清華大學化學系所學位論文
國立清華大學,正常發行
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中文摘要 本論文的研究目標為發展微脂球免疫分析型之可拋棄式電化學生化感測器。由於未來希望將此系統發展成快速檢驗大腸桿菌 O157:H7 與其毒素－類志賀毒素 2 (shiga-like toxin 2) 的生化感測器，因此系統必須具有成本低、容易使用、可攜帶性且有足夠的靈敏度。偵測速度快且具有高靈敏度的電化學偵測法被選為本系統的分析基準。本篇論文的第一部份選用鉛筆筆芯作為可拋棄式工作電極，基於其成本低、體積小、取得容易，極適合大量製造檢測電極。經抗體修飾流程之最佳化後，以生物素 (biotin)，也就是維生素 H，作為本研究的分析物。包裹電化學物質－亞鐵氰化鉀 (potassium ferrocyanide) 且表面連接有生物素的微脂球則作為該感測系統之訊號放大器。本研究利用生物素與修飾有生物素的微脂球競爭筆芯電極表面有限的生物素抗體，成功發展出生物素拋棄式電化學生化感測器，該感測系統對生物素的偵測極限為 2.44 ng (相當於 200 uL 的 50 nM 之生物素溶液)，線性範圍為 10-8~10-4 M。 論文第二部份以開發免疫偵測平台技術。利用可拋棄式的網版電極，分析腸出血性大腸桿菌 O157:H7 所分泌的類志賀毒素 2。該類毒素會先與嵌有 GM1 (monosialotetrahexosylganglioside) 的微脂球進行特異性結合，接著與電極表面上的毒素抗體形成免疫複合物。在低壓下打破連接在電極上的微脂球，再以高靈敏度的方波伏安法 (square wave voltammetry) 偵測從球體空腔中釋放出來的亞鐵氰化鉀。修飾在電極表面的金奈米棒可以促進溶液與工作電極間的電子傳輸，使得此分析系統對類志賀毒素 2 之偵測極限可以達到 0.33 femtomole (相當於 3 uL 的 7.52 ppb 之類志賀毒素 2 溶液)，線性範圍為 7.5~750 ppb，對於每一次的樣品偵測只需極少的樣品量 (3 uL)，且僅需時 15 分鐘。
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摘要 自工業革命以來，人類社會對能量需求大幅提升，工業的發展以及交通的運輸，均產生大量溫室氣體，如二氧化碳以及氮氧化合物等。這些溫室氣體不僅造成了溫室效應，也產生海水酸化問題，嚴重影響地球的生態，因此減少大氣中二氧化碳的含量是一重要的課題。本研究利用二氧化鈦奈米粒子，光催化二氧化碳還原為甲醇，並以層接層 (Layer-by-Layer) 的方式，和二氧化矽在聚酯基材上形成多層複合薄膜，以此薄膜進行光催化反應。研究中以掃描式電子顯微鏡、飛行時間式二次離子質譜儀以及接觸角量測儀，鑑定奈米多層膜的特性，研究結果指出，第一層粒子的吸附能力以及基材表面的平整度會影響整體密度，且多層膜結構中不同粒子並未獨立分層，而是有部分混雜的情形。此外奈米多層膜的親水性，會隨著鍍膜層數增加而提升，當層數達到六層時，接觸角可降低至僅有5°，表現出超親水的特性。在二氧化碳還原反應中，我們利用自行架設的光反應器暨線上分析系統，分析二氧化碳光還原的產物。實驗結果顯示，當鍍膜層數在八層以下時，鍍膜層數愈多催化效率愈好，得到甲醇的產率愈高，最高可達到9.7 µmol。
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多溴聯苯醚(PBDEs, Polybrominated diphenyl ethers)係廣泛使用在高分子材料中的溴化阻燃劑，有對人體造成潛在危害之疑慮，歐盟於2006年7月1日起，限制所有輸入歐盟的電子/電機產品，多溴聯苯醚(不含十溴)的含量不得超過0.1%。檢視國際電工委員會擬定之高分子材料中多溴聯苯醚檢測方法草案，因使用稀釋作為前處理步驟，需用到相當多量之標準品，不僅提高分析成本負擔，亦有使用過量有害物質之缺點。因此本研究擬發展一可同時降低基質干擾與減少標準品用量之淨化前處理方法應用於高分子材料中多溴聯苯醚之檢測。