篩選與分離雲林地區土壤及根瘤固氮細菌

Screening and isolation of nitrogen fixation bacteria (NFB) from soils and plant root nodules in Yunlin, Taiwan.

陳氏戀(Luyen-Thi Tran)

指導教授 ： 羅朝村

國立虎尾科技大學/文理學院/生物科技研究所/碩士(2015年)

https://doi.org/10.6827/NFU.2015.00015

摘要

本 研 究 主 要 目 的 在 篩 選 與 分 離 自 雲 林 地 區 所 收 集 之 70 個 豆 科 根 瘤 及 土 壤 樣 品 中 的 固 氮 菌。 本 試 驗 先 利 用 YEMB 培 養 基 作 為 初 步 的 分 離 與 篩 選 固 氮 細 菌, 並 進 一 步 搭 配 元 素 分 析 儀 FLASH 2000 CHNS/O Analyzers 來 評 估 這 些 菌 株 的 固 氮 活 性。由 結 果 顯 示, 在 70 個 樣 品 中 可 分 離 出 63 支 菌 株, 但 僅 12 支 具 有 固 氮 能 力。在 這12株 具 有 固 氮 能 力 之 菌 種 中N02, N06, N09, P1, P3, P36及 P46 被 分 離 自 作 物 根 瘤 樣 品， 而 L7, L8, L10, L24 與 L30 則 是 被 分 離 自 土 壤 樣 品。無 固 氮 能 力 菌 株 中 之 P33 菌 株 在 YEMB 培 養 基 培 養 72 小 時 後, 經 元 素 儀 分 析，其氮 的 含 量 由 4.17 % 降 至 0.22 %, 而 碳 的 含 量 亦 由 24.96 % 降 至 5.74 %, 由 此 結 果 確 認 P33 菌 株 雖在 該 培 養 基 中 生 長 良 好 但 並 不 會 氨 的 產 生, 因 此 被 用 來 做 試 驗 之 負 對 照 組。
在 具 有 固 氮 能 力 之 12 菌 株 所 進 行 之分 析, 其 氮 源 在 最 初 24 小 時 會 有 些 微 降 低，但 隨 著 培 養 時 間 拉 長, 則 有 助 於 氮 源 的 增 加, 例 如 L24 及 L30 菌 株 在 培 養 72 小 時 後, 總 氮 源 分 別 增 加 4.61 % 及 3.10 %。確 認 這 些 菌 株 應 具 有 固 氮 能 力。
為 了 進 一 步 證 實 此 結 果, 我 們 在 溫 室 進 行 作 物 生 長 試 驗。即 以 篩 選 的 菌 株，編 號 N06, P46, L8, L10,P3, L24 and L30 等, 接 種 萵 苣 與 大 豆 進 行 固 氮 作 用 之 測 試, 以 便 觀 察 植 株 生 長 是 否 有 顯 著 差 異, 對 照 組 為 未 添 加 菌 的 植 株 並 以 無 氮 源 或 有 氮 源 之 養 液 作 為 澆 灌。試 驗 結 果 顯 示 L8 菌 株 在 根 的 濕 重、幼 莖 的 濕 重、葉 片 數、葉 片 的 長 與 寬 及 植 株 總 乾 重 分 別 為 對 照 組 之 1.27, 1.41, 1.11, 1.20, 1.24, 1.25 倍。這 些 菌 株 經 Biolog 系 統 生 化 分 析 及 16 分 子 rsDNA 分子 鑑 定: 菌 株 編 號 N02, N06, P46 及 L10 等屬 於 Bacillus aryabhattai; 編 號 N09, P1及 P33 屬 於 Pseudomonas rhodesiae ; 編 號 P3 屬 於 Streptomyces cellostaticus； 編 號 P36 屬 於 Pseudomonas synxantha; 編 號 L7 屬 於 Enterobacter hormaechei ; 編 號 L8 屬 於 Pseudomonas libanensis ; 編 號 L24及 L30 屬 於 Bacillus flexus. 這 些 菌 株 大 多 具 有 固 氮 的 能 力, 而 且 屬 非 共 生 性 之 自 由 群菌 (free-living group)。至 於 菌 株 P33 雖 與 N09 及 P1 同 屬 Pseudomonas rhodesiae，但 卻 有 不 同 固 氮 能 力, 是 否 在 固 氮 基 因 或 表 達 上 有 差 異, 實 值 得 進 一 步 研 究.

