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微流體晶片精子泳動力分級及篩選研究

人工協助生殖科技 (Assisted Reproductive Technology, ART) 如體外受精技術 (In Vitro Fertilization, IVF) 以及單一精蟲顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 強調了高品質精子細胞篩選的重要性，精子活性分類為相關的技術提供不同活性的精子，此外，精子品質的檢測通常以精子的濃度，活性，形狀做為判斷男性不孕症的指標，使用統一的檢測方式來判斷男性的不孕症也是一個重要的議題。本研究藉由微流體生物晶片來進行活性精子特殊移動方式的觀察與分析，並提出可能之假設，有別於其他細胞，精子本身具有泳動能力，佐以實驗證實活性精子頭部會朝著流場的反方向進行定位而朝上游逆游前進。藉著此一特殊的現象以及有理論根據的流道設計，本生物晶片可以從未經處理的精液樣本中將高泳動性之精子從包括白血球、脂肪、無泳動力之精子…等其他雜質中篩選出來，更進一步的，依照精子本身泳動力強弱的不同，本晶片可以同時達到分級篩檢儲存和揀選最高泳動力精子之目的，此一簡單、不昂貴的微小晶片可以把活性精子的觀察、篩選、分級儲存這三項目標整合在一起，快速且持續的同時進行，並且不需要任何外接的電路或是其他類似幫浦的大型儀器。 靜水壓為本研究之穩定驅動壓力源，僅包含三個可以盛裝溶液之容器分別是未經處理精液之入口，緩衝液之入口，以及收集處之出口，而精液入口流道的流速精準的控制成三組不同的流速(最大流速為10μm/s, 30μm/s, and 50μm/s)，由於每個精子細胞的活性皆不同抵抗背景流速的能力亦不同，精子將被分級。由此機制篩選後的活性精子比率接近百分之百，並且實驗結果證明不同活性的精子明顯的被區分出來，並且可以依其活性的不同而進行儲存。 規格統一的生物晶片使精子泳動力分級的機制更有一致性，由不同樣本所得到之精子泳動力分布資料更可以進一步的運用於臨床的診斷不孕症狀況或甚至身體狀況，這可以減少人為判斷病人狀況的錯誤率以及節省人力資源的浪費。這個微小、可隨身攜帶、用完即丟的晶片可以協助達成分級制度之精子銀行、單一精蟲微影注射(ICSI)、體外受精技術(IVF)、或其他相關的人工生殖技術(ART)之議題，滿足臨床上的需求並提供一個一致性的精子泳動力分級平台。

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旅波式介電泳的數值模擬

本文以數值方法研究一項用以驅動具導電性二項懸浮液旅波式介電泳幫浦，在此我們以血作為二項懸浮流的例子來做探討。針對前人的計算程式，本文進行了三項修改。(1)將源項計算從平面微粒顆數改成空間微粒顆數，使計算樣本變多，使微粒濃度、流速、(血液)導電度等空間結果圖變得更平滑，數值變異較小，減少數值上的誤差。(2)微粒(血球)周遭流體的黏滯係數改為隨微粒空間濃度變化的參數，修改後流速減弱，整體阻力變大。(3)將定值的材料參數 CM 因子改為隨當地微粒濃度變化的參數。經此修改之後流速比修正前變快。上述三項修改將使數值模擬更接近實況。 在本文中也利用最終改良上述三項程式結果，來模擬進行實驗比對。在平均濃度18%，流道長1300μm(290μm+720μm+290μm)，流道高60μm，工 作頻 率10MHz，電壓 5V(peak to peak)下，最後模擬結果平均流速為 28.15μm/s，實驗為 18μm/s， 比較上有 35%誤差。 針對於濃度與頻率及流道幾何進行參數分析，在10MHz情況下，微粒濃度20%時較15%時有更好的輸送效能。而同樣濃度，10MHz 和 5MHz 比較，10MHz 的平均流速較快。而前後流道加長，電極區不變下流速則減緩。

