臺北醫學大學醫學科學研究所學位論文
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流行性嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）感染症為台灣的法定疾病，目前流行性嗜血桿菌感染症所使用的抗生素為ampicillin及chloramphenicol，但是將近一半以上會產生抗藥性，且帶有β-lactamase的抗藥性基因，有些菌株甚至對多種抗生素產生抗藥性。與歐美國家相較之下，台灣地區嗜血桿菌的抗藥性問題更加嚴重。在抗生素濫用、缺乏管理的情形下，其具抗藥性之比例已有50% ~ 60%以上，因此相關抗藥性的機轉研究是刻不容緩的。 本論文主要是要探討流行性嗜血桿菌在台灣地區的感染情況與抗藥性在各菌株間分布的情況，以及建立台灣地區流行性嗜血桿菌的分子分型指紋圖譜資料庫，以供臨床及用藥之參考。我們收集到2003年台灣地區全國各大醫學中心嗜血桿菌的感染樣本。首先做菌種培養確定為嗜血桿菌，以及MIC的檢測，以供後續的資料研究。我們利用數種分子生物學的技術建立嗜血桿菌的分子指紋圖譜，包括ERIC-PCR、REP-PCR與16S rDNA - RFLP來建立嗜血桿菌菌種資料庫。我們亦針對嗜血桿菌可能帶有之質體DNA，設計引子來檢測帶有抗藥性基因，利用核酸定序進行分析抗藥性基因之種類與分布，最後再與醫院嗜血桿菌MIC試驗的資料做整體之統計分析。不論是REP PCR、ERIC PCR或者是16S rDNA的分子指紋圖譜鑑定方法，都可以有效的分型流行性嗜血桿菌。ERIC / REP PCR的優點為簡單操作、省時間與金錢，且準確度很高，鑑別菌種的多樣性比16S rDNA大。REP PCR所產生的pattern不論起全國或各醫院觀察都比ERIC有較多多樣性，但是ERIC / REP PCR兩者所分類的族群ERIC比REP多。所以以流行性嗜血桿菌的分子指紋圖譜來看，我們會建議採用ERIC PCR的方法，快速又便利，且花費最低，且菌種的多樣性多。台灣地區的流行性嗜血桿菌的抗藥性問題嚴重，其中以ampicillin最為嚴重，有63％的細菌具有抗生素抗藥性，在我們檢測的八種抗生素中，發現流行性嗜血桿菌不僅僅對一種抗生素產生抗藥性，具有兩種抗藥性。嗜血桿菌內普遍存在質體，以兩種形式存在，excised或是integrated types。嗜血桿菌抗藥性產生的原因主要是細菌內的具有質體不論是excised或是integrated types的都與抗生素的抗藥性有高度的相關性。
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退化性關節炎 (osteoarthritis, OA) 的發生原因為由於細胞激素 (cytokines) 的誘發，使得活性氧分子 (ROS) 參與細胞外的分解路徑，造成軟骨部分損傷，而導致退化性關節炎的發生。而銅鋅超氧化物歧化? (Cu,Zn-SOD) 的作用為清除 ROS 中的超氧陰離子，由 Cu,Zn-SOD基因所表現可以推測與退化性關節炎有關。Cu,Zn-SOD在歐洲多國被使用在臨床治療肌肉骨骼發炎 (musculoskeletal inflammation)，特別是退化性關節炎的治療，具有長效的效果，因此超氧化物在退化性關節炎的生化病理方面扮演重要角色。我們觀察台灣鄒族 退化性關節炎發生率偏高，可能與關節液的 Cu,Zn-SOD 活性有關，推測因為基因的異常，或是蛋白活性異常所造成。利用自動化核酸定序儀來進行定序鄒族 58 人，對照台灣 48 人及泰雅族 20 人之 exon 序列，結果沒有發現有任何序列的改變，因此推測 SOD1 基因序列是非常保守的，可能與退化性關節炎無關。