關鍵字

固氮菌 ； 萵苣 ； 黃豆

並列摘要

The study of my thesis aimed at screening and isolating nitrogen fixation bacteria from of 70 nodules and soil samples collected in different fields in Yinlin, Taiwan. Nitrogen fixing activity was first estimated by yeast extract mannitol broth (YEMB) medium and then supplemented by Visocolor Alpha Ammonia Detection Kit to detect the ammonium production. The nitrogen quantity of each culture medium was re-confirmed by FLASH 2000 CHNS/O Analyzers. The results showed we got 63 isolates of bacteria, only 12 isolates exhibited the nitrogen fixing ability. The 12 strains with nitrogen fixing ability included N02, N06, N09, P1, P3, P36, and P46 which were isolated from the root nodule samples and L7, L8, L10, L24 and L30 were isolated from the soil samples. The strain P33, one of 63 isolates, was good growth on YEMB medium, but was no ammonia excretion. As a result, the strain was considered as the negative control as compared to the 12 strains with nitrogen fixing ability for FLASH 2000 CHNS/O Analyzers to nitrogen detection and greenhouse tests. For FLASH 2000 CHNS/O Analyzer tests, the percentage of nitrogen and carbon of P33 in solid medium have been reduced from 4.17 % dropped to 0.22 % and 24.96 % dropped to 5.74 %, respectively after 72 hours incubation. However, another 12 isolated strains, had positive by using an ammonia test kit. Even though nitrogen source decreased at initial 24 hours among those strains, and then were gradually increased after 36 hours incubating time. All of 12 strains had higher nitrogen accumulation as compared to the initial % nitrogen content. For example, the strain L24 increased 4.61 % of total nitrogen, and 3.10 % with strain L30 after 72 hours incubation. The results demonstrated that almost tested strains could be of the ability of nitrogen fixation. Generally, solid medium with non-inoculated bacterial control contains 4.17 % nitrogen, and 24.96 % carbon. In greenhouse tests, strains, including N06, P46, L8, L10, P3, L24, and L30 had significantly increased plant (lettuce and soybean) growth as compared to control without bacteria inoculation. For example, strain L8 inoculated on lettuce had the significantly higher weight of fresh root, weight of fresh shoot, number of leaves, length and width of leaves, and dry weight of 10 plants than that of un-inoculated plant control to 1.27, 1.41, 1.11, 1.20, 1.24, and 1.25 – fold, respectively. These Nitrogen-fixing bacteria were identified as strains N02, N06, P46, and L10 belong to Bacillus aryabhattai. Strain N09, and P1, belonged to Pseudomonas rhodesiae. Strain P3 belonged to Streptomyces cellostaticus. Strain P36 belonged to Pseudomonas synxantha. Strain L7 belonged to Enterobacter hormaechei. Strain L8 belonged to Pseudomonas libanensis. Strains L24, and L30 belonged to Bacillus flexus according to 16S rRNA sequencing. All of the species above had nitrogen fixer ability, and belonged to the non-symbiotic group. Interestingly, strain P33 also belonged to Pseudomonas rhodesiae, but it had not nitrogen fixer ability, and also did not promote crop growth. In contrast, 2 other strains (N09, P1) increase nitrogen in culture medium and enhance lettuce and soybean growth. Therefore, need to more investigate in molecular ways such as detect nif genes and RNA expression to distinguish among strains (N09, P1, P33).

並列關鍵字

Nitrogen fixation bacteria ； lettuce ； soybean

參考文獻

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