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阿拉伯芥之聚泛素基因UBQ10、UBQ11和UBQ14的基因表現及啟動子序列分析

泛素(ubiquitin)是一個由七十六個胺基酸所組成的蛋白質，它廣泛存在真核生物體內。近來的研究發現，阿拉伯芥中泛素主要由五個聚泛素基因所轉錄轉譯出，依其親緣特徵可分成兩群，UBQ3和UBQ4為一群，UBQ10/UBQ11/UBQ14為一群。因此本研究以阿拉伯芥之UBQ10/UBQ11/UBQ14為目標，研究其基因表現的調控機制。將UBQ10/UBQ11/UBQ14的上游序列，依序刪減後接上報導基因，分析報導基因的表現量得知UBQ10的啟動子(promoter)序列上有一正向調控區段(-2044至-1849)、UBQ11的啟動子序列有負向(-798至-577)以及正向(-577至-258)各一的調控區段，而UBQ14的啟動子序列上有一負向調控區段(-714到-636)。利用生物資訊工具調查此三基因的啟動子序列，結果發現三個保守序列(UPE1、UPE2和UPE3)。進一步比較這些基因在不同生長時期、不同溫度及光線處理的基因表現模式，得知UBQ11及UBQ14在低溫處理下會增加基因表現量，但UBQ14在UV-B及黑暗處理下影響會減少表現量。UBQ10表現則不受這些環境因子影響。

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阿拉伯芥atToc33與atToc34基因之功能性研究

葉綠體是植物行光合作用的重要胞器，在遠古時代由藍綠菌與真核細胞內共生而來。然而在演化過程中，超過90%的葉綠體蛋白質基因已經轉移至真核細胞的細胞核內。這些基因產物必須在細胞核內轉錄、在細胞質內轉譯及修飾後再送到葉綠體內。位於葉綠體膜上的轉運蛋白機組(translocon complex)負責辨識及運輸這些蛋白質，其中包含位在外膜上的Toc和位在內膜上的Tic兩大複合體。在阿拉伯芥中已知的轉運機組成員裡，atToc33和atToc34是豌豆Toc34的兩個同源蛋白，在運輸蛋白質進入葉綠體的過程中，扮演最初辨識蛋白質的角色。轉運機組的成員其基因必須被適當的調節，否則這些轉運機組將無法準確的組裝以執行適當的功能。為了了解atToc33和atToc34基因表現的調節的機制，atToc33和atToc34基因的啟動子序列接上GUS報導基因後送入野生型阿拉伯芥，結果顯示這兩個基因5’端非轉譯區內第一內插子對於促進基因表現有顯著的影響。此外，5’端啟動子刪減及膠體電泳位移分析實驗亦找出數個可能調節atToc33基因表現的啟動子區域。

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持續大量表現AtMsrB7於阿拉伯芥可增進植物對細菌性病原菌與氧化逆境之耐受度

前人研究顯示轉殖甜椒的PFLP (plant ferredoxin-like protein) 基因，可以提昇轉殖植物對於軟腐病的抗性 (You et al., 2003)。本實驗室尚未發表的阿拉伯芥Affymatrix microarray資料則顯示，感染軟腐病菌 (Erwinia carotovora ssp. carotovora, Ecc) 之阿拉伯芥PFLP轉殖株內，MsrB7 (methionine sulfoxide reductase B7) 基因的表現量增加約10倍。本研究進一步對感染Ecc的野生型阿拉伯芥植株 (WT) 進行定量RT-PCR (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, q-RT-PCR) 分析，結果也發現MsrB7基因在WT中也因Ecc感染而增加表現，本研究於是推測MsrB7可能參與植物的抗病反應機制。為驗証前述的推測，本研究選殖阿拉伯芥的MsrB7 (AtMsrB7) 基因，並藉CaMV35S啟動子之驅動，使原本主要表現於根部的MsrB7，持續大量表現於阿拉伯芥全株中，並對轉殖植株進行抗病能力的檢測。基因轉殖實驗結果顯示MsrB7轉殖株 (MsrB7OX) 對於Ecc的感染與殺草劑巴拉刈 (Methyl viologen, MV) 的處理都明顯增加耐受度，經由DAB (3,3-diamino-benzidine) 的染色結果可知，MsrB7OX轉植株內的H2O2累積量較WT對照組為低，顯示轉植株內移除ROS (reactive oxygen species) 的活性增高。比較三種ROS移除相關酵素活性的實驗結果顯示，MsrB7OX轉植株內peroxidase和thioredoxin reductase的活性明顯提升，而catalase的活性則無顯著變化。本研究也利用q-RT-PCR檢測轉殖株內各種已知與抗病相關基因的表現情形，結果發現MsrB7轉植株中，SA-dependent pathway上的基因包括NPR1、WRKY70與PR1等的表現量均有顯著增加。綜合上述實驗結果推測，持續表現MsrB7可增加植株對Ecc耐性之原因可能是藉由移除過多ROS與活化SA-dependent pathway抗病機制來達成。另外，本研究也發現轉殖株除了能耐受Ecc的處理之外，亦能耐受青枯病菌 (Ralstonia solanacearum) 的感染。因此持續表現MsrB7基因，可提高植物對氧化逆境及至少兩種細菌病害的多重耐性。