鄒族退化性關節炎比例偏高，可能是因為環境污染或是土壤重金屬污染，造成 Cu,Zn-SOD 蛋白質活性異常或有其他原因，還尚待研究。 Cu,Zn-SOD 屬同源雙體分子 (homodimer) 之抗氧化酵素，酵素活性下降時，除可能與退化性關節炎有關外，亦可能造成肌肉萎縮性側索硬化症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)。過去在E.coli SOD overexpression system中加入重金屬以干擾Cu,Zn-SOD金屬結合位置的實驗發現，環境中重金屬的污染，可能因上述機制而改變生物體內Cu,Zn-SOD的蛋白質結構，進而影響其酵素活性。因此，本研究中選擇以砷、鎘、鉻、汞和鉛這五種廣泛環境污染之重金屬元素，來觀察重金屬污染對細胞內Cu,Zn-SOD分子結構的影響。 利用大腸桿菌在相同濃度的銅和鋅來過量表現Cu,Zn-SOD蛋白，酵素活性測試則顯示，在較高濃度的砷或汞下表現的Cu,Zn-SOD蛋白，其酵素活性因重金屬濃度之增加相對減少。以感應偶合電漿原子放射光譜儀 (ICP-AES) 偵測Cu,Zn-SOD蛋白內各金屬元素含量發現，當砷或汞濃度提高時，Cu,Zn-SOD蛋白中的含銅量沒有改變；而其含鋅量則有顯著地減少。顯示重金屬影響 Cu,Zn-SOD 蛋白質之活性降低，是經由影響鋅在Cu,Zn-SOD 的結合能力。利用圓振二向色性分析二級結構的變化，發現重金屬砷或汞會造成α-helix 增加和β-sheet的減少。結合砷、鎘、鉻、汞和鉛五種金屬，在低濃度下亦會影響 Cu,Zn-SOD 的活性及改變鋅離子的結合。 本研究結果推測環境污染物多重重金屬，影響 Cu,Zn-SOD 蛋白質之活性降低，可能是因為少數重金屬的取代造成鋅的大量流失，進而改變 Cu,Zn-SOD 構型。希望本實驗能對於金屬介入分子內之可能機制，以及退化性關節炎的致病機轉提供一些新的研究方向 。
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酚類化合物廣泛存在於植物中是極為重要的植物二級化學產物。其中第二類的酚類化合物（Phenolics Ⅱ）是以C６－C３的肉桂酸（cinnamic acid）為主結構，在其苯環上帶有一個或數個氫氧基團/甲氧基團，或是利用不同的酯類去取代其基團所衍生出的各種不同衍生物。目前已知第二類的酚類化合物具有許多生理及藥裡的活性功能，黃嘌呤氧化? ( xanthine oxidase )被認為與早期的發炎反應產生ROS和造成痛風有關。先前已有第二類的酚類化合物在抑制黃嘌呤氧化?上的研究報告，而第二類的酚類化合物與酵素的結構-活性相關性(SAR)也一直被提出來討論。但是，在第二類的酚類化合物與黃嘌呤氧化?之立體化學結構上的相關性尚未明瞭。 我們在本研究中，選擇了11種不同的桂皮酸衍生物，利用DNA鬆解試驗、DPPH清除能力及ESR的技術去看這11種第二類的酚類化合物在其抗氧化、自由基捕捉能力上的表現。此外，我們探討其對於XO的抑制作用，且利用酵素動力學去探討其抑制型態進而以分子模擬技術去解釋結構-活性的關係。 我們發現咖啡酸（caffeic acid）具有最佳的自由基清除效果，推測結構中芳香環上的取代基種類及氫氧基數目與自由基清除效果有關。動力分析結果顯示屬於競爭型抑制型態，模擬時確認可以與XO活性中心對位（docking）發現桂皮酸衍生物芳香環結構可與受質結合區的苯丙胺酸（phe）914具π-π重疊力，carboxyl端的酸根（COOH）可與黃嘌呤氧化?絲胺酸（Ser）876的氫氧基形成氫鍵。