中正大學化學暨生物化學系學位論文
國立中正大學,正常發行
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本論文主要是研究藉由具有環烯酮側鏈之不同苯甲醛化合物46b-n作為起始物，利用氮-雜環碳烯催化分子內Stetter反應的進行，建構出一系列具有螺環[5.5]十一烷骨架的芳香螺環化合物45b-n，其產率介於30~87% 之間。 芳香螺環化合物之前驅物46b-n的製備主要是利用市售的2-羥基苯甲醛作為起始物，經由三氟甲磺酸酯基取代反應、Sonogashira反應及選擇性氫化反應等三個步驟，得到碳鏈延伸之苯甲醛化合物。而應用於Sonogashira反應中之炔基側鏈49a-c的製備則是由市售的五、六及七員環烯酮作為起始物，經由烷基取代反應、氧化重排反應及水解反應等三個步驟，可以得到末端炔之化合物。
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本論文分為兩部分，第一部分是對於以天然物schisansphenin B合成的研究，以化合物32為起始物，經過碳–異丙烷基化、Dieckman condensation反應、三氟甲磺酸酯基化得到化合物28，再與側鏈42進行1,4-加成消去反應得到化合物45，再以酸性條件下進行水解反應，最後用二碘化釤進行螺環化反應進而完成schisansphenin B骨架的建構。 第二部分在研究利用二碘化釤合成五員環與六員環的氧代螺環化合物。以環烷二酮為起始物，藉由脫水反應延伸側鏈形成β酮烯醚化合物，再進行雙羥化反應與氧化反應，得到螺環化合物前驅物，最後以二碘化釤試劑進行分子內環化反應，得到4-醇基-1-氧代螺環[4.5]癸烷-7-酮（86）、5-醇基-1-氧代螺環[5.5]十一烷-8-酮（87）、4-醇基-9,9二甲基-1-氧代螺環[4.5]癸烷-7-酮（88）、5-醇基-10,10-二甲基-1-氧代螺環[5.5]十一烷-8-酮（89），產率為20-50%。
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本研究主要在探討金奈米柱與鍍層間之界面結構對光致熔化現象的關係。我們採用不均勻二氧化矽包覆的金奈米柱核殼粒子（silica coated gold nanorod with non-uniform thickness in major and minor axes; AuNR-nu-SiO2）做為基本的奈米系統探討金奈米柱的光致熔化現象，其中兩端厚度（end-thickness, ET）極薄約為1 nm左右，金奈米柱於兩端接近裸露；而其側邊厚度（side-thickness, ST）約為12 nm左右。至於此一奈米系統，我們設計兩種金奈米柱與鍍層間之界面結構：其一為化學鍵結，另一則為物理吸附；前者標示為AuNR-SH-nu-SiO2而後者則標示為AuNR-CTAB-nu-SiO2。前者的鍍層工作是以（3-硫基丙基）三甲氧基矽烷（(3-mercaptopropyl)trimethoxysilane; MPS）作為水解縮合步驟的前驅物，而後者則以四乙氧基矽烷（tetraethyl orthosilicate; TEOS）為之。在AuNR-CTAB-nu-SiO2奈米結構中，溴化十六烷基三甲銨（hexadecyltrimethylammonium bromide; C16TAB）為金奈米柱原本的穩定劑，在殼層生長過程中並未被取代，並擔任了轉接層的角色。我們這項設計主要想證實界面結構的不同將會導致在側邊熱傳導的差異，進而造成金奈米柱內的中間與兩端的溫差。