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人類食道癌組織p16, Rb 抑癌基因及端粒脢活性的研究及其與檳榔的關係

摘要 目前台灣地區嚼食檳榔的人數逐漸增多，在動物實驗或人類的研究報告，檳榔是一種強力的致癌物；在動物實驗也證實檳榔可導致舌癌、口腔癌、食道癌、肝癌、肺癌及胃癌等。台灣本土的公共衛生研究發現，台灣2100萬人口中，約200萬人是現在或曾經嚼食檳榔的紅唇族。有關檳榔與食道癌的研究並不多，但是目前對於食道癌癌化過程模式是如何、檳榔是如何影響食道癌癌化過程，而抑癌基因P16及Rb變異方式及端粒脢和端粒脢活性對食道癌所扮演的角色之探討則更是少有報告。 P16基因位於9q21位置上，其基因蛋白質p16會與細胞周期所依賴的酵素cdk4結合，而阻斷細胞周期由G1期移行到S期。Rb基因位在染色體的13q14上，為一種110kDa的核蛋白，這種核蛋白可依被磷酸化的狀態，在細胞週期G1期的控制檢查點上表現和控制。 最近的研究發現，染色體末端的telomere(端粒)片斷長度和細胞能否長久存活，或驅向老化、死亡有關。而端粒長度的維持，有賴telomerase(端粒脢)這種酵素的作用，它藉著合成telomeric DNA來補充染色體末端的長度，造成細胞的癌化及不死化。人體內，端粒脢這種酵素在一般的體細胞是呈不活化狀態，因此一般體細胞均有一定的壽命，當它們經過一定數目的複製分裂，便會因為端粒太短而造成細胞不穩定狀態而死亡。然而端粒脢於一些腫瘤組織及不死化細胞株被發現有80%以上是活化狀態，是以體細胞內端粒脢這種酵素的激活化被認為可能是細胞癌化及不死化的重要因子。 本研究以人類食道癌進行研究，分為二部分，第一部分探討P16及Rb抑癌基因的突變情形，及分析檳榔、菸、酒是不是在其中扮演某種角色。本研究共有33位病人經檢查為食道癌病人（男31名，女2名，平均年齡57歲），取其開刀或內視鏡檢查時夾取之食道癌病變組織及正常組織，分別標示後馬上以液態氮冰凍並放入-80?C冰箱保存。經萃取DNA並經聚合脢連鎖反應(PCR)分析(p16)及聚合脢連鎖反應-單股結構多形性分析PCR-SSCP(Rb)。 第二部分共取24名 (男21名、女3名；平均年齡58.6歲) 經內視鏡檢查及病理組織切片檢查証實食道鱗狀細胞癌的病人，所有的病人在開刀後立即取出食道癌組織及週邊正常組織並分別抽取組織蛋白質，同時我們也取7名Barrett’s食道症病人的組織，應用TRAP(telomereic repeat amplication protocol)方法增幅，且用酵素免疫呈色法(ELISA)來測定食道癌或正常組織中端粒脢酵素的活性，同時也應用美國羅氏公司LightCycler聚合脢連鎖反應儀同步定量RT-PCR產物，分析食道癌組織中，端粒脢及端粒脢相關RNA(hTR，hTERT)表現的情形，並比較檳榔、菸、酒與食道癌之相關性。 結果發現: 1) 並未發現有P16基因不正常甲基化(methylation)之情形；而聚合脢連鎖反應(PCR)、聚合脢連鎖反應-單股結構多形性分析PCR-SSCP法探討Rb基因突變上也未發現有明顯的異常。故本研究第一部分結果顯示抑癌基因P16及RB基因在食道癌組織並無顯著變化及和煙、酒、檳榔間並無相關。 2) 端粒脢相關RNA(hTERT)之陽性率為83.3% (20/24)；而正常部分之陽性率為16.7% (4/24)(p<0.0001)呈有意義的差異。若分析病人抽煙、喝酒及嚼食檳榔等三個因素，其端粒脢相關RNA(hTERT)之相關與上述三個習慣有無來比較則發現沒有顯著的差異。(Logistic Regression test) 3) 在Barrett’s食道症這個癌前病變的七個病人當中，病灶區之端粒脢相關RNA(hTERT)之陽性率為85.7%(6/7)，而正常區的端粒脢相關RNA(hTERT)之陽性率為100% (7/7) (p= 0.6547)。 故本研究結果顯示抑癌基因P16及Rb基因在食道癌組織並無顯著變化及和煙、酒、檳榔間並無相關。以端粒脢相關RNA (hTERT)來表示端粒脢之活性結果發現在食道癌部分的活性顯著較正常部分來得高；而分析病人有抽煙、喝酒及嚼食檳榔等三個因素，其端粒脢相關RNA(hTERT)之相關與上述三個習慣的有無來比較則發現沒有顯著的差異。在Barrett’s食道症病人方面其病灶區之端粒脢相關RNA (hTERT)與正常部分則沒有顯著差異。所以端粒脢及端粒脢相關RNA (hTR，hTERT)在食道癌癌化過程中可能扮演著重要的角色。