對位、間位及鄰位上的氫氧基團可分別與精胺酸（Arg）880、酥胺酸（Thr）1010的氫氧基作用，除此之外間位上的氫氧基同時可與（Thr）1010 胜?鍵 （-NH-）作用形成氫鍵。 在11種化合物裡，咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester）抑制酵素活性的效果最佳，推測其芳香環上氫氧基且帶有一忌水性的苯環結構，能幫助其更容易進入到黃嘌呤氧化?之酵素活性位置。基於上述結果，利用ESR技術測量Hypoxanthine/XO反應所產生的ROS量，可以反應出待測化合物對於XO的抑制及對於所產生ROS清除活性的總體指標。結果顯示，caffeic acid及CAPE在待測的所有化合物中具有最佳的活性。
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本研究建構一個「釘板系統-黏著劑-牙根-骨塊」的三維有限元素模型，並以模型中釘板系統與黏著劑間的邊界條件為變數，計算不同邊界結合強度下釘板系統的第一個自然頻率與模態形狀。體外模態測試的結果顯示，當釘板系統的邊界條件改變時，所測得的自然頻率會有不同（p<0.01）。三維有限元素模型的模擬結果則顯示，當介面彈簧元素的彈性係數小於104 Nm-1時，釘板系統是處於完全鬆脫的狀態。而彈性係數介於104~107 Nm-1時，模型的自然頻率（6.16 kHz~15.52 kHz）會有增加的趨勢。當彈性係數大於107 Nm-1之後，則模型的自然頻率的數值達一高原期。由以上之初步結果可知，以自然頻率的變化來評估釘板系統的邊界穩定狀態，是具有可行性的。本研究亦進行細胞實驗來探討靜磁場對骨母細胞的分化促進作用。首先將MG63似骨母細胞株以強度0.1-0.4 T的靜磁場連續暴露0、12、24、48與72小時，靜磁場影響細胞增殖的作用以流式細胞技術法分析，細胞形態與基質小泡的分泌利用掃描式與穿透式電子顯微鏡加以觀察。此外靜磁場對MG63細胞表現TGF-?、第一型膠原蛋白、造骨素、鹼性磷酸酉每活性的影響亦被加以分析。細胞暴露於0.4 T的靜磁場之後造成的生長因子促生功能的影響，與細胞膜物理性質改變則被用以探討靜磁場作用機轉。本研究結果發現，MG63細胞接受靜磁場暴露之後會比控制組細胞表現出更為成熟的細胞形態與更多的分化調控因子。此外，4小時的靜磁場暴露使得MG63細胞表現出更高的螢光等向性，並在12小時後減少生長因子的促進增殖功能。這些發現顯示靜磁場會經由減少細胞膜流動性而降低生長因子促進增殖的作用，並因而改變分化早期調控因子而影響骨母細胞的成熟狀態。
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中文摘要 人工協助生殖科技為人類帶來福祉，草擬中的人工生殖法草案卻限制現無婚姻關係者使用，由於該規定不只限制了單身者的生育自主權，更涉及我們期待科技在社會中扮演如何的角色，當科技有能力影響社會時，我們希望透過規範，限制科技的使用來服膺傳統價值，還是接受科技為社會關係帶來的改變？故本研究企圖瞭解政府限制無婚姻關係者使用是否有正當理由。 我國傳統文化對於生育向來重視。在憲法第22條的架構下，凡未列舉之基本權，在不妨害社會秩序與公共利益的界線下，均受憲法保障。因此在數種生育自主權的學說中，政策自由主義的生育自主權立場認為人民有生育自主權，但政府有強制利益時，可以加以限制的立場，似與我國相當。從而在限制人工協助生殖科技的使用時，也必需考慮政府是否具有如：保護胎兒利、受術者及人工生殖子女利益或避免社會關係改變等強制利益。 我國目前院版人工生殖法草案中，企圖以「受術夫妻」取代「受術者」的用語，間接的限制現無婚姻關係者使用人工協助生殖科技，其立法理由似為保障人工生殖子女之利益及希望人民以周延的、合法的、符合社會規範價值的方式來使用人工協助生殖科技，以維護既有的社會關係。