高雄醫學大學醫學研究所學位論文
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多種促進傷口癒合之方法中，光調節刺激(photo-modulated stimulation) 的方式，無論是在細胞外或細胞內的實驗皆有獲得證實。但光調節刺激(photo-modulated stimulation) 的方式應用於幹細胞促進生長或分化之相關研究目前較少為人所探討，特別是在低能量雷射low level laser (LLL)中的Light emitting diodes(LEDs)，是光治療的新起之秀，現已漸應用於臨床治療。我們的團隊已建立有完整之人類脂源性前驅/幹細胞(human adipose-derived progenitor/stem cells)之分離、培養、及分化平台，本研究將利用此平台來進行有關低能量雷射在幹細胞分化及生長方面的影響。 我們將使用不同波長之LEDs（470nm LEDs或640nm LEDs）照射人類脂源性前驅/幹細胞，爾後與未照射LEDs之脂源性前軀/幹細胞比較其細胞增生速率、細胞存活率，以及在脂肪誘導生成方面的差異性﹔此外，比較有無照射LEDs之人類脂源性前驅/幹細胞，找尋最適合人類脂源性前驅/幹細胞分化的特定波長，照射能量及時間，若有正面結果，能被利用於促進傷口處的前驅/幹細胞的分化及增生，有助傷口的癒合，甚或應用在組織工程或重建，則LEDs光治療法將可作為非侵入性且廣泛之促進傷口癒合的治療方式。
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砷是一種具毒性的類金屬化合物，且廣泛分佈於大自然環境中。人類接觸此種化合物已知會導致癌症發生率大幅增加。臨床觀察發現：皮膚乃是砷中毒主要的標的，也是病灶出現時最顯而易見的表徵。致癌機轉目前包括砷氧化壓力、基因的毒性損傷、DNA修復的抑制、epigenetic，和刺激某些訊息傳遞路徑而導致不正常的基因的表現等，都牽涉其中。高濃度砷所引起皮膚角質細胞與淋巴球凋亡已有充足的研究，然而，在癌化的波文氏病檢體中亦證實有自噬作用共同存在。本研究探究砷引起之自噬作用（第2型細胞計畫性死亡），其特徵是具有大量囤積自噬泡（自噬體）在細胞質中的細胞，它是有別於細胞凋亡(第一型細胞計畫性死亡)的細胞死亡途徑，具有保護細胞生存的潛質。穿透式電子顯微鏡與螢光染色顯示經砷處理的角質細胞出現許多自噬體，並且與濃度成正相關。反之，活化態的自噬體成形的表現在低濃度被增強，而在高濃度增強程度更顯著，但有更多比例的細胞直接進入死亡。以雷射掃描式共軛焦顯微鏡進行螢光染色的觀察，亦顯示低濃度(≦1μm)的砷進行以自噬作用為主的細胞保護機制，而在高濃度(≧5μm)砷的暴露則同時增強自噬作用與細胞凋亡，在更高的濃度下(>10μm)則細胞凋亡的程度超越自噬作用。藉由以外加藥物Rapamycin(mTOR的抑制劑)發現自噬作用增加，外加藥物3-MA(PI3K-BECN的抑制劑)則發現自噬作用減弱但細胞凋亡同時被抑制。進一步探究砷所引起的自噬作用路徑，發現其會經由Erk1/2(細胞外訊息調節蛋白磷酸脢)的磷酸化，磷酸化-Akt 的抑制，與bcl-2的抑制而導向自噬作用的發生。臨床上觀察到砷引起的皮膚癌變往往是在低濃度暴露歷經漫長年月而產生，藉由本研究結果得出角質細胞在低濃度砷暴露後走向以自噬作用為主的細胞救援路徑，以保全細胞生存為最大目的的前題，亦有將極少輕微受損的DNA及未清除之氧化壓力傳遞給子代而逐漸累積細胞癌變的風險，此作用或可解釋砷致皮膚癌變需經年累月漫長而發生。本研究澄明不同濃度下砷對角質細胞的自噬或凋亡的交互作用有助於了解皮膚計畫性死亡的調控與找尋化生或癌變的機制。
