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利用Aβ折疊報導細胞篩選黃酮及香豆素衍生物作為促效劑標的BDNF受體TRKB的阿茲海默症治療策略

@_@阿茲海默症(AD)是與記憶缺陷和認知功能下降相關的進行性神經退行性疾病。病理學上AD的特徵是大腦中存在澱粉樣蛋白β (Aβ)聚集體(澱粉樣斑塊)和由高磷酸化的Tau蛋白形成的神經原纖維纏結(NFT)。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養蛋白家族的成員，以高親和力與原肌球蛋白相關的受體激酶B (TRKB)結合，活化下游信號傳導，來促進神經元的存活、分化和神經可塑性。已經發現AD患者的腦中BDNF和TRKB表達水平降低，並且BDNF降低和TRKB受損導致AD中的神經變性。AD小鼠模型的海馬迴中施用TRKB特異性促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-DHF)，可改善了空間記憶並降低樹突損傷，表明TRKB信號傳導增強，為有希望的AD治療策略。本研究使用表達Aβ-GFP的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，對15種黃酮和香豆素衍生物，進行Aβ聚集抑制性及神經保護性的評估。在測試的化合物中，ZN006、ZN013、ZN014、ZN015可抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)、及抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性，其中ZN014、ZN015並能抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)活性及促進神經突生長(Neurite outgrowth)。在TRKB訊息傳遞路徑上，ZN014、ZN015可透過TRKB受體的Y516、Y817磷酸化，及下游ERK激酶T202/Y204磷酸化、AKT激酶S473磷酸化的活化，進一步促進轉錄因子CREB的S133磷酸化，來增強神經營養因子BDNF及抗凋亡蛋白BCL2的表現。RNA干擾(RNAi)靜默TRKB基因表現的實驗，驗證了這兩種化合物經由TRKB訊息傳遞的神經保護性。總言之，研究結果顯示ZN014和ZN015可抑制氧化壓力及乙醯膽鹼脂酶活性，並增強BDNF-TRKB訊息，來降低Aβ毒性，有潛能應用在AD的治療上。

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入侵與原生淡水龜的數感認知比較

烏龜能辨別數量嗎？這個問題不只是認知心理學的範疇，更與行為生態息息相關。例如雄性會選擇加入雌性個體比較多的群體；領域的佔有者也會依據入侵者的數量決定要逃跑還是奮力一搏，這些行為的決策都奠基於動物具有數量感知能力。在魚類、鳥類和哺乳類上都已有大量研究投入，唯獨爬行動物是否能辨別數量，研究仍非常罕見。在第一章我以臺灣原生淡水龜種斑龜為研究對象，共分為兩個實驗：實驗一為一系列比率由低到高的順序進行的五組測驗；實驗二則是包含共三十二種數量組合的混合測驗。訓練斑龜基於「大於」的抽象規則來辨別數量，而非認特定數量或圖形。研究結果顯示，斑龜能夠成功辨別本研究最難的數字組合：九比十，也發現其數感認知表現符合韋伯率，即兩數量間的比率越高則代表辨別難度越難因此表現變差。另外其表現隨著天數而顯著提升，顯示斑龜具有學習能力。第二章我用全球百大入侵種之一的紅耳龜進行與第一章一樣的實驗，發現當面對必須靈活運用抽象概念的測試時，入侵種的數感表現優於原生龜，顯示紅耳龜可能有較佳的行為彈性。本研究中烏龜所展現的優異數感能力接露爬行動物的認知能力很可能是被嚴重低估的，也暗示其生態行為決策機制可能並不簡單，本論文也是首度試圖透過數感能力連結認知能力與入侵生物學的研究。

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臺灣產蜘蛛抱蛋屬植物之系統分類研究

@_@蜘蛛抱蛋屬(Aspidistra)植物於全世界約170 多種，被認為是目前單子葉植物 中物種增加最迅速的類群之一。長期以來，臺灣產蜘蛛抱蛋屬多被處理為三個分 類群，但部分類群的區分仍有學者持有不同觀點。此外，過往對本屬植物的分類 均以形態特徵為主，隨著分子生物技術的迅速發展，分子標記已成為分類學研究 有效的分析方法，然而臺灣產蜘蛛抱蛋屬目前仍未有針對不同類群遺傳分化的研 究與完整的物種親緣關係探討。 本研究以 Lu et al. (2020) 的分類研究結果為假說，使用轉錄組分析(RNA-seq) 釐清本屬物種間的親緣關係，再利用形質分析評估不同類群之間相對重要的特 徵，以微衛星分子標記探討不同類群之間的遺傳組成。首先，親緣關係結果顯示 臺灣本屬物種為一單系群，其中大武蜘蛛抱蛋(A. daibuensis)的東部群最早形成， 而薄葉蜘蛛抱蛋(A. attenuata)為最晚分出的類群；且物種分群與假說一致，大武 蜘蛛抱蛋的東部群與南部群為不同的兩類群。其次，形質分析結果中，花部特徵 的柱頭角度、花藥著生高度、裂片的寬度以及雌蕊長與雄蕊著生高度比值可做為 區別特徵。長藥隔蜘蛛抱蛋(A. longiconnectiva)與大武蜘蛛抱蛋東部群具有相似的 遺傳組成，與親緣關係分析結果，長藥隔蜘蛛抱蛋與霧社蜘蛛抱蛋(A. mushaensis) 有較接近的親緣關係不一致。最後，結合親緣分析、遺傳結構分析與形態分析結 果顯示大武蜘蛛抱蛋之東部群與南部群為不同的兩類群。本研究確認臺灣產蜘蛛 抱蛋屬應包含五個類群，並建議將大武蜘蛛抱蛋的南部群處理為新的分類群。