但我們認為限制現無婚姻關係者使用人工協助生殖科技，係對不孕者與現無婚姻關係者生差別待遇的行為，其目的是否正當或其手段是否可以達到其目的，則容有疑義。從大法官會議解釋或民法等現存法律觀察，其雖然重視已經締結的婚姻及家庭的完整圓滿，卻不曾對於人民在締結婚姻、組織家庭與生育子女的生涯規劃上為規範或建議；而婚姻與家庭的意義也已經變遷。其兩者對人們的感情功能日漸提升，而制度性功能降低。家庭或為養育子女所必需，但家庭的種類並非只有由婚姻為主體的核心家庭而已，也並非僅有核心家庭可以肩負養育子女的責任。而實際上單親家庭面臨困境的主要因素，係因其單親情狀發生的意外性，使現無婚姻關係者使用人工協助生殖科技，並不會使人工生殖子女蒙受不利益。 實際上，限制無婚姻關係者使用人工協助生殖科技隱含了對於單身者的歧視，同目前絕大多數對於單身者的研究，多係著重於區別單身者不願意進入婚姻的理由與差異，而非從尊重單身決定並進而以關懷、照顧單身者權益的立場，而為研究或政策決定。若以關懷及促進單身者權益的立場為出發，而立法者所關心的價值係為使受術者必需先經深思熟慮及保護人工生殖子女利益，則可以以評估、諮商及教育等方法來取代全面的禁止，則能以更溫和的方式達成政策目的。
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研究指出肺靜脈袖套管中的心肌組織可能是異位性放電點的來源，並認為肺靜脈袖套管可能會引發異位性心房纖維震顫。然而，肺靜脈袖套管是否含有節律性細胞仍不確定，心房心律不整到底由何處所引發的，還有很大的爭議，目前在動物的肺靜脈袖套管之心肌細胞的電生理研究上，並無一致的結果。肺靜脈袖套管是否會有自發性的動作電位產生，而成為異位性放電點，進而造成陣發性心房纖維震顫，仍需要再進一步探討。 在本次的研究中，利用傳統玻璃微電極紀錄法，記錄150隻狗的肺靜脈袖套管心肌細胞的動作電位。了解狗的肺靜脈袖套管細胞在不同的生理、病態狀況及抗心律不整藥物下的電生理變化。 在150隻正常健康的狗中，觀察到肺靜脈袖套管的動作電位都是快速反應的，並沒有自發性節律的活動，也沒有早期性或是延遲性後去極化現象產生。 Quinidine及d-sotalol 會使膜電位去極化並延長動作電位90%間期（APD90）。Nisoldipine及ACh會縮短動作電位間期。4-AP及isoproterenol也會縮短APD90，但是卻會增加動作電位第2期。這些藥物的作用在狗的左心房及肺靜脈袖套管中都相同。Adenosine 使狗的肺靜脈袖套管及左心房細胞動作電位的縮短不明顯，但是卻可以明顯的縮短天竺鼠心房細胞的動作電位。 在 1 mM isoporterenol中，變換刺激的頻率從0.5到1 Hz，或是停止10 mM ACh的給予，或是加入8 mM的鉀離子，可以引發彈回現象，產生一短暫性的誘發性動作電位。 在停止灌流或是模擬缺氧的情況下，靜止膜電位及最大去極化速度會減少，動作電位間期及振幅也會縮短，但是無法產生誘發性節律。低溫（20-22℃）則會造成動作電位間期的延長及再極化的現象產生。 狗的肺靜脈袖套管在0.1 mM的鋇離子濃度下，只會造成舒張期去極化，但是並不會引發自發性節律，而舒張期去極化的現象可以被cesium所抑制。在1 mM的鋇離子中，會使22隻狗的肺靜脈袖套管引發舒張期去極化及自發性節律的產生，但是在11隻狗中，只有引發3隻狗的左心房細胞產生自發性節律。在1 mM鋇離子中，nickel只能輕微的抑制舒張期去極化的現象，但是cadmium及verapamil卻可以完全抑制自發性節律的現象。在含有鋇離子及isoproterenol中，停止給予ACh，同樣也可以引發彈回現象的產生。在鋇離子引發的自發性節律中，ryanodine（2 mM）在初期加入時，會使自發性活動產生短暫性的增加，之後則會造成很明顯的抑制。 在正常生理狀況下，狗的肺靜脈袖套管心肌細胞並不會有不正常的節律活動出現，抗心律不整藥物在肺靜脈袖套管與左心房的作用相同。而在病態的情況下，則可以引發自發性及誘發性節律，這些引發的節律活動則是與細胞內鈣離子過多有關。而在鋇離子之下，狗的肺靜脈袖套管比左心房的心肌細胞較容易引發自發性節律。
