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合成多價性醣體之光親和性探針並研究其對不同蛋白質之標記效率

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胜肽與硝醯配位之雙亞硝基鐵錯合物

本研究中，利用小分子DNICs與新設計胜肽的反應，來探討胜肽鍵DNICs/RREs的結構、穩定度與反應性。在文獻中，已報導可用EPR、XAS與NRVS來鑑定DNICs/RREs的生成，在本研究中，證實結合水相FTIR與UV-vis光譜是一種有效的工具，鑑定及區別在水相中生成的胜肽鍵DNICs/RREs。同時，合成出新設計含有螯合半胱氨酸的胜肽鍵DNICs (CnA-DNIC)與具有單牙半胱氨酸的胜肽鍵RREs (KCAAK-RRE/KCAAHK-RRE)，並以水相FTIR、UV-vis、EPR、CD、XAS和ESI-MS來做為鑑定。在反應性中，相對於含螯合半胱氨酸DNIC CnA-DNIC與單牙半胱氨酸胜肽KCAAK/KCAAHK的不反應，KCAAK- RRE/KCAAHK-RRE會由CnA觸發，而轉變為CnA-DNIC，加上CnA-DNIC和CnA-RRE之間可經由{Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}10還原態RREs而互相轉換，來證明DNICs對於配位上螯合半胱氨酸胜肽的穩定度是大於單牙半胱氨酸胜肽。另外，本研究中，也說明了鐵硫簇中所處的蛋白質環境以及所含金屬Fe的氧化態，會調控當鐵硫簇產生亞硝基化反應時，所生成的產物(protein-bound RREs, reduced protein-bound RREs 或 protein-bound DNICs)。 在生物擬態化學中，將具有硫醇基螯合的DNIC亞硝基化，會產生含有四個一氧化氮配位的錯合物([Fe(NO)4]−)，從晶體圖上來看，具有較長鍵長的N(3)− O(3)/N(4)−O(4)和Fe(1)−N(3)/Fe(1)−N(4)與較彎鍵角的Fe(1)−N(3)− O(3)/Fe(1)−N(4)−O(4)，來證實在錯合物[Fe(NO)4]−中，N(3)−O(3)和N(4)−O(4)可形容作為硝醯配位基，再結合理論計算，得知，最好描述錯合物[Fe(NO)4]−的電子結構為帶正一價的{Fe(NO)2}9核心，配位上兩個亞硝醯基與兩個硝醯基。

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雙唑陰離子配位基之二價釕金屬與鉑金屬錯合物的合成於染料敏化太陽能電池與電激發光元件的應用

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以Cu(I)/樟腦磺酸衍生C2對稱掌性二胺催化 不對稱亨利反應

本論文主要以樟腦磺酸為起始物合成具有C2對稱性質的二螯基掌性配位基，利用一價溴化銅進行不對稱亨利反應。以0.05當量的配位基39與0.05當量一價溴化銅，以異丙醇為溶劑，在-40 oC下添加0.1當量的三乙胺，進行硝基甲烷與醛苯的加成反應，鏡像選擇性最好可達92%，產率可以達到83%。

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New inroads into the catalytic site and the mechanism of methane oxidation in the particulate methane monooxygenase (pMMO) from Methylococcus capsulatus (Bath) by novel mass spectrometry

