臺北醫學大學醫學科學研究所學位論文
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神經營養因子在神經發育過程中，對神經的分化、存活等皆扮演著重要的角色。先前研究發現細胞去極化的作用，會促進神經營養因子及其受體的表現。在此，我們欲證實興奮性麩胺酸受體的活化，在神經發育期中，是否會調控神經營養因子受體的表現。大腦皮質神經元初代體外培養第五天時，我們發現麩胺酸受體亞型促效劑AMPA/KA在50μM濃度下，確實會改變細胞膜上神經生長因子受體TrkA的表現；而細胞質中TrkA的改變則無明顯差異。由此可推測，AMPA/KA造成TrkA的增加，並非由細胞質送出至細胞膜上所造成的。而利用第二型鈣離子/鈣制素依存型蛋白質激?(CaMKⅡ)的抑制劑KN-93與KA的共同作用下，會降低TrkA的表現，且會造成細胞的死亡，故可知CaMKⅡ的活化可能為KA的神經保護作用所必需。我們更進一步證實，KA的作用會影響存在於細胞核中的CaMKⅡ受質環腺嘌呤核?單磷酸反應物質結合蛋白(CREB)的活化。而雖然KN-93本身便會降低CREB的活化，但對KA增加CREB活化並無法抑制之。另一方面，在KA被移除後，活化態的CREB會減少，KN-93的移除則會造成其增加；而兩者合併給予，KN-93並無法改變KA被移除所造成活化態CREB減少的現象。由以上結果推測，KA藉由CaMKⅡ所造成TrkA表現增加的過程，應是透過其他轉錄因子，而非CREB的作用。然而此因子究竟為何，尚待更深入的研究以釐清。最後，神經營養因子受體活化後所啟動的下游訊息傳遞系統與KA對發育期大腦皮質神經元的保護作用之關聯性，亦於此探討之。實驗結果發現KA在PI3 Kinase抑制劑Wortmannin 40nM的作用下，會抑制其原有對神經元的保護作用，造成細胞的死亡。而MAP Kinase抑制劑PD98059在20?M的濃度下，並無法影響KA的神經保護作用。總而言之，在發育時期之大腦皮質神經元中，麩胺酸受體KA的活化會藉由引發CaMKⅡ的活化而增加TrkA的表現，進而啟動下游之PI3 Kinase訊息傳遞系統，達到神經保護作用，以維持神經細胞正常的發育。
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中文摘要 本研究的主要目的在於：利用靈芝子實體殘渣在均相的狀態下製備薄膜，適用於傷口修復及軟組織的吸收性修復。另一方面並進一步對靈芝子實體殘渣作結構鑑別。首先以靈芝子實體萃取過有效成份後的殘渣為材料，先將殘渣以粉碎機研成碎屑，接著以不同條件的NaOH為變因進行鹼處理，鹼處理過後的殘渣以清水沖洗至中性，繼之以不同條件的NaClO3 為變因進行脫色，以清水沖洗至中性，且AgNO3檢測無Cl- 離子殘留。歷經鹼處理及脫色手續的殘渣，將其以冷凍乾燥乾燥三日，之後取出乾燥過的樣品，取不同條件下的樣品，以8% 的濃度置於二元溶劑系6% LiCl/DMAc中溶解三日，完成後依序成膜，再以 Ethanol/Acetone/Water各120、15、60 秒迅速浸泡後撈起，以清水放流24 小時並平鋪在Teflon紙上，待其風乾，即可得到初步的靈芝膜。靈芝膜以DMA測強度並進行細胞毒性測試，初步評估可行；NMR、IR、GC/MASS測得靈芝子實體主結構的幾丁質以C-3與其它b-1,4-Glucan鍵結；X-ray及DSC測樣品處理前後結晶狀態的相異點。並將之前溶解的靈芝溶液以黏度計測分子量，最後綜合數據找出最合適的成膜條件，大量製造後並計劃與生體相關的實驗。