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低劑量砷及中波紫外線對角質細胞凋亡的交互作用

砷引起的波文氏症大部分出現在皮膚的非光照部位，此外，過去的實驗顯示中波紫外線的照射會抑制波文氏症病灶的增生。因此，中波長紫外線對砷的致癌性可能有調控的作用。本實驗的目的是研究低劑量砷及中波長紫外線對培養角質細胞的細胞週期、凋亡、和p53、p21Cip1/WAF1、及Bcl-2/Bax蛋白質的作用及低劑量砷及中波長紫外線兩者對上述作用的交互影響。培養的角質細胞以砷化鈉1微莫耳合併中波長紫外線50 mJ/cm2作各類的處理，包括正常組、只加砷(As組)、只照射中波長紫外線(UVB組)、先加砷再照射中波長紫外線(As-UVB組)、先照射中波長紫外線再以砷處理(UVB-As組)。細胞週期分析及的結果發現所有有處理組均產生S期遲滯；而含溴尿苷酸攝取(BrdU uptake)的結果發現As-UVB組和UVB-As組有生長遲滯的現象。以TUNEL方法偵測凋亡發現As-UVB組、UVB組、UVB-As組都有凋亡的現象，而最高的凋亡率出現在UVB-As組。西方墨點分析的結果發現p53出現在As-UVB組，其他組沒有發現。p21Cip1/WAF1在所有實驗組都有上昇的現象，並且以As-UVB組最明顯。Bcl-2在UVB組、As-UVB組和UVB-As組都有下降的現象，且以As-UVB組和UVB-As組最明顯。在As-UVB組中增加的p53與解釋角質細胞的生長遲滯多於凋亡有關。而在UVB-As組中p21Cip1/WAF1的上昇和Bcl-2的下降可能和角質細胞的凋亡有關。不管是先加砷或後加砷合併中波長紫外線照射都有造成角質細胞生長抑制和凋亡的效果，這可以解釋皮膚砷癌多出現在非光照部位的原因，以及提供中波長紫外線照射對砷有關之波文氏症的治療機轉。