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理想量子氣體自由分子流噴流問題之解析解

本文內容探討數個量子氣體自由分子流問題，主要為流體從熱平衡的容器中擴張到真空當中；從物理空間與速度空間的關係中，以統計力學的觀點對粒子的分佈函數做積分後，得到數密度(number density)與分子平均速度在流場的分佈。粒子的分佈函數使用了三種不同的分佈函數：費米-迪拉克(Fermi-Dirac)、玻色-愛因思坦(Bose-Einstein)、馬克士威爾-波茲曼(Maxwell-Boltzmann)分佈函數，分別代表了三種表現不同的粒子：費米子(Fermions)、玻色子(Bosons)幾及古典粒子；前兩種量子分佈函數在得到的解析解中表現出了量子效應，產生與古典粒子完全不同之行為；透過改變分佈函數中的逸度(fugacity)，我們觀察到不同程度的量子效應，而在系統趨近於古典極限，也就是逸度遠小於1時，兩種量子統計將會回復到古典統計，解析的結果顯示古典粒子的表現介於兩種量子粒子之間。 在數值模擬方面採用直接模擬蒙地卡羅法(direct simulation Monte Carlo)模擬稀薄氣體的流場，將粒子間假設為沒有碰撞，試著驗證自由分子流解析解的正確性，可以看出兩者的結果非常相近。

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以正篩選偵測稀少細胞之碟片微流系統

在臨床研究中，血液中的特定稀少細胞可以當作醫生診斷治療病人的參考資料，例如：病情診斷、治療過程的監視、評估治療效果。而稀少細胞在血液中的濃度大約為十億分之一(ppb)，因此如何快速且廉價的分離和偵測血液中稀少細胞為醫學上很重要的挑戰。 本研究提供一個具有微流體結構的碟片設計，利用免疫磁力分離法和離心力來完成稀少細胞分離，並透過螢光顯微鏡來辨識細胞。但由於病人的血液取得不易，前期研究使用細胞株進行實驗，以人類乳腺癌細胞株(MCF7)模擬血液中之稀少癌細胞，及淋巴球癌細胞細胞株(Jurkat Clone E6-1,簡稱：Jurkat)模擬血液中之白血球(表示血液中的大量的細胞)。MCF7與Anti-CD326-PE 和 Anti-PE BD magnetic beads 進行結合，使其能被磁鐵所抓取，並發出紅色螢光。Calcein-AM則用來標定Jurkat，使其發出綠色螢光。 將少量MCF7和大量Jurkat混合成300μl的細胞混合液，並注入微流體碟片中。接著放上多環磁鐵，靜置兩分鐘。經過旋轉碟片，MCF7被磁力留在內圈，Jurkat 和溶液被離心力排除到碟片外圓。最後利用螢光顯微鏡直接計算碟片上被分離的MCF數量。 實驗結果顯示，在跨越三個不同數量級的Jurkat (106、107、108)中，各加入少量的MCF7 (10+、100+、300+) 混合，均有 80%的MCF7可以在微流體碟片中穩定地被檢測到。證明此微流體碟片具有穩定的分離效果和良好的靈敏度。整個實驗過程包括細胞分離和細胞偵測，所需要的時間大約是30分鐘。細胞分離過程較簡單、低成本，而細胞損失仍然在可接受的範圍內。所以這個微流碟片將可以用來偵測目前有明顯特定免疫性質的細胞。例如：偵測癌症病人血液中的癌細胞(簡稱：CTCs)、母親血液中的胎兒細胞等。多了這些診斷資料，醫生可以為病人量身訂做適合的治療方法，並減少檢查過程中的風險。

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整合細胞內外微流交換及光學檢測於平面式片膜鉗制晶片之電生理量測系統

離子通道在人體中扮演重要的生理訊號傳遞的角色。傳統操作玻璃針尖的片膜鉗制技術(patch-clamp technique)為目前最為可靠用來了解離子通道的經典技術，能從細胞膜上獲得豐富的電生理資訊。但長久的訓練與複雜的操作過程使此技術進入門檻高且效能低。因此近年來許多平面式片膜鉗制晶片的研發，希望能夠減少傳統研究之入門門檻。本研究之前身，為團隊於2007年之發現：當二氧化碳雷射聚焦於150微米的蓋玻片上時，因玻璃回融之現象，而產生出1~30微米尺度的獨特沙漏構型微孔洞，可利用替代傳統玻璃針管，進行離子通道之量測。 本篇論文之主軸藉由調控雷射的頻率、時間、個數，將先前發現的孔洞做定性定量的分析，並搭配特殊二階段雷射製程方法，使孔洞能穩定縮小至1-3微米成為適合電生理量測之平面孔洞晶片，並進一步將晶片整合微流體交換與光學檢測之功能。結果顯示，在不同頻率、時間、個數之雷射製成下，孔洞形式會有四種迥異之結果，而其中能獲得較平滑的第一階段孔洞。配合二階段雷射方法，穩定的改變與縮小孔洞的最終尺寸，使1-3微米孔洞製程良率大幅提升。數種細胞株whole-cell的電流，皆可於此平台上確實量測。細胞內溶液也藉由交換perforated patch量得Jurkat 之whole-cell電流。HEK 293T之細胞外溶液從原本正常生理鹽水交換成以鉀離子為主的溶液，whole-cell電流改變也確實量測得到。當細胞外溶液交換成calcein AM溶液時，細胞螢光強度的變化也被確實檢測。我們也成功嘗試同時將九顆同時抓取與觀測。本團隊相信此研究經濟、方便、微流體整合、螢光檢測的特性，是目前首見的。其也具有與市場商品相抗衡的競爭優勢。