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現階段抗氧化劑的應用主要分為兩大類：(１) 健康食品及食品添加物，(２) 臨床治療及預防用藥。為了因應市場不同的需求和人體不同組織吸收藥物途徑的差異，我們以增加抗氧化劑的多樣性及安全性作為研發新型抗氧化劑的主要方向之一。經過各種篩選物質來源的比較評估結果認為，放線菌二次代謝物的複雜度及變化性較高適合作為生理活性物質生產源，因此在實驗設計中鎖定此一微生物素材進行抗氧化物質的篩選，希望藉此發展出能維護人體健康或者具有治療疾病功能的天然抗氧化劑。 實驗初期我們至全省各地採集多種土壤樣本，並從其中分離出近200株不同形態的放線菌菌株。針對這些分離菌株，進行菌種培養及二次代謝物的醱酵生產，並配合所設定的抗氧化活性檢測方法進行抗氧化物質生產菌的篩選。針對篩選目的，我們設計了以下的實驗步驟：首先進行二次代謝物回收及檢測樣本處理，亦即是將醱酵所得的培養上清液，利用乙酸乙酯 (Ethyl acetate; EtOAc) 萃取回收，並以真空減壓濃縮脫水等方式處理，以取得提供抗氧化活性篩選之檢測樣本；接著進行抗氧化活性檢測及菌種篩選：以「清除α,α-dipheny-β-picryhydrazyl (DPPH) 自由基能力之測定」、「硫丙二醯尿生成系統 【Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) formation system】」和「還原力(Reducing power) 測定」等檢測方法作為篩選菌株之標準。經此篩選程序，我們選獲了具有抗氧化物質高生產力的菌株，命名為 AMBL-019C ；並由菌種鑑定的結果確認 AMBL-019C屬於 Streptomyces sp.。接下來為取得足量的抗氧化物質以進行後續物質的探討，我們同時大量醱酵了 AMBL-019C 及進行其代謝物的生產回收研究；此部份我們選用YMD + 0.1% Tween80 培養基在室溫下利用通氧培養法進行菌種大量醱酵，並採乙酸乙酯萃取的方式回收其二次代謝物。關於進一步抗氧化物質的分離純化方面：實驗首先將 AMBL-019C 粗萃取物以酸鹼轉溶，再配合抗氧化分析取得中性活性層部份。後續則以矽膠薄層色層分析法 ( Thin layer chromatography; TLC) 分析所得特定活性物質 Rf 值的位置為判斷基礎，利用矽膠管柱層析法 (Column chromatography) 進行較大規模的物質分離提純。當移動相為Hexane：EtOAc＝96：4時可沖提出此特定活性物質，並將此純化物命名為AMBL-019C-TS (TS)。以高效能液相層析法 (High performance liquid chromatography; HPLC) 進一步進行 AMBL-019C-TS純化，在滯留時間7.30至7.70分鐘處可收集到活性物質，其純度亦可再由 HPLC 加以分析確認；TS 為淡黃色針狀結晶，可溶於甲醇 (Methanol) 及較甲醇極性低的有機溶劑，如乙酸乙酯、苯、正己烷等，但不溶於水。利用質譜儀 (Mass spectroscopy)、紫外光-可見光全光譜 (Ultraviolet-visible spectroscopy)、核磁共振氫譜 (1H-NMR)、核磁共振碳譜 (13C-NMR)、氫-氫二次元核磁共振圖譜 (1H-1H 2D NMR) 初步鑑定得知 TS 分子量為236，分子結構中具有苯環和羰基 (-CO)。在抗氧化活性評估方面，由於體內低密度脂蛋白 (Low density lipoprotein, LDL) 的氧化會造成粥狀動脈硬化而導致心血管疾病，故針對此我們評估了 TS 對 LDL 過氧化保護活性，以初步判定此一物質用於預防或治療心血管疾病的可能性；檢測結果顯示此物質具抑制 LDL 過氧化的作用，並與濃度成正比關係，因此我們推論 TS 具有開發成為預防或治療心血管疾病藥物的潛力，至於動物實驗的結果則有待進一步評估；此外為了檢測 TS 對於細胞受氧化傷害時的保護效果，我們亦利用 Balb-3T3 細胞進行細胞毒殺及抗細胞氧化傷害實驗，實驗結果發現TS在抑制 DPPH 所造成的細胞氧化傷害的濃度下，TS 並未被觀測出有任何細胞毒性。針對此一結果，可以初步判定 TS 不但具有抑制自由基及抗油脂氧化的活性，且對於動物細胞亦具有抗氧化保護活性和相當程度的安全性。