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周邊組織以骨骼肌為主，約佔總體重的40%，包含著複雜且有效率的精密細胞骨架。橫紋肌的肌原纖維是由許多稱為肌節的基本結構單位所構成，肌節也是負責肌肉收縮的基本功能單位。肌節除了以肌凝蛋白質為主的粗肌絲與以肌動蛋白質為主的細肌絲之外，肌節尚包含第三種肌絲，即彈性蛋白質titin (也稱為connectin)。在自然界，迄今被鑑定出來的所有蛋白質，titin是最大的蛋白質(分子量為3000-4000 kDa)。單一titin分子延伸半個肌節，其N端埋入Z線之中，其C端則位於M線上。Titin的主要功能為產生被動張力和維持橫紋肌的肌節結構。Nebulin (又稱為第三帶蛋白質)是另一巨大的肌原纖微蛋白質(分子量為600-900 kDa)，其纏繞著整個細肌絲而形成骨骼肌的第四種肌絲。目前認為nebulin為蛋白質尺規，以維持細肌絲長度的穩定，並且在訊息傳遞和收縮調節作用方面扮演著重要的角色。 近來，科學家正在研究起因於肌原纖維蛋白質的改變而造成的骨骼肌病變之生理病理學，以及探討肌原纖維蛋白質在肌肉結構和活性的重要性。由於titin與nebulin在調節肌節的結構和功能上是不可或缺的角色，因此可能和骨骼肌疾病有所牽連。然而，截斷神經引發肌肉萎縮的效應對肌肉內titin與nebulin的影響仍不清楚。為此目的，我們以截斷坐骨神經而引起脛前肌萎縮作為動物實驗模式，並檢測骨骼肌之肌原纖維蛋白質的改變情形，特別是深入探討titin、nebulin、肌凝蛋白質重鏈和肌動蛋白質等四種肌原纖維蛋白質的變化情形。 首先，由於肌動蛋白質、肌凝蛋白質重鏈、nebulin和titin四者的分子量範圍差距很大(從42到4000 kDa)，很難同時在同一片微小膠體上作分析，因此我們研製一套改良式的微小膠體，以達到快速偵測骨骼肌之肌原纖維蛋白質的目的。方法是藉由一個塑膠針筒取代市面上販售的漸層鑄膠器，建立一套具有模糊界面的梯度漸層微小膠體，經由膠體染色和免疫轉漬的方法，顯示四種肌原纖維蛋白質可以成功地被分離和進行免疫點墨分析。此套微小膠體系統具有容易製備且易於與操作之優點，乃為ㄧ個值得信賴的方法，可以提供分析肌原纖維蛋白質或是其他具有大範圍分子量的蛋白質混合物。 許多研究指出萎縮肌肉出現被動張力減弱且肌節排列不規則的現象。然而，在截斷神經之後titin的變化仍未被探討。因此我們應用研發的微小膠體以進行電泳和免疫螢光染色，以檢測大白鼠的對照組和截斷神經組之脛前肌內titin含量與型態變化。依據我們的數據顯示，截斷神經組肌肉內的titin與肌凝蛋白質重鏈比值(titin/MHC)以及titin與肌動蛋白質比值(titin/actin)明顯地減少。截斷神經後的titin含量和肌凝蛋白質重鏈與肌動蛋白質比較起來，呈現較大程度的降解。另外，分別以電子顯微鏡與免疫螢光等方法，以檢定肌節的超微構造與靠近Z線的titin表型變化。型態學的觀察顯示截斷神經組肌肉的肌原纖維呈現不規則排列以及titin表型發生轉位的現象。歸納我們的結果推測截斷神經之後titin的蛋白質裂解作用較肌凝蛋白質重鏈與肌動蛋白質更為敏感，並且，截斷神經組肌肉之titin的衰微，可能因而造成titin為主的肌節結構不完整。 