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介電泳細胞分離與輸送的研究

本論文利用微機電技術製造旅波式介電泳幫浦及細胞分離晶片。旅波式介電泳幫浦為一截面為矩形的流道，在其中一壁面鋪上如鐵軌般垂直於流道的電極，並施以六組四相位差的交流訊號，此時紅血球將會被傳統式介電泳力抬離電極表面，旅波式介電泳力則會驅動紅血球往相位遞增的方向前進，血漿則會藉由紅血球移動時的黏滯阻力被帶動，而達到傳輸血液的效果；細胞分離晶片亦使用旅波式介電泳力，當細胞於同一位置出發，經過與流道具有特定傾斜角度的電極陣列，會產生不同幅度的偏向，即可分辨出不同的細胞。本文針對這兩部份的研究，完成的工作如下：(1)找出最佳的旅波式介電泳幫浦操作頻率，5MHz時全血平均流速可達50μm/s。(2)比較在首根電極前增加兩根輔助電極於不同情況下是否能提升幫浦的效能，結果主要顯示輔助電極可助縮短幫浦達穩態運輸時的暫態時間，如10MHz時由30分鐘縮短為20分鐘。(3)探討了血液濃度對旅波式介電泳幫浦的影響。(4)測試幾種不同的流道設計，電極區漸縮的流道有較好的表現，幫浦平均流速從原本的11.1μm/s提升至16.5μm/s。(5)本研究設計的細胞分離晶片，可在10MHz、背景流速69.44~148.81μm/s時，將RPMI培養液中的CL1-0、CL1-5和白血球分辨出來；在10MHz、背景流速49.60~128.97μm/s時，將PBS緩衝液中的Jurkat、白血球和紅血球分辨出來。

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電熱力流場混合器的數值模擬與設計

本文探討含特殊造型平面電極的微流道內電解質流體所產生的漩渦流動。採用流力及電熱力的理論，透過COMSOL軟體進行模擬，並加以實驗驗證。最後，利用此漩渦流動的特性設計出各式微流混合器，並分析其混合效能。 實驗裝置是採用標準微機電技術製作，其結構是一矩形截面直微流道，並在流道底壁建置一對具夾角之平面電極，電極通以10伏特的交流電，以驅動流道內的電解液運動，再將所記錄的影像以PIV方法分析，可獲得流場。經與計算結果比較，雖局部定量結果差異頗大，但定性結果相符，而初步確認可採數值模擬研究此微流裝置。 計算結果提供三維微流道內漩渦流場的詳細性質，其中重要結論含：(1)微流道內流體的最大溫度差雖然只有0.32K，但因為具有甚大的溫度梯度而能對流體的運動造成很大的影響。(2)溫度不會隨交流電的頻率變化而有所改變，但是卻會隨著流體導電率的增加而呈線性成長。而流場的速度量值會隨著交流電頻率的增加而變小，但卻隨著流體導電率的增加而變大。(3)電極夾角的角度對微流道內的溫度場與流場的整體趨勢影響不大，只會稍微改變高溫區域和流場漩渦的位置，但是對於速度量值而言，電極夾角的影響很大，夾角為 時有最大的漩渦速度。 混合器方面，本文依照流場的計算結果設計出多種不同的電極陣列，並進行了詳細的計算與分析。在平均背景流速100 及電壓30 下，其中一項交錯電極設計(二行，共六片電極)的混合器之混合效能可達89.6%。