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活性氧與發炎性及退化性疾病相關已普遍被接受，使用來清除活性氧的天然抗氧化物大部分集中在酚類化合物。阿斯匹靈是酚類化合物，被廣泛使用於治療止痛消炎與類風濕性關節炎上。它的代謝物水楊酸，參與了很多氧化還原反應。大多數研究證實，水楊酸可以抑制氧化壓力，是經由直接跟氫氧自由基的中和作用。在一些測定氫氧自由基方法中，ESR雖可以直接測到自由基，但不能測定反應前後構造的改變。在我們的實驗中，NMR僅需要些許製備，就可擁有直接觀察產物構造變化的能力。水楊酸與經由芬頓反應產生的氫氧自由基作用，會產生一些氫氧基化衍生物，而在芬頓反應之後，水楊酸的NMR氫譜顯示，在化學位移6.9、7.38、7.76 ppm的三個位置上的氫光譜會逐漸減少，就以氫譜積分值的變化，觀察水楊酸的氫氧化速率。水楊酸在這個方式中，顯示有清除氫氧自由基的能力，我們就使用不同的抗氧化物或氫氧自由基清除劑，在水楊酸存在下，來測量其清除氫氧自由基的能力。Vitamin C、Tiron和DMSO 對於水楊酸氫氧化有高抑制的效果，而Mannitol和NAC在防止水楊酸氫氧化的效果較差。而以這核磁共振光譜學研究水楊酸氫氧化變化，來評估一些抗氧化物的氧化還原作用是一個新的模式。
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本實驗室長期從事微生物代謝物的探索研究，而從代謝物中篩選活性抗氧化劑即是研究的項目之一。近年來有研究報告指出，某些抗氧化劑具有抑制轉錄因子NF-κB活性的能力，且此抑制作用將有助於不正常細胞的死亡。因此，本研究目的著重於建立一個可以快速而且正確地篩選NF-κB活性抑制物的系統。我們先將pIκB-EGFP質體轉染到人類肝癌細胞株Huh-7細胞內，此質體會持續在細胞質中產生IκB和EGFP融合蛋白質，然後再使用抗氧化劑處理轉染細胞，並以流式細胞儀偵測細胞中IκB-EGFP蛋白質的含量。若該物質為IκB裂解抑制劑，則原本將裂解消失的IκB-EGFP蛋白質，會因為抗氧化劑之IκB降解抑制能力的不同，而偵測到不同的EGFP螢光，此螢光量的高低便可用來反應抗氧化劑對IκB裂解抑制能力的強弱。從本實驗室先前篩選所得數種微生物來源的抗氧化劑中，我們利用此系統選獲其中一具有抑制IκB降解能力的天然化合物：hydroquinone (HQ)，其抑制細胞內IκB降解的活性已進一步使用西方墨點法證實；此外，我們亦建構含luciferase報導基因的質體，以期建立更敏感的篩選系統，達到大量篩選NF-κB活性抑制物的目的。HQ經測試發現會影響腫瘤細胞的生長週期並導致癌細胞死亡，而且我們偵測HQ對於動物體內血液細胞的毒性結果顯示，HQ對於血小板和白血球細胞並沒有顯著的毒殺活性，而我們比較HQ對K-Balb癌化細胞和Balb-3T3不死化（immortalize）細胞株的細胞毒性，結果發現HQ會對癌化細胞有較高的毒殺效果，這些特性將有利於HQ作為治療或預防癌症之應用。此外，我們亦觀察HQ搭配抗癌藥物併用的細胞毒殺效果發現，HQ結合抗癌藥物mitomycin C或5-FU並不能夠增強對於癌細胞的毒殺效果，反而會降低抗癌藥物本身的毒殺能力，因此HQ應用在抗癌藥物的發展，無論是單獨使用或與其他種類的抗癌藥物的併用，在未來均有深入檢討的必要。
