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  • 學位論文

重組桿狀病毒載體結合FLP/Frt長期表現系統於人類間葉幹細胞之安全性評估

指導教授 : 胡育誠
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摘要


桿狀病毒已被證實可作為基因載體應用於間葉幹細胞之基因改質。然而桿狀病毒在哺乳動物細胞內不會進行複製,且病毒基因體和選殖基因會隨著細胞的增生,逐漸被稀釋和分解,造成轉殖基因表現期較短。因此本實驗室先前發展了一套具備長期穩定表現轉殖基因的系統,以BacFLP帶有特定點重組酶(Capone et al.) FLP基因,對BacCON-CE的Frt 序列間基因,進行催化反應,協助Frt 序列間的基因重組,形成存在於染色體的游離型態質體,並藉由來自EBV的oriP/EBNA1基因使之隨細胞依同複製。此系統可成功延長轉殖基因表現,並加速刺激幹細胞往硬骨分化,說明長效型桿狀病毒具有骨修復的潛能。為利於長效型重組桿狀病毒日後之發展及應用,本研究的目的為評估長效型桿狀病毒的安全性。我們利用BacFLP及BacCON-CE共同轉導人類間葉幹細胞,並未影響細胞存活及細胞生長速率。再者經長效型桿狀病毒轉導之間葉幹細胞由染色及Q-RT-PCR分析後,證明仍然可往脂肪、硬骨及軟骨分化。以PCR及FISH分析episomal及chromosomal DNA的結果,可發現長效型重組桿狀病毒基因及外源基因不會嵌入至轉導後細胞的染色體中。此外利用Karyotype、qRT-PCR及western blot分析轉導後之人類間葉幹細胞,發現並無染色體對數及結構之缺失或改變,且在抑癌及致癌基因上也沒有過度活化的表現。綜合上述,我們可知長效型重組桿狀病毒為一個安全有效的系統。

關鍵字

桿狀病毒 FLP/Frt 安全性

參考文獻


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