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大鼠高眼壓模式之建立－眼壓上升機制及對眼球影響的研究

目的：比較兩種方法在大鼠製造慢性高眼壓和眼球內之病理變化，並釐清其機制。 材料與方法：六十二隻Lewis大鼠的一眼當成是控制組，另一眼則分別利用電燒(GC組)或是血管結紮(GT組)3條深部上鞏膜靜脈來製造高眼壓，在3個月的期間內評估眼壓，視網膜神經節細胞密度，眼球內的病理變化，並探討細胞死亡機制。利用循血綠做深部上鞏膜靜脈的血液流動研究。 結果：GC組或是GT組均可達到3個月的穩定高眼壓，並造成視網膜神經節細胞數目的逐漸減少，細胞是經由細胞凋零途徑而逐漸死亡，眼球內整體的葡萄膜組織會充血。GC組還發現有眼球內炎，隅角周邊前黏連和外側視網膜萎縮。前房內注射循血綠會出現在深部上鞏膜靜脈的遠端，注射到深部上鞏膜靜脈則會在葡萄膜組織見到其分佈。 結論：血管結紮法與電燒法都可達到類似的結果，但併發症較容易出現在電燒組，因此血管結紮法是較為理想的方法，而變得狹窄的隅角是誘發在阻塞深部上鞏膜靜脈後所致眼壓上升的原因。

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探討遮蔽劑輔助準分子雷射角膜切除術治療角膜不規則表面之效果

研究目的：本實驗之研究目的，在於探討利用準分子雷射角膜切除術（PTK）所使用遮蔽劑對角膜不規則表面之矯正效果，以及遮蔽劑之物理性質測定、臨床使用之觀察，並探討和矯正效果之關聯。 研究材料及方法：本實驗研究6種遮蔽劑及3種素材所形成之標準化不規則表面，6種遮蔽劑包括0.9% Saline solution、0.3% Methylcellulose、1% Methylcellulose、Tear Naturale®、1% Sodium hyaluronate 及Collagen。3種素材包括黑色相片紙、PMMA板及豬眼球角膜，在此3種素材上製造標準化之不規則表面。觀察記錄遮蔽劑在準分子雷射下之變化，並比較6種遮蔽劑輔助準分子雷射角膜切除術於3種素材上去除不規則表面之效果。 研究結果：實際觀察顯示0.9% Saline solution、0.3% Methylcellulose、1% Methylcellulose、Tear Naturale，在準分子雷射中不論在任何素材上均容易產生氣泡，影響PTK之進行。直接觀察去除黑色相片之不規則表面之效果，6種遮蔽劑之效果都不理想，殘留表面皆不均勻。以剖面儀測量6種遮蔽劑使用於去除PMMA板不規則表面（n = 6），不使用遮蔽劑粗糙度平均值Ra為 13.94 ±0.63 μm，與標準不規則表面（Ra = 14.98 ±0.64 μm）比較下，沒有去除不規則表面之效果（p = 0.127），0.9% Saline solution之Ra值為10.34 ±0.49 μm、0.3% Methylcellulose之Ra值為10.87 ±1.11 μm、1% Methylcellulose之Ra值為9.52 ±2.19 μm、Tear Naturale之Ra值為10.06 ±1.42 μm、1% Sodium hyaluronate之Ra值為7.39 ±1.78 μm 、Collagen之Ra值為8.72 ±1.09 μm，顯示6種遮蔽劑雖然皆有去除不規則表面之效果（p <0.05），但殘餘之表面和原本未經處理之PMMA板之粗糙度（Ra值0.04 ±0.01 μm）相比則顯示仍粗糙（p < 0.05）。對於豬眼球角膜不規則表面，利用掃描式電子顯微鏡比較6種遮蔽劑之效果（n = 6），將表面平滑程度分程Grade I 最不平滑、Grade II 不平滑、Grade III平滑，在6種遮蔽劑中以Collagen 之效果最好：有1個Grade II及5個Grade III，其次是1% Sodium hyaluronate：有2個Grade II及4個Grade III，其餘之遮蔽劑則不佳。 結論：黑色相片紙模式容易觀察雷射下之變化，但有雷射發數之限制；PMMA板模式容易數據化，但為平面式且雷射切削率與角膜組織有差別；豬眼球模式則是最佳之in vitro模式，也是最可以信賴之模式，Collagen於本研究當中，是準分子雷射角膜切除術去除豬角膜不規則表面時所使用的遮蔽劑中，可以形成最平滑表面的遮蔽劑。