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嗎啡成癮的懷孕婦女，其嬰兒於出生後雖然在外表上並無畸形的現象，但長期來看則發現到這類幼兒其學習能力異常及情緒控制能力有不穩定的情形，這樣的情況有報告指出可能是因為嬰兒於出生前即暴露於嗎啡的環境之下而使的嬰兒於腦部神經突觸、神經傳導物質的釋放以及接受器的表現上發生不正常的改變所導致。先前本實驗室曾經利用一種長期動物給藥模式，即是於母鼠懷孕前一週給予皮下注射每公斤2毫克的嗎啡，在確定其懷孕之後即每週增加每公斤1毫克的劑量，直到幼鼠出生後30天。而在幼鼠出生後的第7天、14天、30天、60天分別給予斷頭取腦，並利用受體結合實驗來定量個腦中大腦皮質及海馬迴的NMDA receptor 密度。結果發現控制組所生幼鼠其大腦皮質及海馬迴中於出生後第14天NMDA 受體的表現量有短暫性高峰的現象，但在嗎啡組的幼鼠身上並沒有發現到這樣的情況。這樣的現象可能是嗎啡導致NMDA 受體的各個亞型的表現下降所致。而本實驗室過去利用相同的動物模式來進一步的探討是否給予在嗎啡的狀況下將使得發育中的老鼠腦中大腦皮質、海馬迴、紋狀體這些腦區其NMDA 受體的各個亞型的表現量產生改變，結果發現嗎啡組所生幼鼠在大腦皮質區、海馬迴及紋狀體其NMDA受體亞型蛋白於出生後第7天及第14天比控制組所生幼鼠下降許多。因此我們推論這種現象可能與幼鼠體內嗎啡的濃度有關，若是讓幼鼠出生後即終止嗎啡給予，使其血中嗎啡濃度消失而產生脫癮，這樣的現象對於NMDA受體的減量調控是否仍然存在。故本實驗研究的第一個方向在於瞭解於幼鼠出生後立即停止給予母鼠嗎啡，來觀察幼鼠腦中各天數NMDA receptor各亞型的表現。 NMDA receptor的活化即為活化CaM kinase II必須的過程，在生理上，活化後的CaM kinase II具有調節神經傳導物質的釋放與合成、碳水化合物的代謝、細胞骨架的組合、分解和神經可塑性及增強突觸間的傳導並誘導產生LTP(Long —term protentiation)。而以往本實驗室發現嗎啡會導致幼鼠於發育期間腦中大腦皮質區、海馬迴及紋狀體中NMDA 受體的密度下降，而這樣的現象是否會使的CaM kinase II的活化受到影響。所以本實驗第二個研究重點在於利用西方墨點法觀察長期施打嗎啡下的懷孕母鼠其所生幼鼠及嗎啡於幼鼠出生後不繼續打下去的組別，其腦中活化型式的CaM kinase II表現量是否與正常的幼鼠有所差異 ; 同時偵測幼鼠於大腦皮質及海馬迴內CaM kinase II的活性來加以比較西方墨點法所得到的結果。結果指出長期給予懷孕母鼠嗎啡其所生的幼鼠其腦中大腦皮質、海馬迴及紋狀體內NMDA 受體各亞型及具活化狀態的CaM kinase II 的表現將受到改變 ;而嗎啡於幼鼠出生後不繼續打下去的組別所觀察到的活化狀態CaM kinase II的結果與嗎啡於幼鼠出生後繼續打下去的組別的結果相同。
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乳癌一直是女性癌症死亡的重要原因之一，在美國乳癌死亡率約為26％，在國內根據衛生署統計乳癌佔女性病患死亡已達到第2位，僅次於子宮頸癌，但似乎每年有增加的趨勢，因此乳癌治療乃是女性的健康主題，相信能找到更多的抗癌症的治療方法或藥物是許多人努力的方向，也是癌症患者的福音。在許多的研究報告中可以發現抗癌藥物誘發癌細胞進行apoptosis是目前著重的一個研究方向(尤其是Bcl-2 protein)，而初步研究發現AZ-1(Bis-Aziridinoquinonyl thiaethers)對乳癌細胞BC-M1具有致死作用，發現AZ-1引起細胞死亡率在濃度0.5μM、24小時對BC-M1造成接近50％的致死率，而且在48小時更有接近99％的致死率。而AZ-1對細胞毒性分析則發現在0.125-1.98μM濃度下對Skin Fibroblast的死亡並不明顯但對BC-M1則毒性明顯，另外以AZ-1與Pacilitaxel(Taxol)及Tamoxifen比較下，發現再0.5μM濃度以上，AZ-1對於BC-M1致死率比taxol和tamoxifen高，而對於Fibroblast細胞毒性則相差不多。 