研究中針對樣品顆粒大小、萃取溶劑及分析儀器等參數，利用變異數分析及t檢定確認上述變因對實驗結果的影響。當樣品顆粒小至0.5 mm，分別以二氯甲烷/環己烷(5:25)萃取聚丙烯，以正丙醇萃取聚酯樹脂，會得到較好之結果，顯示選擇溶劑的必要性；實驗室內使用三種不同氣相層析質譜儀 (Agilent 6890/5973、Agilent 6890B/5975N及Varian 4000 GC/MS/MS)分析同一樣品，基於儀器間基本架構及對高溴數聯苯醚偵測能力不同之因素，亦對分析結果造成影響。方法準確性的評估，則係與另一使用舊版IEC方法/高質量範圍氣相層析質譜儀的TAF認可實驗室，進行實驗室間比對，分析真實基質樣品，其結果相當良好；參與28家實驗室間比對，分析模擬樣品， z-score值均落在小於2的範圍內，顯示本方法的適用性。 本研究亦針對幼稚園、辦公大樓及電影院等三處公共場所共八點次調查室內空氣中多溴聯苯醚之濃度，濃度範圍為46.2~261.0 pg/m3，平均值為109.6 pg/m3。若以地點來分，濃度高低依序為幼稚園(69.9~261.0 pg/m3，平均值為141.1 pg/m3)、辦公大樓(88.8~166.5 pg/m3，平均值為117.1 pg/m3)及電影院(46.2、55.6 pg/m3，平均值為50.9 pg/m3)。與國外文獻相較，本研究調查所得之結果均較大多數歐美國家低，只略高於科威特。而跟商業化阻燃劑做比對後，發現部分樣品與八溴商業化阻燃劑有強烈之相關性。
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第一章節緒論中我們提及，目前世界面臨流感病毒威脅日趨嚴重，其中最令人擔憂的為禽流感病毒(avian influenza) H5N1。科學家發現流感病毒感染細胞的第一個步驟，即為流感病毒鞘膜醣蛋白(envelope glycoprotein) 的血球凝集素(haemagglutinin, H)，先和宿主細胞(host cell)表面的三醣體化合物透過電荷作用(charge interaction)而靠近，進而進入宿主細胞內進行一連串的生物機制：複製核醣核酸(RNA)和病毒所需要的蛋白質，最後病毒穿出宿主細胞導致細胞破裂死亡。因此科學家目前正致力於研發出更有效率的藥物，以對抗流感病毒。 接著，我們將在第二以及第三章節中，分別探討三醣體三個單醣的保護化學以及醣鏈結反應。而第四章節則是整理目前文獻中所提及的一鍋化醣鏈結反應。 最後說明實驗目標以及結果。我們希望能夠透過一鍋化選擇性保護的方式，快速的合成各種不同的單醣建構單元，在結合一鍋化醣鏈結的反應，快速的合成出三醣體化合物42。接著再利用試劑做葡萄胺醣(glucosamine)上二號位置氮的官能基轉換，以合成不同的三醣體化合物38、39、40和41，最後進一步做生物活性的探討，期許這樣的成果在未來能夠有助於藥物的開發。
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細胞表面的醣共軛分子對於細胞間之訊息傳遞1佔有重要地位，目前已有許多研究表示細胞表面之醣共軛分子與病毒入侵人體或惡性腫瘤增生機制有關，藉由化學合成細胞表面之醣共軛分子可幫助建立生物體內細胞間作用機制。這些細胞表面醣共軛分子是由各種單醣體連接組合而成，例如：葡萄醣(glucose)、艾杜醣(idose)、半乳醣(galactose)、甘露醣(mannose)…等等，單醣體再以不同位置之羥基(hydroxyl group)兩兩相接，並有不同的立體位向選擇性，然而每個單醣分子上都具有多個羥基，所以羥基的選擇與位向的控制是醣化學領域最重要的課題之一。 本篇論文著重於甘露醣的相關研究，專注在位向選擇性一鍋化保護及醣鏈結反應方面的探討。目前關於甘露醣合成的研究仍有一些問題尚待突破，例如：(1) 縮醛保護反應(2,3-縮醛與4,6-縮醛的保護的選擇性)；(2) 2,3-縮醛的立體位向選擇性(exo和endo)；(3) 醣鏈結反應的位向選擇性。本論文利用化合物113為起始物，使用醛類保護基得到2,3和4,6-二縮醛甘露醣115 (產率94%)，並在2,3-縮醛(5環縮醛)中有不錯的位向選擇性(exo/endo = 99/1)，接著進行選擇性開環反應，並結合兩者而成功地發展出一鍋化選擇性保護反應。最後進行醣鏈結反應的研究，得到α位向的甘露醣衍生物。論文中針對縮醛反應的不同條件(例如：溶劑、催化劑、溫度以及試劑當量數的不同)對反應所造成的影響去探討，並說明縮醛產物位向的鑑定方法，還有醣鏈結反應產物的位向鑑定方法。初步研究的結果，相信對未來甘露醣的合成研究有不錯的幫助。