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目標： 利用影像強度擾動分析法(image strength fluctuation, ISF)與統計參數圖譜法(statistical parametric mapping, SPM)分析阿茲海默(Alzheimer’s disease, AD)在單光子電腦斷層攝影(SPECT)之腦血流變化。 材料與方法： 本研究為回溯性研究，30位99mTc-HMPAO SPECT影像經核醫科醫師判讀正常並排除電腦斷層(CT)或磁振造影(MRI)有異常者為正常組，包括17位男性與13位女性，平均年齡為41.2 ± 22.9歲，30位SPECT腦血流影像經核醫科醫師判讀為典型阿茲海默症(AD)為疾病組，包括16位男性與14位女性，平均年齡為76.5 ±9.4歲。利用SPM軟體內建之SPECT模版，將受試者的影像資料作正規化(normalization)和平滑化(smoothing)後，分別以SPM和ISF來分析正常組與疾病組腦血流變化。ISF方法主要利用Z分數(score)方法，找到有異常擾動的組距區間，並比對正常與不正常切片的影像。從比對中，作影像的補集運算，尋找冷熱區，然後查閱原始影像的灰階值，確定冷熱特徵點，且藉此特徵點來連結腦部功能區。 結果: SPM分析結果顯示疾病組在兩側下頂小葉區(inferior parietal lobule)、左顳葉區的內上腦迴(middle or superior temporal gyrus)、右顳葉區的上腦迴(superior temporal gyrus)及右顳葉區的次葉腦島(sub-lobar insula)等區域比正常組的大腦血流有顯著減少。ISF結果與SPM的座標軸，高達83.3%的區域是吻合的。 結論: 利用ISF，可以分析核醫鎝-99m六甲基丙烯胺肟(99mTc-HMPAO)腦血流影像異常的區域，其結果與SPM一致。
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骨關節炎（osteoarthritis，OA）為最常見的關節炎疾病，通常好發於中老年人，其疾病特徵主要為關節疼痛及關節軟骨磨損流失。隨著老年人口逐步提升，如何預防此疾病發生已逐漸受到重視，已有研究證實，硫化軟骨素能有效抑制發炎反應，降低關節腫脹及疼痛。有文獻指出血液中維生素C及維生素D含量較低者，其罹患骨關節炎的機率為正常人的三倍，顯示維生素C和維生素D可能有助於延緩骨關節炎之發生。然而，硫化軟骨素、維生素C及維生素D對於緩解骨關節炎之詳細調控機制仍尚未完全了解。因此本篇研究探討硫化軟骨素（chondroitin sulfate，CS）、維生素C（ascorbic acid，AA）及維生素D（1,25(OH)2D3）對於碘醋酸鈉（mono-iodoacetate，MIA）所誘發大鼠骨關節炎及人類軟骨細胞株SW-1353損傷後的保護影響。動物試驗（in vivo）結果顯示，大鼠關節腔內注射3 mg MIA導致軟骨組織降解及血漿中介白素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及一氧化氮（nitric oxide，NO）的大量表現。然而當給予大鼠餵食4 mg / 500 μl 硫化軟骨素後，則有效降低發炎性細胞激素及一氧化氮的表現量，進而緩解軟骨損壞。細胞試驗（in vitro）中，以添加4 μM MIA刺激軟骨細胞損傷，再合併給予硫化軟骨素、維生素C及維生素D進行探討。其結果顯示相較於硫化軟骨素及維生素D，濃度100 μM 以上的維生素C 能有效保護MIA對軟骨細胞造成的直接損傷，其機轉為透過抑制TRAF6、MEK1、ERK1和JNK的表現，降低c-fos、c-jun和NF-κB轉錄活化，減少介白素-1β、基質金屬蛋白分解酶-1、-2、-3、-9之表現，以減緩軟骨細胞外基質流失達到保護軟骨細胞之功效。 綜合上述，硫化軟骨素藉由抑制MIA所誘發體內免疫發炎及NO產生來預防骨關節炎發生，但無法保護MIA直接誘導的軟骨細胞損傷；而維生素C則能直接保護軟骨細胞株SW-1353免於MIA的傷害，進而達到保護軟骨組織免於破壞之功效。顯示硫化軟骨素及維生素C較維生素D更具有保護軟骨組織之功效，故可延緩骨關節炎病程之惡化。