我們期待金奈米柱的光致熔化現象將提供我們有效的機制藉以觀察界面結構的這項效應。 我們也瞭解金奈米柱在吸收其表面電漿特徵波長的光照後，將極有效率地轉變為熱能，而此熱釋放在殼層的熱傳導速率會受殼層的材質與緻密度影響。在我們設計的奈米系統中，殼層的材質同為空洞型的二氧化矽，為了凸顯界面結構對於異向性熱釋放之效應，我們首先必須確認兩種不同界面的殼層緻密度是相同的。這一項鑑定工作是透過吸收光譜中金奈米柱的長軸表面電漿共振特徵吸收波帶的偏移量，以及孔洞表面積的量測作為證據。針對具有兩種不同界面結構的奈米粒子，光致熔化實驗的結果顯示，界面結構為化學鍵的奈米粒子，AuNR-SH-nu-SiO2，其中的金奈米柱則產生高達約70%的縮熔（melting; rod-to-sphere and its intermediates），同時未發現有任何裂熔（split-melting）產物的生成。然而在界面結構無化學鍵的AuNR-CTAB-nu-SiO2粒子中，金奈米柱僅約20%的粒子會產生縮熔，同時我們觀察到有相當程度比例的裂熔產物生成，其比例約有40%。追究這兩個奈米結構的光致熔化現象有如此明顯差異的緣由，我們歸因於界面作用力大小不同所致。界面作用力的大小會影響熱傳導速率，作用力越大者導熱越快，所以在殼層材質與緻密度相同的條件下，AuNR-CTAB-nu-SiO2因為界面結構的作用力相對來說較小（約9 kcal/mol），因此導熱較慢，造成金奈米柱內的中間與兩端溫度差相對來說較大，而此較大的位差足以產生約40%的裂熔。反觀AuNR-SH-nu-SiO2因界面結構為化學鍵，其作用力相對較大（約45 kcal/mol），因此導熱較快而使該溫差較不明顯，造成絕大部分進行縮熔，而無裂熔形變的現象。我們也嘗試將AuNR-CTAB-nu-SiO2粒子的殼層厚度增加，觀察到在界面結構與殼層對熱釋放的加成效果下，金奈米柱的的裂熔比例隨殼層厚度增加而降低至30%，縮熔比例則是上升達45%。認為是因為殼層增厚將金奈米柱全包覆，降低了熱釋放的方向性差異，但由於界面結構對熱釋放的局限，所以仍有裂熔形變的產生。同時也觀察到金奈米柱裂熔形變的情況隨殼層厚度增加而從原先裂成兩顆球狀變成裂熔為兩短柱狀粒子。 關鍵詞：金奈米柱、光致熔化
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本研究的目的是利用離散偶極近似(Discrete Dipole Approximation, DDA)理論方法計算金屬奈米粒子的消光光譜及光誘發電漿子共振之近電場，用以設計具有可開發潛力的各式金屬奈米粒子。首先，由DDA軟體計算所得之奈米金球表面電漿共振最大特徵峰在530 nm，而奈米銀球表面電漿子共振最大特徵峰為400 nm，此兩種奈米粒子計算光譜皆與實驗結果大致上符合。之後計算銀奈米立方體，金奈米棒在不同長寬比下的理論光譜圖並與實驗比較，並得到光吸收位置及吸收強度與幾何結構的關係。進一步計算建構式金屬奈米粒子之消光光譜及表面電漿子共振之近電場，作為合成新型奈米粒子的依據。 我們模擬長寬比分別為2、3、4的金奈米棒，所得之光譜與實驗上大致吻合:隨著長寬比增加，縱向表面電漿子共振(LSPR)波峰紅位移，消光值也跟著上升。但有幾處波峰是在實驗上沒有觀察到的。那幾處波峰可能是因為在建立理論金棒的模型時，由於構成理論模型時偶極子數目不夠多，造成結構不連續，以致於在理論光譜圖上會看見這幾處假波峰的存在。當偶極子數目增加時，這些波峰強度會下降。在銀奈米立方體，當體積增加時，最大特徵峰會紅位移，與實驗數據所得大致相符。而光譜圖裡，除了原本預計會有三處的特徵峰外，則另外多出兩處的波峰在實驗上沒有觀察到。