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本實驗的主要目的是要了解2 Methyl Naphthalene被釹釔鋁石榴石雷射(Nd-YAG laser)四倍頻所產生的266nm光子激發後，受激發的2 Methyl Naphthalene藉由放出螢光回到電子能階基態、或經由內轉換（internal conversion）到電子基態以及由系統間跨越（intersystem crossing）到三重態（triply state）的量子產率，並研究以2 Methyl Naphthalene當作產生高振動能分子的可能性。實驗裝置是將兩個有布魯斯特窗(Brewster window)且內部塗覆石墨（Aerodag G）及放置阻隔板(baffle)的不鏽鋼管臂(arm)與經由陽極處理的鋁製腔體組合成為一個擁有30公分的光徑的真空腔體。把2 Methyl Naphthalene放置於玻璃管中，使用銅管將玻璃管與腔體做適當的連結。實驗時，利用玻璃管的塞子(cock)來控制2 Methyl Naphthalene在腔體中的數量。並將雷射導進管臂，在雷射進入管臂前用感光二極體(photodiode)監測雷射強度，雷射離開管臂後用另一個感光二極體偵測雷射變化量，在腔體正中央垂直方向放置光電倍增管(photo multiplier tube)收集2 Methyl Naphthalene所放射出的螢光或Biacetyl的感應磷光（sensitized phosphorescence）。在光電倍增管的前方，先裝設了可以反射雷射光波長的反射鏡再加上濾光片(filter)來減少散射光的干擾。實驗的操作是利用管臂前後的光電二極體測得雷射強度的減少，以已知的壓力與管臂長度計算出2 Methyl Naphthalene的吸收截面(absorption cross section)，再將已知螢光量子產率的萘(naphthalene)做為標準，除去壓力及吸收截面的因素，來比對光電倍增管訊號大小進而求得螢光量子產率。相似地，我們在光電倍增管前多加一片濾光片過濾掉待測分子的螢光訊號，藉由放入Biacetyl 淬熄（quench）經由系統間跨越到三重態的分子，偵測Biacetyl放射出的磷光與Biacetyl壓力的變化。再一次將萘做為標準，算出受激發的分子經由系統間跨越到三重態的量子產率。量測得到2 Methyl Naphthalene的吸收截面為3134.5±300M-1cm-1、螢光量子產率為8.51±0.86%、系統間跨越到三重態的量子產率為85.66±12.96%，扣除上述途徑得內轉換到電子基態的量子產率為5.83±12.99%。最後用飛行時間質譜測量高、低振動能2 Methyl Naphthalene的比例，作為是否適合當作高振動能分子束的判斷依據。
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本論文主旨在以飛秒雷射激發–探測多光子游離法結合飛行時間質譜技術研究氣相中胞嘧啶（cytosine）與其水合團簇（cluster）在激發態的動態學。我們以266 nm的飛秒雷射脈衝將分子激發至電子激發態，之後利用另一道800 nm的探測飛秒雷射在不同的時間延遲下將激發態游離並且以一具飛行時間質譜儀（time-of-flight mass spectrometer, TOFMS）偵測。 cytosine的瞬時光譜呈現雙指數衰減（τ1 = 0.7 ps, τ2 = 5.1 ps），我們初步認為較快的衰減時間常數為cytosine在S1(ππ*)時經過分子內振動能量重新分配（intramolecular vibrational energy redistribution, IVR）的過程；較慢的衰減時間常數為分子越過一個由ππ*和nNπ*位能面相交而產生的能障。