接下來利用流式細胞儀發現，在低劑量下AZ-1能部分抑制細胞週期的進行。利用西方點墨法發現cdk2表現量下降而cyclin B變化卻不明顯。此外在流式細胞儀的結果中發現，隨著劑量的提高，sub-G1 峰逐漸的升高。利用DNA螢光染色亦發現有DNA斷裂的現象。在NMR的分析上發現隨著劑量的增加，CH3/CH2的比值也跟著提升;而測得caspase-3酵素活性上，發現愈高劑量酵素活性也跟著提高。利用西方墨點法發現，隨著劑量的增高，pro-Caspase 3與TIAR的蛋白表現量隨之下降。綜合以上我們推測AZ-1造成乳癌細胞的死亡的方式為細胞凋亡的路徑。
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Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) 是一種進行性運動神經肌肉萎縮症，屬於運動神經元疾病(MND)的一種，目前病因不明，臨床上尚無有效治療藥物。而在FALS病人的sod1基因上，已發現約有50種點突變。推測ALS病因可能是:由於人體內sod1基因發生點突變使體內產生過量的自由基hydroxyl radical (?OH)無法獲得清除，進而攻擊神經細胞造成細胞走向apoptosis死亡。apoptosis是造成ALS病人運動神經受傷萎縮的主因。因此我們探討突變型sod1基因引起神經細胞死亡誘發運動神經元疾病ALS之致病機制。 為進一步篩檢台灣本土型 FALS病例，探討台灣本土型 FALS病例是否與日本及歐美的病例一般發生sod1基因點突變，設計了5對PCR引子，深入分析台灣本土型 FALS病例 sod1基因所發生變異的位置。 利用RT-PCR的技術從人類肝臟組織cDNA中選殖出存在人類體內的抗氧化酵素: Cu,Zn-SOD並以大腸桿菌E. coli進行蛋白質基因工程的表現及其多株抗體的製備，成功的選殖出抗氧化酵素基因，表現出具有活性約1335 (Unit/mg) 的蛋白質。此外利用site-direct mutagenesis PCR構築出三個未曾分析過帶有點突變的sod1基因E21K、D90V和D101G，選擇大腸菌基因表現系統製備出這些變異型重組蛋白質，結果顯示他們的活性下降分別只剩至52%、56%、38%，在in vitro上相似於病人來證明其體內酵素活性的改變與差異。 PC12細胞為神經疾病方面良好的細胞實驗模式，為探討變異的sod1基因與 ALS 相關性，目前我們成功新建立了SOD1-transduction delivery protein系統，超越傳統transfection技術的缺點,可以定量將正常或變異型的蛋白質直接準確的送入PC 12 細胞。以免疫螢光染色法定性觀察到denature Tat-SOD1明顯被攜帶入細胞，而且隨著時間的增加SOD1蛋白的存在量也跟著增加 ，更重要的是也觀察到酵素活性的增加發揮所扮演的生理活性功能。 進一步探討神經細胞透過apoptosis的死亡機制，在細胞培養液中給與一個已知的superoxide anion產生物70mM Paraquat，使其對PC12細胞產生攻擊引起死亡。細胞存活度約為18%。 隨著Tat-SOD1、Tat-E21K和D101G不同蛋白的加入，他們的存活度分別增加為33% (Tat-SOD1)、29% (Tat-E21K)，在DNA fragmentation中細胞所出現的斷裂情形有明顯差異，顯示他們可以保護細胞免於走向死亡;然而加入Tat-D101G細胞的存活度卻下降為6%，出現特別顯著促進細胞死亡的情形。隨著人類基因的解碼及後基因體時代的來臨，我們更希望藉由transduction delivery protein系統進行研究,相信必定可以達到protein therapy的目標。