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1998年，台灣爆發腸病毒大流行，造成恐慌，腸病毒的嚴重性也開始被重視，台灣地區位在亞熱帶，所以全年都有感染病例出現，仍以夏季為主要流行季節。腸病毒感染併發重症之型別以腸病毒71型 ( EV 71 ) 為主，目前為止是沒有臨床用藥和疫苗，因此本論文目的在研究中草藥來防治腸病毒71型 ( EV 71) 感染之可行性。 葛根湯曾報導可以抑制流行性感冒病毒、單純疱疹病毒、和腸病毒71型感染，因此選擇了葛根湯和其單方【甘草】，利用細胞病變抑制法( cytopathic reduction assay ) 和病毒溶斑抑制法 ( plaque reduction assay )，研究抗病毒 EV 71 之活性成份和機轉，結果顯示：葛根湯與甘草抑制病毒感染50%的劑量( IC50 )分別為1.82 ± 0.46 μg/ml和1.36 ± 0.19 μg/ml，選擇指數( SI )分別是大於1648和2206，証實這兩種藥物都可以有效 ( IC50值低 ) 以及安全 ( SI值高) 抑制EV 71感染。時間效應實驗發現感染前後皆有抗病毒活性，顯示皆有預防和治療之功效。 甘草相關純化合物抗病毒實驗顯示皆有很好的抗EV 71效果： (1) 三萜類化合物: glycyrrhizin的IC50為1.30 ± 0.07 μM，SI值為215.3；18 α - glycyrrhetinic acid的IC50為1.61 ± 0.06 μM，SI值為117.5；18 β - glycyrrhetinic acid的IC50為1.56 ± 0.04 μM，SI值為109.5；(2) 類黃酮化合物 : liquiritin的IC50為2.01 ± 0.35 μM，SI值為61.6；isoliquiritigenin的IC50為1.80 ± 0.07 μM ， SI值為94；kaempferol的IC50為1.53 ± 0.11 μM，SI值為125.7；(3) 異黃酮化合物: glabridin的IC50為2.16 ± 0.31 μM，SI值為75.7；genistein的IC50為 1.60 ± 0.19 μM，SI值為103.9。 時間效應顯示甘草成份中的liquiritin、isoliquiritigenin和glabridin在感染前後皆有很好的抗病毒活性，而且其預防病毒EV 71吸附作用和病毒穿透細胞能力均會隨著劑量上升而增加。 干擾素分泌量結果顯示甘草成份中的liquiritin、isoliquiritigenin 和 glabridin能有效誘生干擾素，但是均無法有效促進已經感染病毒的細胞分泌干擾素，因此抑制感染後病毒複製的機轉不是經由干擾素。 依據甘草成份實際含量之抗腸病毒71型活性分析顯示：liquiritin、isoliquiritigenin和glabridin三種甘草純化合物混合後抑制EV 71感染活性為80.9 ± 2.8 %，其抗EV 71活性和甘草的93.4 ± 1.4 % 接近，因此liquiritin、isoliquiritigenin和glabridin可能是甘草抗EV 71活性的主要成份。 抑制病毒溶斑實驗結果進一步證實葛根湯、甘草和甘草成份中的glycyrrhizin、liquiritin、isoliquiritigenin和 glabridin均可以有效抑制EV 71病毒 ，而且呈現劑量效應。 本論文研究結果顯示葛根湯、甘草和八種甘草純化合物，皆有抑制腸病毒71型感染活性，甘草抗病毒主要成分可能是liquiritin、isoliquiritigenin和glabridin，未來可以再深入探討其抑制感染後EV 71病毒複製以及藥物應用性。
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在臨床上，5-fluorouracil (5-FU)被廣泛應用在治療許多類型的癌症上，其中也包含了口腔癌。然而，5-FU的抗藥性經常導致癌症的復發或是治療的失敗，被視為癌症治療的阻礙。目前對於5-FU抗藥性的分子機轉仍未被清楚了解。因此本篇研究的目的是探討在5-FU抗藥性的口腔癌細胞株，其DNA修復能力是否有所改變。研究策略是利用不同濃度的5-FU長期處理口腔癌細胞株(KB及SAS)，建立抗藥性細胞株KB-F5、KB-F10以及SAS-F1；再針對這些細胞株進行DNA修復能力的分析。結果發現：具有5-FU抗藥性的細胞株，其細胞核苷酸切除修復能力是下降的；KB-F5及KB-F10其同源性重組修復的能力會比parental KB高，在SAS-F1與parental SAS之間則沒有顯著差異。在非同源性接合修復能力方面，KB-F5及KB-F10與parental KB並沒有顯著差異，而在SAS-F1會比parental SAS高。分析基因表現後發現，有抗性的細胞都具有p53蛋白質表現量上升的情形。先前研究指出，若p53的活性喪失，可能會導致5-FU抗藥性的產生。所以我們進一步分析其p53的轉錄活性，發現具抗性的細胞有下降的情形。綜合以上結果得知：具5-FU 抗性的細胞株，其細胞核苷酸切除修復能力會降低，KB-F5及KB-F10的抗藥性原因可能是由於同源性重組修復能力增加，而SAS-F1的抗藥性原因可能是由於非同源性接合修復能力增加。