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銀離子於酸性環境中對斑馬魚胚胎發育及離子調控之危害

奈米銀在近年來被廣泛地運用於醫療及化妝品產業，其廢棄材料表面釋放出的銀離子會危害水生生物。然而，目前對於銀離子在不同酸鹼值環境中的毒性差異並不瞭解。本研究利用斑馬魚胚胎為水生生物模式，將其暴露於含有0、0.1及0.25 ppm AgNO3之pH 5或pH 7環境中，以評估銀離子毒性的差異。在暴露96小時的結果中可以得知銀離子的胚胎發育影響程度隨著濃度升高而增加。在銀離子的暴露後胚胎體長顯著下降，而卵黃囊面積則會增加。銀離子亦導致胚胎耳石囊面積及耳石面積下降，影響胚胎的內耳系統。另外，側線神經丘及毛細胞數目下降也反映出銀離子對胚胎側線的影響。值得注意的是：酸環境(pH 5)中會增加銀離子在體長、卵黃囊、耳石囊以及耳石上的影響。另一方面，銀離子降低離子細胞開口面積及數目，阻礙胚胎的離子調節功能，並且導致NaRC及HRC數目顯著降低，增加胚胎適應酸環境的困難性。另外，30分鐘及2小時的實驗中可發現：銀離子會藉由增加離子細胞的氧化壓力程度，進而誘發細胞凋亡機制。總結以上結果，本研究認為酸環境會增加銀離子對魚類的危害。

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利用生物資訊學分析大腸直腸癌的關鍵基因

@_@大腸直腸癌(CRC)目前是世界上常見的癌症之一，近年來發病趨勢逐漸上升且該疾病致死率也高居前列。雖然對於CRC的研究早已展開，但是該惡性腫瘤的分子機制並未被定性。本研究的目的是通過生物資訊分析確定並驗證了CRC相關的核心基因。為了篩選CRC中的差異表達基因 (DEGs)，我們從Gene Expression Omnibus (GEO)上下載了數據集GSE103512，使用R軟體進行了數據分析，得到了235個DEGs，其中54個上調，181個下調。我們把分析出的DEGs導入了DAVID進行了Gene ontology (GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway(KEGG)分析。發現這些DEGs顯著參與癌症相關的function和pathway。我們使用string數據庫以及cytoscape可視化工具構建了PPI (protein-protein interaction)網路。通過cytoscape的cytoHubba工具，篩選出了10個關鍵基因(IGF1, DCN, CXCL8, FOS, CXCL12, C3, MYH11, CYR61, CXCR4)，把這些hub genes代入gepia2.0數據庫中進行Overall Survival分析，發現CXCL8低表現量或C3高表現量會產生不良的生存結果。通過cytoscape的MCODE工具，我們從PPI網路中篩選出了3組module。把每組module中的基因進行KEGG分析，發現在module中同樣包含CXCL12,IGF1,CXCR4這3個關鍵基因，且顯著參與了癌症相關的pathway。 本研究中發掘的核心基因在一定程度上有助於理解CRC發展的分子機制，其中CXCL12,IGF1,CXCR4參與了疾病發展過程的關鍵pathway，通過Overall Survival分析CXCL8和C3的表現量高低會對CRC造成顯著的預後差異。