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規律的運動有益身體健康，並能減少罹患心血管疾病的機率，這是眾所皆知的事，但在運動的同時，體內需氧量大量增加、代謝加速，這時便會產生許多含氧自由基，過量的含氧自由基會引起氧化性壓力，造成潛在性的傷害。然而，運動是否會引起氧化性傷害方面的研究結果常常互相矛盾，且大多研究又多著眼於單次且極費力之運動且樣本數偏低，實難斷定氧化性壓力於運動傷害中所扮演的角色。8-hydroxydeoxyguanosine（8-OHdG）是DNA上的鹼基鳥糞?呤C8位置受到氫氧化的產物，它時常被當作DNA氧化性傷害的生物標記，而尿液中的8-OHdG是DNA修補後的產物。本研究探討單次劇烈運動前後、長期規律性運動前後及其兩者氧化性傷害之比較，研究對象包括29位劇烈運動1-2小時之大學生，平均運動強度為8.13 MET （metabolic equivalents，休息代謝率），分別收集其運動前後血液及尿液，和32位每週運動2-3次，持續12週之大學生，平均運動強度為6，分別收集其運動前後之血液及尿液，測定其8-OHdG及dG之含量。結果顯示單次劇烈運動前後每毫升尿液中8-OHdG值分別為3.14 ±1.45及4.82 ± 2.19（n=10），雖有上升趨勢但無顯著的差異，而血液中8-OHdG/105dG比值運動前後分別為26.18 ± 3.79及29.29 ± 5.54（n=29），亦無顯著的差異；而長期規律性運動前後每毫升尿液中8-OHdG分別為1.22 ± 0.5及12.55 ± 6.93（n=8），達邊緣性顯著差異（marginal significance），而血液中8-OHdG/105dG比值運動前後分別為86.51 ± 22.98及 27.31 ± 4.47（n=32），明顯的下降，並達到統計上的意義。若將所有運動前及長期規律性運動後之樣本進行比較，運動後血液中8-OHdG/105G比值較運動前為低（28.57及53.33），達到邊緣性顯著差異（P=0.1），每毫升尿液中8-OHdG含量，運動後則較運動前為高（16.71及2.52），並達到統計上之意義（P=5.82×10-6）。本研究證實了運動確實增加體內的DNA氧化性傷害，長期規律性運動者體內修補系統能力似乎較單次劇烈運動者為佳。由於在實驗設計之初挑選研究對象並未注意其是否有規律運動之習慣，因此單次劇烈運動前樣本之條件可視為和長期規律性運動前相同。
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蟹殼上之殼糖晶型結構、為生物型液晶之最佳研究材料。因具有規則的排列角度，並可於電子顯微鏡下觀察。本研究環繞殼糖為主軸、此種具有高分子特質之天然生物醫學材料；藉由蟹殼、烏賊軟骨、靈芝這三種樣品為實驗標的，期望在穿透式電子顯微鏡（TEM）底下搜尋膽酯醇型液晶相（cholesteric liquid crystal）的存在位置與構型。將蟹殼（crab）以2N NaOH去蛋白、2N HCl 脫鈣、冷凍乾燥脫水、EPON812平板包埋等程序處理後，於TEM 超薄切片（80nm）下證實 chitin cholesteric liquid crystal texture 的存在（Arced pattern of fingerprint）。後期將純化後之殼糖以3N HCl；以及不同濃度之NaOH， 104°C煮沸回流約1~6小時，離心稀釋及透析後將酸移除，並以超音波震盪後，使得降解過後之殼糖分子轉變為凝膠狀懸浮液，濃縮至一定濃度後產生分層現象，其分子具有類似節肢動物中殼糖微纖維的排列特質。簡言之，本研究的主要目的為搜尋膽酯醇型液晶並探討生体高分子液晶自我重組的特點。