The particulate methane monooxygenase (pMMO) from Methylococcus capsulatus (Bath) is a fascinating enzyme, which can mediate the facile and selective conversion of methane into methanol under ambient conditions. The enzyme is the best methane oxidizer in the nature. In contrast, it is extremely difficult to achieve the efficient conversion of methane into methanol in the laboratory because the C-H bond is very inert (the C-H bond energy is very high, 105 kcal/mol). For that reason, the search for a catalyst or process that can convert methane into methanol under mild conditions has been one of the holy grails of organic chemistry. Moreover, the chemical transformation has a great potential for industry since methanol is much more value-added than methane and the earth has a hug reserve of methane. Understanding the mechanism of methane oxidation in pMMO, therefore, has long been a goal of biochemist in searching for a new catalyst. Despite almost 30 years of extensive research on its biological function and crystal structures, unfortunately, the catalytic site and mechanism of methane oxidation in pMMO enzyme is still under debate. In Part 1 (Chapter II) of this thesis, two suicide substrates, acetylene (HCCH) and propyne (CH3CCH), have been developed as mechanism-based probes of the catalytic site of methane oxidation within the particulate methane monooxygenase (pMMO) from Methylococcus capsulatus (Bath). In addition, trifluoropropyne (CF3CCH) has been shown to be a non-competitive inhibitor of the enzyme. The oxidation of HCCH and CH3CCH by the enzyme is similar to that observed for a biomimetic tricopper complex that has been recently shown to be capable of mediating efficient methane oxidation under ambient conditions. Parallel experiments on the recombinant PmoB subunit anchored in membranes reveal no evidence of reactivity between HCCH (or CH3CCH) and the dicopper center when the latter is activated by O2 in presence of reductant. These results together with in-depth studies on the inhibition of the pMMO by the three alkynes together have culminated in (i) the identification of the hydroxylation site of the enzyme; (ii) the mapping of the substrate/product migration pathways during turnover; and (iii) the elucidation of the catalytic mechanism of methane oxidation. MALDI-TOF MS of the subunits of the chemically modified pMMO complexes together with LC-MS/MS analysis of the peptides derived from in-gel proteolytic digestion of the subunits reveal that the catalytic site of the alkane oxidation resides within the transmembrane domain of the protein. The pattern of chemical modification of the protein suggests the role of the transmembrane subunits (pmoA and pmoC) in controlling the substrate entrance and product exit during enzymatic turnover. These conclusions are corroborated by computer docking of the substrates and products to the protein fold provided by the X-ray crystal structures. Taken together, these results provide strong evidence that the catalytic site is indeed the tricopper cluster sequestered by the pmoA and pmoC subunits. In Part 2 (Chapter III) of the thesis, I will present the development of nanodiamond particles in improving the mass spectrometric analysis of membrane proteins. This work came about from our original efforts to better characterize pMMO by using proteomic techniques. In fact, we have confirmed the exact molecular weights of pMMO’s subunits by nanodiamond-assisted MALDI-MS. The observed masses (46 kDa, 30 kDa, and 29 kDa) from the MALDI-MS analysis of intact pMMO complex have been assigned confidently to PmoB, PmoC and PmoC respectively. Moreover, we have extended the application of nanodiamond particles to enrich and purify other membrane proteins from highly contaminated buffers. We also demonstrated the outperformance of this approach, comparing to many other current methods, in preparing membrane proteins for both MALDI-MS analysis of membrane protein complexes and membrane protein digestion for “bottom-up” proteomics.

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鎳鐵氫化酵素以及含鎳超氧化物歧化酶之含鎳生物模擬化合物之研究與探討