在這我們認為可能的因素也是因為實際樣品表面電漿子共振上遇晶格缺陷而有減震效應(damping)，造成譜線變寬，三個譜線重疊，所以只看到一個吸收峰。 由於本實驗室之後的研究會朝建構形狀之奈米粒子，用不同的形狀及不同的材質去做組合，研究熱點效應所造成的電場強度影響。 研究建構式奈米粒子過程中發現想要有熱點效應兩種金屬的最大表面電漿子共振峰需要夠近才能產生耦合。兩粒子接近的地方需要是多電子聚集的地方，如尖角或邊，如此一來才會有熱點效應的產生。兩粒子電漿子共振的偏振方向平行時，耦合效應會最大。
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奈米銀的表面電漿子共振強度雖比奈米金高，但是在銀棒的製程上難以得到好的產率與均勻度；相對地，奈米金發展歷史悠久，至今已有不少製程能夠合成高產率且粒徑均勻的金棒，但其表面電漿子共振的強度卻相較於奈米銀弱。在幾何結構上，相較於球型角狀結構會因為電子的聚集而擁有更強的表面電漿子共振強度。因此我們想尋找一種金棒＠銀尖端的核殼結構，藉由互補的概念，既賦予此類複合型的奈米粒子既有好的表面電漿子共振強度亦能維持幾何形狀的均勻度。 我們使用無預金種法（in-situ seed growth）合成金奈米棒，藉由成核與成長在同一反應環境中，減少化學藥品的消耗，提供了簡單、快速合成金奈米棒的方法。我們藉由調整硝酸銀濃度控制金棒的長寬比。研究結果得到當硝酸銀濃度範圍控制在0.02 mM ~ 0.08 mM之間，相對應的長軸表面電漿子共振波帶及金棒長寬比皆能與硝酸銀濃度呈線性關係，其決定係數R2分別為0.9924及0.9975。 接著我們選用長寬比約莫3的金棒作為基板。由於金棒兩端曲率大，使得介面活性劑cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）吸附得比側邊{110}面少，能夠讓銀離子先還原並沉積在金棒的兩端，逐漸形成Ag-Au-Ag異相結構。經由製程上不斷地改良，我們控制了成長液的pH值調整還原劑的強度，調控[Ag+]：[AA]：[Au3+] 試劑之間的比例以確保加入的銀鹽能夠完全地被還原，並克服了因金棒基材寬度不一造成曲率差異的問題。最終我們成功合成了尺寸相近，形狀均勻之金棒＠銀尖端的核殼結構。但溶液中有過多的Br-會與Ag+形成CTA-AgBr複合粒子沉澱，造成吸收光譜產生許多雜訊。故我們使用傾析法並降低CTAB/AgNO3的比例去減少吸收光譜中的雜訊干擾。 最後，我們使用R6G、4-NTP分子去測試不同形狀、組成之金銀核殼奈米粒子其拉曼增強的效果。考慮不同種類的奈米粒子會因本身的寬度而造成兩端吸附分子多寡的因素，我們將拉曼訊號強度對奈米粒子溶液濃度及粒子兩端的表面積做正規化的處理。證實拉曼增強效益會因金棒兩端奈米銀的存在而有所提升。對於4-NTP分子，拉曼訊號強度在金棒@銀尖結構對上單純金棒強度之比值為3.8倍，而在金棒@銀殼結構對單純金棒強度比值為4.4倍；對於R6G分子，拉曼訊號強度在金@銀尖結構對上單純金棒強度之比值為0.9倍，而在金@銀殼結構對單純金棒強度比值為1.0倍。由於我們假設金銀核殼粒子的濃度與原金棒濃度一致，而實際合成過程中離心會造成粒子數目的損失，故這些估計的強度比值皆為下限。 中文關鍵字:金銀核殼結構,表面增強拉曼散射
