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探討幽門螺旋桿菌熱休克蛋白 60 對人類周邊血液單核球抑制增生活性之位置

因幽門螺旋桿菌所造成慢性感染已被公認會導致消化道方面的 疾病，像是慢性胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關淋巴組織淋巴癌 (MALT lymphoma)，甚至有可能發展成胃癌。最近，根據報導由幽門螺旋桿 菌所分泌的熱休克蛋白 60 與胃部的發炎具有相關性。並且幽門螺旋 桿 菌 的 熱 休 克 蛋 白 60 已 被 證 實 可 誘 導 許 多 前 發 炎 激 素(pro-inflammatory cytokines)，例如 TNF-α、IL-8、IL-6 以及 IFN-γ。 有趣的是，有些文獻指出不同物種的熱休克蛋白 60 與免疫調控有相 關性。舉例來說，日本血吸蟲所分泌的熱休克蛋白 60 可誘導調控 T 細胞(Treg)的產生並達到抑制發炎的效果。而我們實驗室的先前研究 也顯示幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 可降低人類周邊血液單核球細 胞 (human peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)之增生活性，且 抑制前發炎激素的分泌，並是經由誘導細胞週期的停滯進而影響 PBMCs 的增生。這些發現指出幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 可能具 有兩種功能，分別是誘導發炎與免疫調控。根據文獻顯示幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 主要是經由 TLR-2 的路徑來造成發炎。另一方 面，幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 其胺基酸位置 300-435 也被證實 具有可誘導單核球細胞分泌 IL-8 的能力。然而，幽門螺旋桿菌的熱 休克蛋白 60 是由哪一個區域的胺基酸位置來誘發免疫調控仍然還是 未知。因此，我的方針為探討幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 的哪一 個位置具有免疫調控的能力。 為了達到這個目的，所以我們建構完整幽門螺旋桿菌的熱休克蛋 白 60 (胺基酸序列：1-547) 及五個不同的幽門螺旋桿菌熱休克蛋白 60 片段 (胺基酸序列：1-200、101-200、1-250、200-300 及 300-547)。 由於 Treg 細胞可經由 IL-10 或 TGF-β 這兩個細胞激素來抑制 CD4 + T 細胞的增生，所以我們藉由監控這兩個免疫抑制的細胞激素 (IL-10 及 TGF-β)來找出哪一個片段可誘發免疫調控。研究結果顯示，重組 的熱休克蛋白 60 (胺基酸序列：101-200 及 300-547)可誘導 IL-10 的分 泌。並經由可專一性辨識重組熱休克蛋白片段 60 (胺基酸序列： 101-200)的單株抗體進一步證實可負調控免疫抑制。這些結果顯示幽 門螺旋桿菌的熱休克蛋白 60 (胺基酸序列：101-200)可能與免疫抑制 有相關性。

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克雷白氏肺炎桿菌CG43中MrkH、 MrkI、MrkJ和CsgD在調控第一型與第三型線毛表現所扮演的角色

第一型和第三型線毛已被證實是克雷白氏肺炎桿菌的重要的致病因子。分析克雷白氏肺炎桿菌CG43基因體，我們發現這兩型線毛基因組相鄰座落，暗示二者的基因表現有協同調控的可能。本論文中，我們探討MrkH、MrkI、MrkJ、CsgD調控蛋白對此兩型線毛表現的影響。首先，分別構築mrkH、 mrkI 、mrkJ和csgD的基因剔除菌株，再藉由甘露醣競爭酵母菌凝集測試、西方墨點法、生物膜形成能力分析這些基因缺損的影響。結果顯示，mrkI基因剔除菌中第一型線毛表現增加而第三型線毛的表現量減少；mrkH基因的剔除也減少MrkA的表現量及降低生物膜活性，但不影響FimA的表現量；在mrkJ基因剔除株中，MrkA的表現量有些許增加，但生物膜活性卻略微降低；另一方面，csgD基因剔除後降低第三型線毛基因組啟動子活性。而在mrkI基因剔除株中，第三型線毛基因組啟動子的活性降低，但fimS翻轉變為正向的趨勢卻增加，此結果進一步證實MrkI調控蛋白在轉錄層次正向調控第三型線毛、負向調控第一型線毛的表現。此外，實驗顯示MrkJ重組蛋白具有磷酸二酯酶活性，這也暗示二級信使c-di-GMP在第三型線毛表現上扮演重要角色。最後，增加c-di-GMP結合蛋白MrkH表現能提高第三型線毛表現量，此結果更進一步支持了上述的假說。