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研究背景 口腔外科手術的發展日新月異，由於口腔的手術空間較小且頭頸部的血流供應良好，手術中常需要執行控制的低血壓麻醉以降低手術部位之出血量，減少對於輸血的需求。但是低血壓麻醉後病患的認知功能是否會有變化仍是未明，若對認知功能會有不良影響則在此技術的操作需更加謹慎，故設計此研究。 研究目的 研究手術中有無出現控制的低血壓對於病患術後認知功能有無影響。 研究方法 把接受口腔外科手術全身麻醉的病患(ASA第一、第二級)，若手術中有出現平均動脈壓低於65毫米汞柱超過一小時分入實驗組；若無出現此情形則分入控制組。麻醉前，與麻醉後24-36小時各測ㄧ次WCST與WAIS-III測驗，觀察有無出現低血壓是否造成不同變化。 研究結果 共收集41位病患，麻醉中有無出現平均動脈壓小於65毫米汞柱超過一小時，並不影響麻醉後的認知功能變化。統計上，發現年紀較輕者，麻醉時間較久者較易出現低血壓。 研究結論 麻醉中因手術需要把血壓降至平均動脈壓小於65毫米汞柱持續一小時，並不會造成病患認知功能與沒有出現低血壓者出現顯著差異。但手術時間較久，年紀較輕者需特別注意低血壓發生。
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背景：肝癌是原發於肝臟最常見的惡性腫瘤。大部分發生肝癌的個案不外乎是由於B型或C型肝炎病毒感染所導致，或是肝硬化之後的結果。而導致肝硬化另一個重大的原因，就是長期的酗酒所導致的酒精性肝炎之後的變化。肝癌的患者通常疾病的惡化很快，而且死亡率很高，但目前除了血液中胎兒蛋白的濃度外，並沒有一項很好的預測疾病預後的生物標誌。CD66a是癌胚抗原家族的一個次分類，是一個與細胞之間的黏合相關的一種蛋白質。我們檢視CD66a在肝癌細胞與正常肝細胞之間的病理上的變化，並同時與其他的臨床資料納入一起分析，另外加入CD34在肝細胞癌的表現，試圖找出他們之間的關連性。 材料與方法：從1993年到2003年10年間，我們收集了86位因為肝癌而在高雄醫學大學附設醫院作肝切除的手術的病人，以他們作為研究的對象。我們以手術切下之後的組織蠟塊作為我們研究的材料。分別選取肝癌的組織及相對周邊正常的肝組織，以人工的方式作成組織陣列蠟塊，再以此蠟塊實施CD66a及CD34的免疫組織化學染色。除了CD66a及CD34的表現之外，其他的參數包括年齡、性別、有無B型或C型肝炎之病史、血中胎兒蛋白的濃度、腫瘤的大小、組織分化程度、腫瘤的分期、有無血管侵犯、發病時是否存在肝硬化病變、以及微小血管增生密度等。經由統計的分析，我們檢視各個變項之間的關係。 結果：在86位病人當中，我們發現其中有47位病人，他們的CD66a在肝癌組織呈現瀰漫性的表現(包含細胞膜或細胞質的呈色)，而有39位病人，他們的CD66a在肝癌組織上卻沒有任何的表現。雖然這樣子的結果與其他的臨床及病理變項皆沒有呈現顯著的相關性，但是我們發現在腫瘤的大小和肝細胞癌術前有作過動脈血管栓塞與CD66a的免疫染色表現是呈現負相關(P=0.016, P=0.038)，而肝細胞癌病患的脂肪肝變化與CD66a的表現呈現正相關(P=0.009)。而微小血管增生密度與CD66a的免疫染色表現是呈現正相關(P=0.016)。而這些在統計學上都是有顯著性差異的。 結論：CD66a在正常的肝細胞上面是以管腔式的線狀呈現，而在肝癌細胞卻有細胞膜、細胞質甚至完全不表現的方式呈現。在統計的結果來看CD66a在肝癌組織上的表現與術前是否作過動脈栓塞治療、脂肪肝病變、腫瘤大小和微小血管增生密度有顯著性的相關，這可能意味著在CD66a的表現可能與早期肝細胞癌的發生有相關，而CD66a的不表現可能是代表癌細胞更惡化。