鎳鐵氫化酵素中含有鎳鐵異核之催化活性中心，可進行氫氣的活化，鎳鐵氫化酵素在進行氫氣的催化時會有許多氧化還原態，其中一個具有催化的活性型態Ni-C為[(Scys-H)(Scys)NiIII(μ-Scys)2(μ-H) Fe(CO)(CN)2]，含有一個橋接的hydride配位基介於鎳鐵之間，在模擬化合物研究上，利用[NiIII(OR)P(C6H3-3-SiMe3-2-S)3]– (R = Ph or CH2Ph) 與 HBpin (pin = OCMe2CMe2O) 在THF中並且在–80℃下進行HBpin-promoted hydride-alkoxide metathesis reaction 可形成熱不穩定含有末端配位基為hydride的化合物 [PPN][NiIII(H)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] (1)，分別用低溫紫外/可見光光譜儀及低溫電子順磁順光譜儀鑑定之，化合物1與CS2 會進行插入反應形成[PPN][NiIII(1-S2CH)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] (2). 將化合物1溶於 d-THF 與 CDCl3 反應可產生已知化合物 [NiIII(Cl)(P(o-C6H3-3- SiMe3-2-S)3)]– 以及CHDCl2，其在1H NMR (δ 5.46 (t) ppm (C4D8O))具有特徵吸收峰，此反應也間接證實[NiIIIH]-containing 化合物1的存在。 含有四芽基配位的[P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3]3–-supported Ni(III)-imidazole [Ni(Im)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] (Im = imidazole) (3) and Ni(III)-methylimidazole [NiIII(MeIm)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] (6) (MeIm = methylimidazole) 可捕捉超氧化物進行氧化反應形成氧氣並分別產生[NiII(Im)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)]– (4) 與 [NiII(MeIm)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] (7)，化合物 4因為含有電子豐富的[NiII(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)] motif 以及可提供質子的咪唑配位基，具有良好的電子環境可活化氧氣產生以咪唑配位基當作橋接的 [{Ni(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)}2(m-Im-H)]– (Im-H = deprotonated imidazole) (5) 以及副產物H2O, 而Ni(III)-methylimidazole-containing complex 6 and Ni(II)-methylimidazole- containing complex 7 則在 O2- 與 O2 環境下可進行可逆的氧化還原反應，利用[NiII/III(Im)(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)]0/1的一個電子氧化還原反應可將超氧化物轉換成氧氣最後形成水釋放，其中推測會經過一個[{Ni(P(o-C6H3-3-SiMe3-2-S)3)}2(Im)2(m2-O2)] 過渡態，此研究結果顯示此咪唑配位基可提供一個質子給鄰近的peroxide有利幫助形成H2O2。

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水溶性雙亞硝基鐵硫錯合物及四亞硝基雙鐵硫錯合物的合成與反應機構探討

實驗中主要以電子結構為{Fe(NO)2}10的Fe(CO)2(NO)2做為起始物，分別和不同取代基的硫醇化合物半胱胺 (HS(CH2)2NH2)、2-巰基乙醇 (HS(CH2)2OH)及苯硫酚(HS(C5H6))進行反應，探討改變末端官能基的路易士酸鹼性後,對反應機制所造成的影響。反應過程與結果是利用紅外線光譜儀、紫外光/可見光電子吸收光譜儀、電子順磁共振光譜儀、超導量子干涉磁量儀、X光吸收近邊緣結構光譜儀及單晶X光繞射儀等進行鑑定。在反應過程中可觀察到的電子結構為{Fe(NO)2}10-{Fe(NO)2}10並以CO做為橋接基的中性四亞硝基雙鐵硫錯合物，成功得到[(μ-CO)(μ-S(CH2)2NH3)Fe2(NO)4] (1-NH3)及[(μ-CO)(μ-S(CH2)2OH2)Fe2(NO)4] (1-OH2)等利用H+做為陽離子的中性錯合物晶體結構。此結果亦說明相較於苯硫酚，半胱胺與2-巰基乙醇上除了有具有路易士鹼的胺基(-NH2)及醇基(-OH)可助於穩定H+外，且烷基硫醇的推電子能力較好，有利於穩定其錯合物雙鐵中心因橋接CO的π back-bonding的效應所產生較為缺電子的環境。因苯硫酚無上述條件，導致其熱穩定性較差，因此只能觀察到其光譜訊號，而無法得到晶體結構。此外也發現錯合物1-NH3在氧化後和當量半胱胺進行反應後，可成功合成電子結構為{Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}10中性的還原態四亞硝基雙鐵硫錯合物(reduced Roussin’s Red Ester; rRRE) [(μ-S(CH2)2NH2)(μ-S(CH2)2NH3)Fe2(NO)4] (2)，此可說明生物體內蛋白質結構中的鐵硫簇錯合物和一氧化氮進行反應後,若有rRRE的結構產生，可利用胺基抓取H+，有效穩定其結構。而rRRE 2的氧化機制除了和氧氣反應後，會生成電子結構為{Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}9 的RRE [(μ-S(CH2)2NH2)2Fe2(NO)4] (3)外，也可藉自身的氧化來還原二硫化二苯(Diphenyl disulfide)並伴隨雙亞硝基鐵硫錯合物(Dinitrosyl Iron complexes; DNICs)的生成,此亦說明蛋白質內rRRE和鄰近雙硫鍵反應的可能性.綜合上述結論，其結果可說明經由Fe(CO)2(NO)2與硫醇基團(HSR)反應生成電子結構為{Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}9 RRE的過程，並不是由metal-hydride的氧化加成並伴隨還原脫去產生氫氣的路徑，而是取代基與效應伴隨著氧化脫水的結果：{Fe(NO)2}10-{Fe(NO)2}10 [(μ-CO)(μ-SR)Fe2(NO)4] ‒ → {Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}10 [(μ-SR)2Fe2(NO)4]‒ → {Fe(NO)2}9-{Fe(NO)2}9 [(μ-SR)2Fe2(NO)4]。此外也利用RRE 3和上述硫醇化合物再次進行反應，可精準的合成一系列電子組態{Fe(NO)2}9的不對稱雙亞硝基鐵硫錯合物DNICs，並進一步形成不對稱的rRRE結構，而其中2-巰基乙醇及半胱氨酸取代的不對稱DNICs，因具有良好的水溶性，故可進一步做為後續心血管與腫瘤等生化相關研究的起始材料。