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粘桿菌素對斑馬魚胚胎之毒性並探討鈣離子對粘桿菌素的影響

近年來因為抗生素的過度使用導致環境汙染的問題逐漸受到重視。目前在臨床上使用之粘桿菌素colistin 會對人體造成腎毒性及神經毒性等副作用，因此被列為對抗格蘭氏陰性細菌感染的最後一線用藥。在許多國家中粘桿菌素也被大量使用在畜產業上作為動物傳染病的防治，進而導致粘桿菌素隨著動物排泄物及未食用完畢的食物進入水域環境中，產生具有抗藥性的大腸桿菌。然而，粘桿菌素對水生動物可能的危害卻仍未被研究。因此本研究目的是利用斑馬魚胚胎為模式以探討粘桿菌素暴露對魚類可能產生的毒性以及水中離子濃度對其毒性之影響。結果發現斑馬魚胚胎暴露粘桿菌素 96小時之半致死濃度約為3 μM，死亡個體出現皮膚細胞破損現象，但未產生發育異常與畸形；在亞致死濃度下桿菌素會減少側線毛細胞數量以及離子細胞數量，並損害角質細胞結構。 綜合上述 在隨時間的觀察發現 魚體皮膚角質細胞在暴露粘桿菌素後會逐漸破損，最終導致皮膚細胞瓦解，體內離子失衡，魚體死亡。藉由改變水中的離子濃度，發現鈣離子濃度對粘桿菌素的毒性有關鍵性的影響。提高鈣濃度可以有效減低其毒性，降低鈣濃度會提高毒性。本研究證實了粘桿菌素在水域汙染後可能對魚類產生危害，藉由提高水中的鈣離子濃度可減低其毒性。

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室內環境動物群聚動態之初探- 以浸液標本庫為例

人類長時間待在室內環境中，與室內環境關係密不可分，而隨著人類的活動會在室內環境中創造出各種微環境，提供各類生物生活、取食、棲息環境，並完成世代交替，但在以往關於這些生物的研究並不多，且大多侷限在常見有害物種，對於室內生物整體性研究及生物與環境間的連結性研究甚少。 本研究以有人為控制的浸液標本蒐藏庫為主要研究樣區，相較於其他室內居家環境，相對影響因子較少，較容易掌控。從2018年08月至2019年12月，透過黏蟲屋取樣及掃塵取樣，進行每月進行一次調查，共記錄到六綱十七目二十八科二十八種 (含形態種) 34,575隻個體，其中含10種核心物種。依據NMDS及稀釋與預測曲線分析兩種取樣方式之差異，結果顯示兩種取樣之群聚結構呈顯著差異，且以黏蟲屋取樣之效用較高，能捕捉到之種類更多。在多樣性指數中，整體香農指數 (H’) 為1.57，均勻度 (J’) 為0.47，種豐富度 (Dmg) 為2.60，其中唯有種豐富度指數與環境因子間 (溫度、相對濕度及雨量) 有顯著相關性。在探討黏蟲屋擺放位置依據分層高度和與主要空調的距離，對於物種群聚結構及數量之影響，分別使用NMDS及雙因子變異數分析，結果顯示黏蟲屋之分層高度對物種個體數量及群聚結構有顯著影響及差異；而黏蟲屋距離主要空調出風口遠近，對於物種個體數量無顯著影響，但離空調距離越遠有個體數量越少的趨勢存在，且各距離間群聚結構相似性高；透過複迴歸模型分析核心物種類群數量與環境因子間之關聯性，結果顯示在多數核心物種類群數量變化上，環境因子是極為重要的影響因子。 本研究有助於初步瞭解室內物種多樣性，以及物種與環境間的關聯性，和增加室內物種生物學之認識，以評估其做為室內環境生物指標的可能性，藉此瞭解室內環境對人體健康或財產的潛在危害及影響，或提供防治之建議及未來研究之依據。