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根據世界衛生組織之流行病學統計顯示： 80 ％ 的肝癌病例與慢性 B 型及 C 型肝炎有關，其餘 20 ％ 則包含飲酒過度、脂肪肝以及其他的代謝異常。 有趣的是，越來越多的證據指出肝癌的發生與進展和肥胖以及代謝異常有關。部份脂肪組織衍生而出的因子例如脂肪激素也因此被認為可能在肝臟的致癌機轉中扮演某些重要的角色。儘管已有許多的證據指出脂肪激素之ㄧ的脂聯素可能影響癌症的發生及進展，有關脂聯素是否在肝癌發展中有所貢獻的資訊仍舊缺乏。 本篇研究中，我們的結果顯示脂聯素在60 ％ 之肝癌組織切片中的細胞質表現量明顯增加。高達 63.2 ％ 的肝癌組織中脂聯素之核醣核苷酸表現量亦較其對應的非腫瘤肝組織高。當脂聯素染色增加時，肝癌病患術後復發的機率較染色量低之患者高 ( p=0.047 ) ，整體存活率亦相對較差 ( p=0.007 ) ；同時，以多變因之Cox 存活率回歸模式分析後，脂聯素染色量的增加可做為肝癌病患存活率降低的有效決定因子 (Odd ratio 為 3.327；95 % 之信賴區間範圍為從1.207 至 9.173；p=0.020 )。有趣的是，當脂聯素在HepG2和Hep3B 肝癌細胞株中的表現量增加時，不僅可增加活化之 AKT、活化之STAT3 以及 β-catenin 的表現量；細胞增生及移行侵犯能力亦會隨之增加。更甚者，持續提高脂聯素的表現於 Hep3B 與 HepG2 後，癌細胞能夠減少生長附著的需求而在軟瓊脂中形成群落。由於 PI3K/AKT的抑制劑LY294002可抑制脂聯素所誘導的效應，我們推測這些生物性效應可能導因於 AKT 的活化。此外，脂聯素受體二之特異性小干擾性核醣核苷酸以及脂聯素特異性抗體均能有效削弱脂聯素所誘導的 AKT與 STAT3 之活化作用,以及 β-catenin 的表現。這些結果顯示，脂聯素對於肝癌細胞所誘導的生物性效應及訊息傳遞，可能藉由脂聯素受體二以及活化的 AKT 及 STAT3 與 β-catenin 之下游機制所致。綜合上述，增加的脂聯素可能在肝癌的發展上扮演了某些關鍵性的角色，更詳細的機轉仍需進一步的研究探討。
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在人類的基因體中，約有小於2%的鹼基可表現出蛋白質，其他大於90%以上的區域可轉錄但不能轉譯成蛋白質的RNA，稱為非編碼RNA(non-coding RNA ；ncRNA)。 其中以rRNA、tRNA、miRNA及snRNA等有較多的研究外，ncRNA的研究相當少。而與癌症有關的研究除了miRNA及少數的ncRNA外，其他的也並不多，特別是非常長的ncRNA (>5kb) 在癌症形成過程所佔角色的相關研究更少。本研究的目的是利用原位雜交技術 (FISH) 分析比較ncRNA在肝腫瘤細胞及其鄰近正常細胞的表現。 在本篇實驗中，利用生物資訊的方法得到40個大於5000bp以上的large ncRNA，利用即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time quantitative Polymerase chain reaction；Real-time quantitative PCR）分析這些large ncRNA在肝癌的表現，結果得到4個large ncRNA，其HCC的癌細胞與其鄰近正常細胞確有差異表現。 我們進一步利用原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization；FISH)染色的石蠟切片，在螢光顯微鏡下，HCC的癌細胞與其鄰近正常細胞所呈現的情形，和即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time quantitative PCR )所呈現結果是一致的，並可得知ncRNA在cell中的位置。由此可見，我們可以用HCC病人開刀後的檢體所做成石蠟切片，利用FISH的方法來觀察其large ncRNA在肝臟組織細胞中的表現，此方法不但可以利用多年前的蠟塊檢體，也同時可觀察large ncRNA在細胞的分布情形，這是即時定量聚合酶連鎖反應所缺乏的。