使其骨骼完整生長，最後將其犧牲並利用Micro CT 血清檢測 以及組織切片染色去評估治療成效。Micro CT掃描部位為左腿脛骨近端生長板下0.5~1.5mm處，分析項目包含骨礦物質密度、骨組織百分比、骨小樑數目、骨小樑厚度及骨小樑間距。分析後將腿骨先利用中性脫鈣液脫鈣，在以石蠟包埋切片，並染H&E染劑以放置於顯微鏡下觀察。 由實驗結果得之，僅僅注射一次BMSC或是PRF的治療小鼠，皆無明顯治療效果，骨質疏鬆症現象和不治療組小鼠相似。而注射四次BMSC或是PRF的治療小鼠，骨礦物質密度、骨組織百分比、骨小樑數目、骨小樑厚度及骨小樑間距等數據都明顯高於不治療組小鼠，顯示體內骨質疏鬆症現象減緩。另外在注射部位方面，我們也發現了雖然差異不大，但是直接將幹細胞注射進入小鼠脛骨骨髓腔，比注射在小鼠薦尾靜脈治療成效來的好。最後探討注射物質對治療成效差異，經過注射PRF+ BMSC治療的小鼠骨骼比那些單純只使用PRF或骨髓幹細胞的小鼠骨密度更加緊密。所以本研究結果證實使用PRF及BMSC可以達成骨質疏鬆症的治療效果。
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摘要 本論文有三個討論主題： 1. 研究台灣201例犬乾眼症個案。 2. 研究探討犬隻絕育與淚液分泌的關係。 3. 臨床評估傳統中藥對於犬乾眼症之治療，並與環孢靈A相比較。 研究台灣201例犬乾眼症個案 本研究是用回溯性研究法，於國立台灣大學動物醫院取201例犬乾眼症(keratoconjunctivitis sicca, KCS)個案資料加以分析。其中包含23種品種，影響最大的三種：西施、馬爾濟斯和美國可卡犬占了59.2%。在所有個案中，出現臨床徵兆的平均年齡是八年又一個月，公母在統計上無顯著差異。臨床徵兆包含角膜色素沉澱、黏液樣膿性分泌物與角膜潰瘍。相較之下，西施犬與馬爾濟斯有較高的角膜潰瘍發生率；西施犬在角膜色素沉澱的狀況也較為嚴重。但在黏液樣膿性分泌物方面，品種影響在統計上無顯著差異。本研究取台灣地區多種犬種做為參考族群，針對在不同性別、年齡與發生角膜色素沉澱及角膜潰瘍的風險探討，這部分尚未有其他文獻發表。 研究探討犬隻絕育與淚液分泌的關係 本研究目的是要探討絕育犬隻與未絕育犬隻對於淚液製造的影響。研究個案包含200頭狗，性成熟的公母犬各100頭。在系統性與檢眼鏡檢查下皆是健康犬隻，並在每月定期對雙眼實施淚液分泌測試(STT)。一般公犬與絕育公犬的檢測數值中發現，前者在STT的測值是18.6 ± 3.1毫米，而後者是15.5 ± 2.9毫米；一般母犬的STT測值是19.2 ± 3.3毫米而絕育母犬則是 16.5 ± 4.5毫米。比較一般公犬與絕育公犬，會發現絕育公犬在STT測值會比一般公犬低，在一般母犬與絕育母犬的比較亦同，經統計分析皆具顯著差異。總體可得，絕育的犬隻有較少的淚液分泌。在這些樣本中，年齡差異全距約19個月，絕育公犬平均年齡為18.4 ± 7.8個月、絕育母犬平均年齡為20.3 ± 5.6 個月；STT測量值則在7.19毫米，其中絕育公犬為7.68 ± 1.1毫米、絕育母犬為6.7 ± 1.2毫米。這些數值在乾眼症的臨床診斷具有重要性。至今的獸醫文獻中，尚未有任何關乎犬隻絕育手術帶來的乾眼症表徵與臨床徵狀變化探討，而此次研究得到絕育犬隻的乾眼症發生率為9.5%，對照文獻顯示一般犬隻的乾眼症發生率為1-4%。 臨床評估傳統中藥對於犬乾眼症之治療，並與環孢靈A相比較 乾燥性角結膜炎一詞，常用以形容淚液分泌減少的狀況，另一種說法則是「乾眼」。環孢靈A對於治療此症狀有良好的效果，然而，在統計上也有顯著數量的犬隻對於環孢靈A療法無效，是以本研究目標為評估傳統中藥材對於緩解犬隻乾燥性角膜炎臨床症狀的療效，並將其與環孢靈A藥膏相較。研究個案為19隻尚未以環孢靈A治療的乾燥性角膜炎犬隻，隨機分成中藥材與環孢靈A兩組，進行八週的投藥試驗。結果顯示，以中藥治療的組別得STT數據為19.3±1.7毫米/分鐘，而用環孢靈A治療的犬隻得STT測值21.2±1.2毫米/分鐘。在統計之下，中藥材與環孢靈A療法在臨床徵狀改善程度無顯著差異(P=0.58)。研究結果顯示，於犬隻的乾眼症治療，中藥材不僅在使用上安全無虞，效用上亦等同環孢靈A，此外，以口服的方式投藥較眼藥膏單純，價位上也相對較低具有較高的接受度。