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蛋白質上的半胱胺酸(cysteine)與穀胱甘肽產生硫化作用形成重要的蛋白質轉譯後修飾，其已被驗證會影響蛋白質的結構和功能並導致疾病。本實驗使用奈升流速液相層析奈電噴灑游離串聯質譜儀分析在人類血紅蛋白上3個半胱胺酸位置經穀胱甘肽化的程度。結果顯示此3個修飾位置之修飾程度於食道癌患者與正常人並無統計學意義，而在胃癌患者血紅蛋白上的α-Cys-104和β-Cys-93穀胱甘肽修飾程度是有統計學上意義地高於正常人。然而在探討其修飾程度與年齡和BMI之間的關係時，發現β-Cys-93穀胱甘肽修飾程度與年齡有高度相關性。而BMI則與三個位置上的修飾程度無關。 氧化壓力亦可能造成蛋白質的鹵化、硝化與氧化修飾，我們對食道癌患者以及胃癌患者同時分析以上修飾程度，在18個位置的修飾中，食道癌患者有12個位置上的修飾程度是有統計學意義地高於正常人；另由於分析的胃癌樣品數目並不多，僅四個樣品數，所以目前則無法下結論。 採血紙作為醫療新穎的技術，我們取用兩位正常人的血液將其分為有和無加入抗凝血劑之組別並在室溫下保存在採血紙上28天，同時評估這些修飾的穩定性，結果顯示遑論是否摻入抗凝血劑是不會影響血紅蛋白上的轉譯後修飾。接著使用採血紙保存之第二型糖尿病患者的血液進行修飾程度的分析，由於分析的糖尿病患者樣品數目亦不多，所以目前未有結論。 蛋胺酸(甲硫胺酸, Methionine)的氧化修飾被指出可能源自於樣品的處理過程，為了驗證其可能性，我們使用同位素胜肽進行實驗，在蛋胺酸上確實看到單氧化修飾，但由於其修飾之程度變化量少於真實樣品10倍以上，故其不影響相對定量體內修飾程度的結果。 組蛋白上賴胺酸(Lysine)的乙醯化修飾與否在文獻中指出與癌症相關。此研究希望能在大腸癌病患與正常人間找出具有意義的修飾位置，然而由於阿斯匹靈的普及性可能會影響賴胺酸的乙醯化修飾程度，故不再繼續探討。 而同樣以大腸癌病患與正常人作為探討對象，其血液經過萃取後得到人類血紅蛋白，本研究將其水解後分析蛋白質上甲基化與乙基化。通過定性確定位置後進行相對定量分析，利用統計學軟體計算後，發現大腸癌患者只有在α-1V位置上的乙基化修飾程度才具有統計學上意義（p < 0.05）的高於正常人。 本研究發展出具有高靈敏性以及專一性的質譜方法－奈升流速液相層析奈電噴灑游離串聯質譜法。使用低侵入性手段來取得血液，且從血液中萃取出人類血紅蛋白的時候，所需的血液僅需一滴血(~10 μL)。期許在以上諸多實驗中量測血紅蛋白上的轉譯後修飾，並找出可以作為疾病風險評估的指標候選人。
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1987年日本科學家 Masatake Haruta 首次以金奈米粒子鑲嵌於過渡金屬氧化物上催化一氧化碳氧化反應，證實金的尺寸縮小至 5 奈米等級時具備催化活性。Haruta認為催化反應發生於金奈米粒子與其吸附之過渡金屬氧化物界面上，催化效果以粒徑為 2 至 5 奈米之金奈米球最佳。本研究將介孔洞二氧化矽包覆金奈米棒（AuNRs@SiO2）加入EG中，金棒的直徑在13 ~ 24 nm間發現其具備催化乙二醇（ethylene glycol，EG）氧化成乙醇醛（glycolaldehyde，GA）之能力，使我們進一步探討其催化效率與催化原因。 乙醇醛為製備銀奈米立方體之還原劑，然其結構極不穩定，無法市售取得，可經由EG加熱至150 ℃以上氧化而成。考量 EG 加熱不容易控制，我們檢驗金奈米棒對此反應的催化能力。我們首先選擇尺寸為 70 × 20 nm2 ( 長寬比為 3.5 ) 的金奈米棒，為了防止金奈米棒在反應過程中聚集，利用介孔洞二氧化矽（mesoporous silica）作為保護殼層與反應通道，使小分子可進到殼層中進行反應。