此外，我們在也探究截斷神經效應對nebulin改變情形，利用自製的微小膠體以進行電泳，以定量大白鼠的對照組和截斷神經組之脛前肌內nebulin、肌凝蛋白質重鏈、肌動蛋白質和titin的變化。我們的數據顯示，在截斷神經之肌肉組的nebulin以時間依賴性的型式減少，特別是在截斷神經的二十八天與五十六天之後，和對照組之肌肉比較，截斷神經組之肌肉的nebulin分別地明顯減少24.6%與40.2%。Nebulin與肌凝蛋白質重鏈比值(nebulin/MHC)、nebulin與肌動蛋白質(nebulin/actin)以及nebulin與titin比值(nebulin/titin)均顯著地下降，顯示在萎縮之肌肉組內，nebulin降解的速度比肌凝蛋白質重鏈、肌動蛋白質與titin的降解速度更為快速。我們推測nebulin的降低可能影響截斷神經引起的棄用型萎縮之肌節重塑作用。然而仍有待後續的研究以明瞭確實的機制。 本論文為有意義的實證表示巨大的肌原纖維蛋白質titin與nebulin較肌凝蛋白質重鏈與肌動蛋白質對截斷神經效應更為敏感，以及更瞭解titin與nebulin在萎縮肌肉的重要角色。而且，我們推測若是延緩titin與nebulin的降減作用將可作為骨骼肌萎縮症的治療介入之考量。
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樟芝 (Taiwanofungus，學名Taiwanofungus camphoratus)為台灣特有的真菌類，具有抗發炎、抗氧化、血管舒張以及抗B型肝炎病毒等生理活性，然而，其詳細抗發炎成分與機制尚未明確。在本研究論文中，我們使用野生型樟芝、液態培養樟芝和固態培養樟芝的冷水、甲醇和熱水三種萃取物，並檢驗它們在微小膠質細胞中的抗發炎作用，並進而探討樟芝萃取物對於預防腦部退化性疾病的產生可能扮演的角色。微小膠質細胞為腦中的免疫細胞，扮演著監控與防禦的角色。然而活化的微小膠質細胞會大量表現誘生型一氧化氮合成? (inducible nitric oxide synthase, iNOS)並使iNOS的代謝物一氧化氮 (NO) 大量產生，iNOS和NO的生合成對於發炎反應和腦部退化性疾病的形成扮演重要的角色。首先，以不同濃度及種類的樟芝萃取物處理EOC13.31微小膠質細胞，再以脂多醣 (LPS)和干擾素-? (IFN-?)誘導EOC13.31微小膠質細胞發炎，並偵測iNOS的表現。西方點墨法及反轉錄-聚合?連鎖反應顯示，在EOC13.31微小膠質細胞內，野生型樟芝、液態培養樟芝和固態培養樟芝的冷水、甲醇和熱水萃取物皆可抑制LPS和IFN-? 所誘導的iNOS蛋白質和mRNA表現；然而，在我們所測試的九種樟芝萃取物中，野生型樟芝甲醇萃取物抑制效果最明顯，且隨著濃度增加其抑制iNOS和TNF-?表現的效果越顯著。另外，我們進一步證實由野生型樟芝甲醇萃取物中分離出的CKJ-35-2抑制LPS和IFN-? 所誘導的iNOS蛋白質表現的效果最顯著。為了確認其中的抑制機轉，西方點墨法之結果顯示野生型樟芝甲醇萃取物可抑制EOC13.31微小膠質細胞內LPS和IFN-? 所誘導p-STAT1 (signal transducer and activator of transcription-1)、p-ERK (extracellular signal- regulated protein kinases)、p-JNK (c-Jun NH2-terminal protein kinases)的活性，除此之外野生型樟芝甲醇萃取物也可抑制 I?B??(inhibitor ?B?)的降解和p-I?B?的活性。當我們改以?-Amyloid (25 ?M)刺激細胞發炎時，野生型樟芝甲醇萃取物同樣隨濃度增加而抑制iNOS表現的效果越顯著。綜合以上結果，證實樟芝甲醇萃取物為一種抗發炎物質，可有效抑制腦部微小膠質細胞中iNOS和TNF-?的表現，進而抑制微小膠質細胞發炎的情形。此篇研究報告結果顯示樟芝萃取物調節iNOS的特性也許在預防腦部細胞的發炎反應及腦部退化性疾病的形成扮演重要的角色。