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以自組裝單分子層界面修飾技術提升有機發光二極體效率及壽命之研究

在有機發光二極體元件的製程應用中，增益元件電荷注入效率及元件使用壽命是相當重要的一環，而電極表面處理對於上述的現象有顯著的效果。利用自組裝單分子薄膜技術，將其修飾於電極表面並應用於有機發光二極體元件，可以藉由改變分子偶極方向及大小來調控電極與有機半導體材料之間的界面能階。在本論文中，我們使用一系列的有機亞磷酸分子吸附於現今常用之電極¬¬-¬銦錫氧化物(ITO)表面，並製作有機發光二極體元件來進行界面對於元件效率影響之研究。所使用的亞磷酸分子包含:不同烷鏈長度亞磷酸分子及末端為三氟甲基取代的烷基亞磷酸；以及分子長度相同但具有相反偶極的兩分子，包含:丁烷基亞磷酸與三氟甲基丙烷亞磷酸，還有對位甲基或對位三氟甲基苯基亞磷酸。 研究結果顯示，藉由修飾不同分子長度的自組裝單分子膜可以改變載子注入的穿隧能障，進而調控載子注入數量。由此研究來觀察元件中載子注入平衡現象。另外，我們也將兩長度相同但偶極相反的兩分子以不同比例混合並修飾於ITO電極表面，藉由兩分子組成比例不同，可將ITO功函數做大幅度調整(5.0~5.75 eV)。接著將混合式自組裝單分子膜修飾後的ITO陽極製作有機發光二極體元件，元件結構為ITO/SAM/HTL/Alq3/MX/Al，其中，電洞傳輸層(HTL)使用NPB或是BPAPF；而電子注入層(MX)使用LiF或是Cs2CO3。實驗結果顯示，儘管使用不同的電洞傳輸層或電子注入層，皆可找到一最匹配的自組裝單分子膜混合比例，平衡元件中載子注入數量，進而得到元件最大的電流值及最佳發光效率。此一系列研究對於載子注入平衡提供了一有系統的分析方法與研究。 此外，針對幾種常見的電極表面處理方式對於元件壽命的影響我們也進一步分析探討。本論文比較了三種電極表面處理方法，包含:氧電漿處理、自組裝單層分子膜修飾，以及高分子PEDOT:PSS塗佈，並製作了紅、藍、綠色三種發光元件。從元件壽命量測結果發現，經由自組裝單分子膜修飾之電極製成的元件，其元件壽命相較於其他兩者增加有三至十倍。壽命量測與操作電壓關係圖顯示，不同的表面修飾是造成元件壽命差異的來源，我們進一步使用AC2以及XPS等儀器進行表面分析以釐清這些現象。 最後，我們嘗試將亞磷酸分子吸附製程縮短並最佳化。經由反射式紅外線光譜及功函數量測分析結果顯示，ITO電極僅需短時間的浸泡再經由高溫烘烤步驟，即可加強分子與基板表面進行脫水吸附反應達飽和吸附。而在溶劑的選用及基板清洗過程中，若修飾後的基板與水接觸，則會造成亞磷酸分子與ITO表面脫附並導致功函數下降