檢測產物GA之方法改良自2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine）分光光度法。我們以甲苯取代高毒性之萃取溶劑苯，並在萃取過程中全程冰浴降低顯色產物分解速率，使其檢測結果更加精確。我們發現金奈米棒-介孔洞二氧化矽核殼粒子具備催化 EG 氧化成 GA 之能力，可將反應溫度由 150˚C 降至最低 60˚C 。且初步得出介孔洞二氧化矽包覆金奈米棒做催化劑可重複使用共 4 次，回收次數為 3 次。 我們探討不同尺寸之金奈米棒（長 44 ~ 70 nm、粒徑 14 ~ 23 nm）對催化之影響。經過原子吸收光譜儀決定金奈米棒濃度，對金奈米棒催化能力做濃度正規化之後，發現催化效果與金奈米棒之表面積有正相關。推測此催化反應與金奈米棒之表面吸附有關。最後我們使用 HCl 並通 O2下酸蝕介孔洞二氧化矽殼層包覆之金奈米棒。酸蝕後金奈米棒與二氧化矽殼層會分離。將其加入 EG 反應中，發現在反應溫度100˚C、反應時間 10 分鐘下，卻不具備催化能力。因此我們認為催化反應是發生在金奈米棒與二氧化矽殼層的接觸面上，是金奈米棒與二氧化矽殼層的協同效應而產生催化能力。此外我們利用吸收光譜檢測產物GA的量。取 EG 與在150˚C 下加熱 1 小時的 EG 進行檢測。產物 GA 比反應物 EG 的濃度相對低 300000 倍。
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當環境中同時存在著多種物質時，物質之間由於受到其自身物理或是化學性質的影響（例如：大小、形狀、電荷、反應活性等），導致原本互不具有專一性作用力的物質之間產生了能夠使彼此吸附在一起的作用力，而這樣的現象就被稱為非特異性吸附。非特異性吸附往往是發展生物感測器時所會面臨到的嚴重問題，由於真實樣品的組成成份太過於複雜，造成實驗的分析結果極有可能會受到來自其它非待測目標分析物的影響而導致與真實情況不符的情形發生。然而，這將會影響到生物感測器應用於檢測真實樣品的可行性。因此，如何有效去除或是改善非特異性吸附成為了發展具有高靈敏度和高選擇性的生物感測器所必須要考慮到的問題。 為了改善非特異性吸附的問題，本研究合成出一種兩性離子化合物：Carboxybetaine，簡稱CB。利用CB上的雙硫鍵能夠與金奈米粒子形成穩定的硫金共價鍵，使CB固定於金奈米粒子的表面並形成具有抗非特異性吸附能力的自組裝單層膜（Self-assembled Monolayer, SAM）。本研究將CB應用於檢測老鼠的免疫球蛋白G（Mouse IgG），選用牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）以及溶菌酶（Lysozyme）作為測試產生非特異性吸附的蛋白質，並利用由本實驗室自行開發的光纖式粒子電漿共振儀（Fiber-Optic Particle Plasmon Resonance Biosensor, FOPPR Biosensor）進行即時偵測，發現到修飾在金奈米粒子表面的CB能夠改善抗非特異性吸附的能力。此外，當使用由CB和2-Mercaptoethanol（MCE）所組成的混合式自組裝單層膜，濃度範圍為10-6至10-5 g/mL，CB/MCE SAMs能夠展現出可以被忽略掉的非特異性吸附訊號。當將有修飾上Anti-mouse IgG的CB/MCE SAMs進行Mouse IgG的檢測時，可以得到偵測極限（LOD）為1.46×10-7 g/mL。最後，本研究所開發的CB具有兩項優點：CB可以有效防止非特異性吸附以及具有能夠直接再修飾上生物分子的能力。