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台灣產月桃屬植物天然雜交及島田氏月桃複合群親緣地理之研究

台灣產月桃屬植物之系統分類處理歷來未能獲得一致認同的結果，推測頻繁的天然雜交及島田氏月桃複合群內特徵多變異是主要的難點，故本論文針對此二方向進行探討。 台灣月桃屬網狀雜交關係假說的提出根據形態特徵、花粉孕性偏低及地理分布等特性。本研究透過分子方法證實此假說；除了雜交個體及其親本種的鑑別，單向或雙向的雜交配對模式也獲得確認。共鑑別出9種來自不同物種配對組合的雜交，佔所有15種可能組合的60%。透過比較這些雜交配對特性之異同點，推論生態地理屏障(ecogeographic barriers)、傳粉者精確度(pollinator fidelity)以及雜交不親和(cross-incompatibility)是月桃屬植物關鍵的生殖屏障；依序在其生活史中發生作用以達到物種維持。然而，在不同配對物種間，每一生殖屏障的貢獻度有所差異。 島田氏月桃複合群為台灣特有，其分化的歷程深受台灣地質歷史之影響。本研究全島採樣226個體，結合兩段葉綠體非轉錄區序列進行分析，結果顯示中央山脈兩側的遺傳組成有顯著的差異；檢視形態特徵「小苞片有無」獲得與地理親緣相符的歸群結果，此複合群應區分為普萊氏月桃及島田氏月桃兩支系。普萊氏月桃不論在單型及核苷酸的變異度上均高於島田氏月桃，代表其較長的族群歷史以及較複雜的變動歷程。這一群植物的共同祖先約在更新世抵達台灣，中央山脈的阻隔與多次的冰河進退可能對這群亞熱帶森林性植物的種化、遷移及生存扮演關鍵的角色；台灣東南端山區及阿里山山脈分別被推論為普萊氏月桃及島田氏月桃的潛在避難所。 綜合以上結果，台灣產月桃屬之關係已得釐清，包含6個具有明確種別特徵的種類。由於不同配對種間生殖屏障的破壞，產生各式樣的雜交後代，造成野外族群形態及遺傳組成上的許多變異。

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環境壓力對人類神經細胞過度表現Protein Phosphatase 2A次單位PPP2R2B的影響

Protein phosphatase 2A (PP2A)是屬於serine/threonine去磷酸酶的一種，能調控細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ次單位是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當Bβ基因有所損害或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本論文分別將能專一表現於細胞質的Bβ1和專一表現於粒線體的Bβ2質體轉殖入神經腫瘤母細胞SK-N-SH中，建立穩定細胞株。利用H2O2和tert-butyl hydroperoxide (tBHP)作為氧化壓力來源，經48小時的處理後，Bβ2細胞株的存活率會急遽下降，由Annexin V和PI雙重染色的結果中證實是因細胞凋亡而降低存活率，但Bβ1細胞株則否。進一步轉殖LC3-EGFP質體和對酸性液泡胞器染色鑑定細胞自噬的發生，可以看出Bβ2細胞株本身便有些微細胞自噬體存在，當經氧化壓力後更引發Bβ2細胞株有更多細胞自噬體出現。但以細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)對細胞作前處理24小時後，再經過氧化物處理，則各Bβ2細胞株的sub-G1期細胞比例皆會下降，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。證明氧化壓力所引起的細胞凋亡是經由細胞自噬路徑而產生。另利用降低培養液中的血清濃度模擬營養缺乏的情況，當無血清培養48小時的Bβ1細胞株之sub-G1期細胞比例較Bβ2細胞株高出許多，當血清濃度降低時，Bβ1細胞株的酸性液泡胞器也較Bβ2細胞株的密度高，證實營養缺乏在Bβ1細胞株所引發的細胞凋亡是經由細胞自噬。本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別於氧化壓力和營養缺乏的壓力下，細胞所產生的生理變化，模擬神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對神經退化疾病的研究與治療有所助益。