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A型肉毒桿菌素近年來在皮膚美容科學中被用來治療臉部皺紋，甚至成為患者接受度最高的微侵入性治療。最近在臺灣陸續有醫師發現在真皮層內注射肉毒桿菌素，也就是中胚層治療(mesotherapy)方式，能讓患者達到皮膚光亮、色素斑改善、毛孔縮小與緊實皮膚的效果。我們嘗試研究真皮層內注射A型肉毒桿菌素，在天竺鼠與自願人體臉部所造成的生物變化。人體實驗部份為雙盲實驗，共8位患者，左右臉同時分別為實驗組與對照組，以真皮層內注射方式施打A型肉毒桿菌素與生理食鹽水後追蹤16週。利用多探頭皮膚生理分析儀(Multi Probe Adapter) 、Visia?系統與傳統照相系統，每4週記錄一次皮膚出油與濕潤度變化、皮膚皺紋、色素等質地的改變。另外在實驗前、後分別取自願者左右臉頰皮膚組織以一般染色與特殊染色來研究皮膚內變化。動物實驗利用5隻雄性天竺鼠，於其背部左右邊分別施打生理食鹽水與A型肉毒桿菌素，每2週取皮膚切片以一般染色與特殊染色來研究皮膚內變化。實驗結果發現臨床上所有受試者與不知情醫師都明顯感受到受試者本身與傳統相片紀錄中，實驗組與對照組的臉部細紋、動態皺紋與皮膚膚質差異。另一方面，組織切片染色下可見注射A型肉毒桿菌素組的膠原蛋白增生與原膠原蛋白增加。多探頭皮膚生理分析儀與Visia?系統的數據也有左右差異，包括出油量減少、皮膚皺紋改善。最後，我們利用黑色素細胞癌細胞株B16F0來研究A型肉毒桿菌素的細胞作用，結果發現A型肉毒桿菌素在生體外會干擾黑色素的生成。本實驗結果顯示，真皮層內注射A型肉毒桿菌素或許可以成為反轉老化現象的有效治療之一。
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鈷 (cobalt)為環境汙染物，並被國際癌症研究署 (International Agency for Research on Cancer, IARC)列為Group II B的致癌物質，其可造成多種肺部疾病且導致肺部上皮細胞纖維化的發生，而細胞凋亡則是在纖維化發生前之重要步驟，在許多細胞實驗中發現，氯化鈷 (cobalt chloride, CoCl2)可造成細胞凋亡，其中包括HIF-1a、P53、ROS大量表現及粒線體膜電位去極化等等，而其凋亡機制仍有待探討。本論文利用人類上皮肺癌細胞株 (non-small cell lung cancer, H460)進行實驗，企圖探討氯化鈷對H460所造成的細胞毒性及凋亡機制。實驗結果發現，氯化鈷對H460造成time- and dose-response且caspase-dependent之細胞凋亡，其中，粒線體膜電位沒有去極化現象，細胞內的H2O2顯著上升但NAC無法降低凋亡的比例。另外，氯化鈷可誘導細胞內P53及HIF-1a大量表現、YY1表現量降低及DAPK活化。FK506—calcineurin inhibitor，可抑制DAPK活化及P53表現，對細胞凋亡亦有顯著的抑制效果。推測氯化鈷經由誘導P53大量表現及DAPK活化而造成細胞凋亡。 關鍵字: 鈷，氯化鈷，calcineurin，caspase，DAPK，FK506，HIF-1a，P53，ROS，YY1