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在本研究中，我們的感測平台是藉由波導模態共振(GMR)效應來增強粒子電漿共振(PPR)的效應，結合了這兩種效應的原理開發出一款新型的生物感測器。感測晶片的構造是使用波導模態共振光柵晶片並在光柵波導層表面分別修飾上球形以及棒形金奈米粒子。在本研究中，我們藉由改變外在環境的折射率，探討不同的入射角度下，GMR的效應結合PPR的效應會對整體的感測靈敏度帶來什麼樣的趨勢與變化，並將平台最佳化的感測條件建立起來。經由實驗測試，GMR的效應結合球形金奈米粒子的PPR效應，利用532 nm雷射的即時偵測系統進行環境折射率變化的感測靈敏度測試，當入射角為20度，GMR共振模態在536 nm時，靈敏度可達3.0 RIU-1左右。與純粹只有球形金奈米粒子的PPR相比時大約增強了6倍左右。另一方面，GMR的效應結合棒形金奈米粒子的PPR效應，利用785 nm雷射的即時偵測系統進行環境折射率變化的感測靈敏度測試，當入射角為8.5度，GMR共振模態在779 nm時，靈敏度可達21.1 RIU-1左右。與純粹只有棒形金奈米粒子的PPR相比時大約增強了40倍左右。 在生化感測方面，當入射角為20度，GMR共振模態在536 nm時，GMR結合球形金奈米粒子的粒子電漿共振效應，在Anti-DNP的檢測上偵測極限(LOD)為7.75×10-9 g/mL (5.17×10-11 M)。與純粹只有球形金奈米粒子時的LOD，1.36×10-7 g/mL (9.07×10-9 M)，增強了約18倍。再與只有GMR效應的光柵晶片相比時，其LOD為7.81×10-8 g/mL (5.27×10-10 M)，增強了10.2倍。同時，初步實驗也証實了金棒結合GMR是具有生化感測能力的。
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人類生活環境中充滿了許多對人體具有危害性的反應物質。這些化學物質進入人體中會與DNA反應造成DNA的損傷，進而產生DNA加成產物，甚至演變癌症。我們發展出穩定同位素稀釋法搭配奈升流速液相層析奈電噴灑游離串聯質譜法分析這五種DNA加成產物。目前已測量了9個抽菸的食道癌患者尿液樣品以及7個抽菸的正常人尿液樣品，人類尿液樣品中每個所測得的DNA加成產物含量，經由Mann Whitney U-test統計計算後，發現在抽菸者中cotinine以及7-EtG的含量相較於食道癌病患都有明顯的增加。希望藉此分析方法比較出εCyt、εAde、8-OH-dG、 3-EtA及7-EtG與癌症的相關性，以此做為癌症風險評估的指標。 文獻指出乙二醛和甲基乙二醛在糖尿病患者體內容度高於正常人，且他們又是誘導性突變物質，會與生物分子反應。其中，乙二醛會與DNA反應造成DNA交聯產物，如dG-gx-dA和dG-gx-dC。在此研究，我們利用奈升流速效能液相層析奈電噴灑串聯式質譜法 (nanoLC-NSI/MS/MS)，分析15個糖尿病患者與15個正常人血液中交聯產物含量，發現糖尿病患者體內dG-gx-dA或dG-gx-dC的含量相較於正常人都有明顯的增加。 乙二醛與甲基乙二醛是具有反應性的α-雙羧基醛，會與蛋白質發生反應，造成蛋白質胺基酸殘基的修飾。DBS收集血液的方式與傳統的靜脈注射相比，多了許多的優點，為了確保使用DBS保存糖尿病患者與正常人血液時，血液中乙二醛與甲基乙二醛轉譯後修飾的穩定度，我們將DBS保存在室溫與冰箱(4℃)中，且每隔一周分析樣品中修飾的含量，進而得到DBS保存的最佳條件。結果顯示，在室溫下以及4度C下時，這些轉譯後修飾分別在14天以及21天內是穩定的。