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亞洲沙塵暴對臺灣東北方―黑潮海域生態系有機碳循環之影響

為探討亞洲沙塵暴 (Asian dust storm)如何影響黑潮海域有機碳循環的生成與變動，本研究在2006年三月沙塵暴可能侵襲期間，於臺灣東北方黑潮海域定點測站 (123° 10’ °E ; 25° 5’ °N)進行採樣研究。為便於分析比較，在此利用大氣懸浮微粒鋁元素 (Al)濃度做為判定沙塵暴事件之標準，並將其時程定義如下：「沙塵暴前」為沙塵暴侵襲之前三天的時期；「沙塵暴中」為Al濃度 > 3000 ng m-3時；「沙塵暴後」為沙塵暴侵襲之後三天的時期。研究結果顯示，「沙塵暴中」時期水體中的硝酸鹽 (0.16 ± 0.04 μM)、葉綠素甲濃度 (Chl-a；0.50 ± 0.16 mg Chl m-3)、初級生產力 (PP；9.95 ± 4.73 mg C m-3 d-1)、異營性細菌生物量 (BB；5.61 ± 0.56 mg C m-3)、及異營性細菌生產力 (BP；1.01 ± 0.12 mg C m-3 d-1)均較「沙塵暴前」有明顯提升的現象，其中異營性細菌生物量更在「沙塵暴後」時期達至相對高值 (5.93 mg C m-3)。進一步分析顯示黑潮海域植浮群聚可能受到沙塵暴帶來的微量金屬元素的刺激而促進其生長，此推測可由大氣所沉降的溶解性鐵元素濃度 (Fe-soluble)分別與PP (r = 0.94, p < 0.05)及浮游植物置換率 (Pμ) (r = 0.90, p < 0.05)之間有著顯著正相關得到佐證。此外，分析結果也顯示研究期間溶解態有機碳 (DOC)對Chl-a及BB積分平均值之間有一顯著關係式存在：IDOCavg = 1762.4 × IChl-aavg - 487.3 × IBBavg + 3302 (r2 = 0.94, p < 0.01)；此關係式建議在浮游植物大量生長的同時，水體中溶解態有機碳的濃度會隨浮游植物量的變化而改變，而此大量供應的基質(例如：溶解態有機碳)則會受到異營性細菌的利用。而初級生產力 (PP)與群聚呼吸率 (CR)之比值 (P/R ratio)為0.45 ± 0.40，據此研判研究期間，本海域是屬於異營性生態系，但值得注意的是「沙塵暴中」時期表層水體 (25 m以淺)的P/R ratio約為2左右，顯示此時水體中自營作用旺盛，浮游植物行光合作用所生合成的有機碳量足夠提供整體浮游生物群聚消耗，並可能有多餘的有機碳輸出。

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脊髓小腦共濟失調症：第八型脊髓小腦共濟失調症之外遺傳與細胞模式研究

摘要 第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8)是第一個被報導的單一三核苷重複擴增突變、由DNA兩股分別產生致病性的RNA (ATXN8OS)及蛋白質(ATXN8)產物的疾病。SCA8外顯性不完全，基因突變也見於極少數正常人及其他神經性疾病。ATXN8OS基因5’端有明顯的CpG島。本研究首先檢視正常人族群及帕金森氏症患者、原發性顫抖症及其他神經相關疾病患者族群之SCA8基因CTG重複變異，結果共發現一位正常人及兩位相關的肌肉營養不良症患者具CTG重複擴增的對偶基因。其次，在SCA8外遺傳研究方面，利用SCA8 CTG擴增的病人及其家屬及帶有SCA8 0~157個複合重複序列的胚胎腎細胞株DNA樣品，以PCR-based限制酵素及bisulfite定序技術，檢測ATXN8OS與KLHL1基因重疊序列上的CpG島甲基化情形。結果並未觀察到甲基化現象。另外也利用辨識緊密或疏鬆染色質結構的抗體及染色質免疫沈澱-PCR技術，來檢測SCA8基因的染色質結構。結果觀察到與CTG重複擴增相關的緊密染色質結構，但與DNA甲基化無關。最後，利用年齡、性別配對的正常人和CTG重複擴增病患的淋巴細胞株，探討對細胞自戕刺激物staurosporine或proteasome抑制劑MG-132的敏感性。病人淋巴細胞株在staurosporine (50 nM)及MG-132 (200 nM)濃度處理下，細胞死亡率顯著增加的結果，顯示SCA8的CTG重複擴增具細胞毒性。