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分佈式布里淵光纖感測系統於裂縫監測之應用

公共工程通常是定期進行安全檢測，但是災害常無預警發生，而造成重大的人員傷亡。因此如何發展出一套監測系統，以有效監測結構物的狀況，並在可能有危害時發出警訊是未來相當重要的課題。 混凝土結構是最常見之工程結構，其瀕臨破壞時，常發生龜裂現象，因此裂縫偵測對混凝土結構之安全監測一直倍受重視。傳統裂縫檢測方式有很多種，大部分都是定點式量測，且需要人員到現場操作，不但耗費人力和時間，也不能即時監控建築的情況。近年發展的分佈式布里淵光纖檢測系統（BOCDA）具有高解析度，以及分佈式量測的特點。本研究之主旨即研究以BOCDA對混凝土裂縫進行監測之可行性。 由於BOCDA系統為多種儀器所組成，因此有時會發生雜訊掩蓋真正訊號，而導致結果判讀錯誤的情況發生。為提高BOCDA系統之可靠度，本研究對此系統加以改良，新增兩個模組：一為在探測波(probe)端加入衰減器調整模組，利用衰減器控制調整探測波的強度，並自動選擇最佳衰減值，使頻譜強度最強且較集中；二為在測試區前端加入極化最佳化模組，將探測波和泵波(pump)的極化狀態調整至一致，使布里淵增益變大，以提高訊雜比。 本研究將改良之BOCDA系統應用於一混凝土梁之三點彎矩試驗，以偵測裂縫開裂情況。由實驗結果發現，本研究所新增之改良模組確實能大幅提升量測結果的準確性，而且即使由肉眼無法觀測到的裂縫，布里淵頻譜已開始產生變化，由變化的位置和變化量即可推估裂縫產生位置及寬度，利用不同高度鋪設光纖也可知道裂縫增長的情況。由於裂縫的產生無法預期，本研究可提供即時監測，改善傳統量測的困境。並藉由長時間對結構體的量測，可以有效掌握結構體受損的情況。

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片段環感測器之模態敏感度的空間訊號分佈及片段環 致動器的控制效應

對於薄殼類型之結構的分佈控制，必須要有效的致動和動態 分析。本研究是估算片段分佈的電-機械性質的壓電薄殼感測器 應用在環薄殼。由於感測器的訊號是模態決定，所以必須先學習 自然模態的特性而且特別強調於環向之模態。其次，在分佈片段 的感測器使用分割的技巧且設計不同的長度，使得藉著模態形變 而估算訊號。 因此，全部的輸出訊號總共包含了四個部份：1)環向之振動 的振幅所造成彎曲應變而感生訊號，2)徑向之振動的振幅所造成 彎曲應變而感生訊號，3)環向之振動的振幅所造成膜應變而感生 訊號，4)徑向之振動的振幅所造成膜應變而感生訊號。膜應變與 彎曲應變主要分別由環向與徑向之自然頻率伴隨而生。所以感測 器的敏感度可以在分成：1)徑向型態敏感度與2)環向型態敏感 度。 使用參數學習(例如：環的半徑、感測器的厚度、環的厚度 和片段感測器的大小)而引導計算出在自然振動之下，所產生在 環的壓電片感測器所得之訊號。所有的資料指示著，產生的總訊 號主要是由環向分量貢獻為較多，而不是徑向分量。 其次，在環薄殼上包覆致動層，藉著推導致動片之控制效 應，瞭解在徑向模式時，彎曲控制效應支配整個控制效應，反之 在環向模式時，膜控制效應會是主要控制效應的主幹。 最後，使用參數學習（例如：環的半徑、致動器的厚度、環 的厚度和片段致動器的大小與施加電壓大小）而瞭解這些幾何參 數影響控制效應之大小。

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使用半古典格子波茲曼法之微流道流場模擬

在近十年間，格子Boltzmann法(Lattice Boltzmann Method, LBM)已發展成為相當重要的一項研究流體流動的工具。在本文的研究中，我們使用格子Boltzmann法來計算模擬流體在二維微流道管中，在不同的Knudsen數，包含了滑移區跟過渡流區，並使用新發展的半古典格子Boltzmann法，來模擬量子氣體。 半古典格子Boltzmann法是利用Uehling-Uhlenbeck Boltzmann-BGK方程式，藉由Hermite多項式展開推導而得到的。根據邊界上的滑移運動，採用了一個調和係數(accommodation coefficient)來模擬氣體在邊界上的交互作用。 不同的Knudsen數，包含了滑移區跟過渡流區中，模擬了三種不同的粒子統計，計算而得到質量流率跟速度分佈曲線，最後順利發現Knudsen minimum現象的存在。由發現Knudsen minimum現象的展現可做為演算法驗證的方式，並和本研究使用量子統計得出結果做為比較。