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系統性研究魚類面臨溫度波動的能量調適策略

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以斑馬魚側線毛細胞作為研究耳毒性物質之動物模式

隨科技進步，奈米物質使用日益增加，其中奈米銀和奈米銅是其中最被廣泛使用的奈米材料，多應用於治療劑、抗菌劑、化妝品或工業之用。而曾被限用於局部治療之高腎毒性抗生素colistin，隨著革蘭氏陰性細菌之抗藥性出現，以及後線有效抗生素之短缺，全球使用量亦隨之上升。近年來，許多研究開始發現各種藥品、抗生素和個人護理產品存在於各式水域系統，被公認為屬於新興的環境污染物。隨著奈米顆粒廣泛使用以及colistin後線抗生素全球用量的不斷攀升，並以各種方式進入環境及水域系統。此類新興環境汙染物暴露之可能性，及其對生物或環境的毒性影響也是我們亟需思考的問題。然而目前並無適當的毒理研究證實此類新興環境汙染物對水生動物的負面影響，特別是耳毒性方面之研究。 由於魚類側線系統位於皮膚，會直接暴露外來物質，且其側線毛細胞於表面易於觀察，加上側線神經丘中之毛細胞的結構及功能與人類內耳的機械感官性毛細胞極為相似，故其側線系統之毛細胞應可作為測試潛在有毒物質之耳毒性的合理模式。在本研究中，我們使用斑馬魚胚胎之側線毛細胞，以研究早期暴露此類新興環境汙染物對斑馬魚胚胎本身及其側線毛細胞之影響。我們將斑馬魚胚胎自受孕後連續暴露96小時於不同濃度之特定環境污染物（包括抗生素colistin、奈米銀、奈米銅），觀察其存活率、胚胎孵化率、外觀及側線毛細胞的數量及功能影響。 抗生素colistin之暴露明顯降低了胚胎存活率，此降低與其濃度具明顯相關性；暴露於抗生素colistin 96小時後50％致死之濃度（LC50）值為3.0 μM或3.5 mg/L，但並未改變其孵化率和體長。同時，經由觀測FM1-43標記之毛細胞數量下降，及使用掃描式離子選擇電極技術偵測側線毛細胞處之鈣離子流減少，證實抗生素colistin於濃度≥ 0.1 μM時，已影響其側線毛細胞之功能。以此斑馬魚胚胎側線毛細胞模式，亦發現常見的奈米銀、奈米銅造成斑馬魚胚胎之存活率下降，此降低亦與暴露濃度具明顯相關性；暴露於奈米銀、奈米銅96小時之LC50分別為6.1 ppm（56.5 μM）和2.61 ppm（41.1 μM）。當奈米銀濃度≥ 1 ppm（9.3 μM）或奈米銅濃度≥ 0.01 ppm（0.16 μM），FM1-43標記的毛細胞數量會開始減少，並出現微觀結構改變；當奈米銀濃度≥ 0.1 ppm（0.9 μM）或奈米銅濃度≥ 0.01 ppm（0.16 μM），雖毛細胞數量無顯著下降，但掃描式離子選擇電極技術測得之毛細胞鈣離子流已經開始明顯下降。 此研究證明，藉助以掃描式電子顯微鏡觀測FM1-43標記之斑馬魚側線毛細胞數量，合併掃描式離子選擇電極技術測量之毛細胞功能，來作為研究耳毒性物質之斑馬魚模型之可行性。

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以斑馬魚為動物模式研究奈米金屬對離子細胞之毒性

在21世紀，奈米科技快速發展，應用廣泛，而這也同時增加了人類接觸各種不同奈米顆粒的機會，因此針對其毒性的研究，也相形越來越重要。而其中，金屬奈米顆粒對於魚類離子細胞的潛在毒性仍未有充分的研究。本篇研究是以斑馬魚胚胎為動物模式，探討奈米銀和奈米銅對斑馬魚胚胎皮膚上的離子細胞功能之毒性作用。實驗方式是將斑馬魚的胚胎分別浸泡於奈米銀和奈米銅96小時（受精後4〜100小時(hpf)）後，檢測其全身離子含量及皮膚上離子細胞的數量和功能。暴露於奈米銀96小時後，全身Na離子和K離子含量在奈米銀濃度為3 mg/L組別中顯著下降，而Ca離子含量在濃度 ≥ 0.1 mg/L時下降。以Scanning ion-selective electrode technique(SIET)檢測胚胎皮膚的H離子分泌功能，發現在3 mg/L時功能顯著降低。以rhodamine 123（粒線體標記）來標記離子細胞，其密度在1和3 mg/L時分別降低了25%和55%，而離子細胞外觀也從橢圓形變形為棘狀形。進一步以抗體標記染色的方式檢測不同離子細胞亞型，發現奈米銀對富含H+-ATPase的HR細胞和富含Na+/K+-ATPase的NaR細胞造成不同的損傷。進一步使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口有明顯的萎縮，這和正常功能的喪失相關。另一方面，斑馬魚胚胎暴露於奈米銅後，觀察到相同的趨勢。濃度在 ≥ 0.1 mg/L時，全身Na離子和Ca離子含量顯著降低，而在 ≥ 1 mg/L時，K離子含量降低。而濃度 ≥ 1 mg/L時，胚胎皮膚的H離子排泄功能顯著降低。在奈米銅濃度 ≥ 0.1 mg/L時，用rhodamine 123標記的活離子細胞數量顯著減少。使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口同樣有明顯的萎縮。我們也以免疫染色方式進行離子細胞亞型(HR細胞和NaR細胞) 標記，兩者都在濃度 ≥ 1 mg/L時降低。透過檢測離子轉運蛋白/通道和鈣離子調節激素mRNA表現量，發現功能的損傷也藉由基因表達的變化反映出來。綜合以上結果證實在斑馬魚胚胎早期，奈米銀和奈米銅對其皮膚離子細胞會產生毒性和並影響其離子調節的功能。由於斑馬魚離子細胞和人類腎臟細胞，在生理功能上和對環境變化的調節反應上都有高度的相似，故此一結果也提醒我們奈米金屬對人類的腎臟細胞可能有潛在毒性。