當cytosine與一個水分子錯合後，被激發到激發態的弛緩時間常數比未錯合時快了10倍左右（τ= 450 fs）；與兩個水分子結合後，在激發態的弛緩時間常數又快了兩倍左右（τ~ 200 fs），對此我們提出了一些可能的解釋。較大的水合團簇在cytosine-(H2O)n≧4時出現了一個數十ps的衰減部份，我們推測在n≧4的某個大小之團簇會產生激發態質子轉移（proton transfer），亦即被激發後N上的H原子產生酸性，加上水分子團簇到達足夠的質子親和力（proton affinity）後，質子轉移因而可以發生。
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黃嘌呤氧化酶( xanthine oxidase ; XOD ) ，分子量約為290kDa，為一同相二聚體(homodimer)，為代謝黃嘌呤(Xanhine)與亞黃嘌呤(hypoxanthine)成為尿酸的主要酵素，而尿酸過高易引起痛風及並其併發症狀，目前以異位次黃嘌呤(allopurinol)為黃嘌呤氧化酶之良好抑制劑而作為治療痛風的主要藥物。研究黃嘌呤氧化酶之反應動力學與催化作用，有助於更精確的掌握投藥量與開發更有效之藥物。 早期研究認為黃嘌呤氧化酶兩個單體間之催化行為是各自獨立，不受彼此影響。本研究利用不同活性的黃嘌呤氧化酶(AA、AI、II form)觀察其對受質6-formylpterin(6FP)與氘化之6-formylpterin (D-6FP)的催化行為。實驗中發現，當黃嘌呤氧化酶兩個單體其中之一佔有受質時，會造成另一個單體催化能力的改變，期間存在了顯著的交互作用。 此外，黃嘌呤氧化酶催化6FP與D-6FP時，其同位素效應並不明顯；而在照光的條件下，同位素效應相繼提升，進而推斷黃嘌呤氧化酶催化6FP的過程中，6FP的酮基與很有可能與XOD氨基酸序列上的離胺酸(lysine)或精胺酸(arginine)形成具有席夫鹼(Schiff base)結構的中間產物，而產生了”光誘發催化”，藉由蛋白質水解技術，觀測到6FP與黃嘌呤氧化酶之氨基酸序列產生了化學鍵結，合理解釋了為何在催化受質6FP無法看到顯著的同位素效應之故。
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在本論文中我們研究環銥金屬錯合物FIrpytz、mnq2Ir(tfpypz)、FIrpzp的凝態光譜動態學，由於重金屬銥強烈的自旋-軌道耦合作用使得此類錯合物為良好的磷光發光材料。我們利用時間解析閘式增強式電荷耦合裝置取得錯合物之時間解析全光譜。發現三個錯合物的放光來自兩個部份。銥金屬錯合物FIrpytz在波長400~440 nm有小於系統時間解析的生命期存在，在440~600 nm有ㄧ長時間的生命期約1.2 μs，指派為3MLCT的磷光放光，MLCT為Ir上之d電子躍遷至dfppy π*軌域上之能態；銥金屬錯合物mnq2Ir(tfpypz)在波長400~560 nm有小於系統時間解析的生命期存在，在560~750 nm有ㄧ長時間的生命期約2.7 μs，指派為3MLCT的磷光放光，為Ir上之d電子躍遷至mnq π*軌域上之能態；FIrpzp在波長400~480 nm有小於系統時間解析的生命期存在，在480~700 nm有ㄧ長時間的生命期約1.4 μs，指派3MLCT的磷光放光，為Ir上之d電子躍遷至pzp π*軌域上之能態。另外以皮秒時間解析之時間相關單一光子計數系統解析各錯合物短的生命期，以雙自然指數衰減模型適解，得到兩個生命期，FIrpytz之τ1 = 0.326 ns，指派為配位基之2 1π-π*之螢光生命期，τ2 =2.71 ns，指派為配位基之11π-π*之螢光生命期；mnq2Ir(tfpypz)之τ1 = 0.330 ns，指派為配位基之21π-π*之螢光生命期，τ2 =2.80 ns，指派為配位基之1 1π-π*(S1)之螢光生命期；FIrpzp之τ1 = 0.233 ns，指派為配位基之2 1π-π*之螢光生命期，τ2 =2.18 ns，指派為配位基之1 1π-π*(S1)之螢光生命期。