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合成具有光敏性斷裂型官能基探針及修飾四嗪之磁性奈米粒子用以鑑定和純化O型乙醯葡萄糖胺醣基化胜肽

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建構功能化奈米粒子應用於生物分子分離偵測與複合材料的合成

由於奈米尺度產生的特殊性質，近年來奈米科技已廣泛地應用在各種生活層面，奈米材料經由物理或化學方法進行表面修飾，引入功能性官能基，能夠改變奈米材料表面的性質，提升應用範圍與價值。本論文的研究著重於建構功能化的奈米粒子，應用於偵測、分離生物分子以及複合材料的合成。 凝集素與醣體具有專一性的親和力，因此藉由醣功能化金奈米粒子與凝集素的結合，我們發展三種快速且靈敏的方法偵測凝集素的存在。首先，由於連接醣體與奈米粒子間的連接鏈對於奈米粒子的穩定性有關鍵的影響力，經過詳細的結構比較，我們發現以同時具有親水性（六段乙二醇單元）與親油性（長碳鏈）結構連接鏈（EG6C10）的醣體，並混合30%的基質進行包覆金奈米粒子時，可以得到具有抗蛋白質非專一性吸附與高鹽度環境中穩定懸浮的醣功能化金奈米粒子。根據EG6C10的結構，我們合成七種醣功能化的金奈米粒子並用偵測七種凝集素。經由UV-Vis光譜儀與DLS粒徑儀的量測，可以成功觀察到凝集素與金奈米粒子結合時，產生的吸收峰位移與粒徑的改變。此外，在硼酸位向性固化凝集素抗體晶片上，金奈米粒子與凝集素在抗體上方聚集形成三維的堆疊，經過銀染放大，我們無須任何儀器輔助，可以直接以肉眼觀測凝集素的存在。這三種偵測的實驗結果顯示，偵測極限皆在pM與nM之間，與傳統ELISA的偵測極限相當，使得他們在偵測凝集素上非常具有競爭力。 另一方面，相較於文獻上直接在氧化鋅奈米柱陣列表面還原金屬鹽類得到奈米粒子結合奈米柱的複合材料，金奈米粒子可透過硫辛酸作為分子架橋與氧化鋅奈米柱陣列結合，形成氧化鋅-金複合材料。此方法的優點為操作簡單，可以得到粒徑相當均勻的複合材料外，透過金奈米粒子溶液的濃度可以控制氧化鋅奈米柱陣列表面金的密度，進而詳細的探討金奈米粒子的粒徑與密度對於光催化降解能力的影響。利用螢光染料rhodamine B作為降解的研究標的，實驗結果發現，光催化降解效率原則上隨著金含量增加而增加，在五種粒徑的金奈米粒子中，修飾10 nm金奈米粒子的氧化鋅-金複合材料在UV光照射下，具有最好的光催化降解效率，而相較於氧化鋅奈米柱陣列，催化效率增加8.5倍之多，使得本研究成功得到的氧化鋅-金複合材料，具有發展成為光觸媒產品的潛力。 最後，我們利用醯胺鍵耦合、微波輔助銅催化環化反應、溶膠凝膠反應以及可逆型加成裂解鏈轉移聚合法於磁性奈米粒子表面鍵結硼酸分子，成功合成硼酸功能化奈米粒子。根據紅外光譜量測分析，經由微波輔助銅催化環化反應以及可逆型加成裂解鏈轉移聚合法得到的磁性奈米粒子具有較多硼酸分子的訊號，代表兩者方式的合成效率較佳。目前奈米粒子表面硼酸的定量分析以及上述四種化學方法合成的硼酸功能化奈米粒子，對於樣品中醣蛋白分離純化的效率正在進行評估中。