臺灣大學生物化學暨分子生物學研究所學位論文
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
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C型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）屬於黃熱病毒科（Flaviviridae）正向單股RNA病毒。基因體約9.6 kb，能夠產生結構蛋白質core、E1、E2 、p7以及非結構蛋白質NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。由於C型肝炎病毒RNA複製時的突變率很高，使C型肝炎病毒能逃過宿主的攻擊。C型肝炎病毒主要是經由血液或體液感染，感染後約有80％的病患換轉變成慢性肝炎，其中約有10-20％病患會產生肝硬化，也有約1-5％的病患會轉變為肝癌。全球約有超過1.7億的人口感染C型肝炎病毒，已成為了一個必須積極去面對與解決的全球性健康問題。 本實驗室希望能夠建立一個利用Huh7細胞產生C型肝炎病毒的穩定表現系統。本研究首先將質體pJFH1進行改造，在C型肝炎病毒基因後端再接上D型肝炎病毒的ribozyme和poly A signal，完成質體pJFH1-RZ-PA的建構。將質體pJFH1-RZ-PA轉染到Huh7細胞中，兩天後萃取細胞內的RNA進行RT-PCR，結果能夠偵測到反股的C型肝炎病毒RNA，也能偵測到核心蛋白質的表現，顯示藉由轉染送入的質體所產生的C型肝炎病毒正股RNA能夠自行複製，產生反股RNA。再將質體的T7驅動子置換成CMV 驅動子，完成質體pCMV-JFH1-RZ-PA之建構，再用質體pCMV-JFH1-RZ-PA轉染Huh7細胞，在G418存在下，挑選出能夠穩定表現HCV RNA的Huh7細胞株Huh7-CMV9。 由先前的論文指出，hnRNP（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein） family的成員會和C型肝炎病毒RNA結合，幫助C型肝炎病毒的複製。我們利用shRNA技術以及穩定表現HCV RNA的Huh7細胞株Huh7-CMV9，研究hnRNP哪一些成員參與C型肝炎病毒的複製。結果發現 hnRNP P2/ FUS若被knockdown，會使細胞中的HCV反股RNA量減少，顯示hnRNP P2可能參與C型肝炎病毒的複製。 為了尋找抗C型肝炎病毒藥物，利用Huh7-CMV9複製系統以測試藥物對進行C型肝炎病毒於細胞中所累積的反股RNA量的影響。結果顯示從48種藥物之中有10種藥物可抑制C型肝炎病毒於細胞中所累積的反股RNA量一半以上。進一步實驗結果測得藥物D46的IC50濃度為3.43μM。hnRNP P2/ FUS和藥物D46如何調節C型肝炎病毒RNA複製之詳細作用機轉，須再進一步研究。
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嚴重急性呼吸道症候群 （severe acute respiratory syndrome, SARS) 在 2002 年末至 2003 年之間襲捲了數十個國家，致死率約 9.6%，嚴重急性呼吸道症候群相關之冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV）被證實與 SARS 引起之非典型肺炎有關。SARS-CoV 為一含有套膜之冠狀病毒，其基因體為一單股正向的RNA，長約 30,000 個核苷酸，具有 14 個 ORFs，主要包括四個結構性蛋白質，membrane (M)、 envelope (E)、 spike (S) 和 nucleocapsid (N) 以組成病毒顆粒，其中 spike 為一鑲嵌在膜上的蛋白質，具有和宿主細胞受體結合的功能，進而產生細胞融合的現象。本研究著重於 SARS-CoV 感染宿主時，除了目前所知的受體蛋白質ACE2 (angiotensin-converting enzyme2)、DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-3-grabbing nonintegrin) 和 L-SIGN (liver/lymph node-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin; also called CD209L or DC-SIGNR) 以外，是否還有其他宿主細胞表面因子參與其中。 先前對於SARS-CoV的受體蛋白質研究，許多僅表現spike蛋白質來做實驗，而本實驗室利用較能模擬實際生理狀況的類病毒顆粒(virus-like particles, VLPs) 來作為主要實驗材料。分別含有SARS-CoV三種主要結構蛋白質E、M和S的重組桿狀病毒共同感染昆蟲細胞Sf9，此時細胞同時表現三種結構蛋白質並組裝成SARS-VLPs而釋出細胞到培養液中，從培養液中分離以及蔗糖梯度離心 (sucrose gradient centrifugation) 純化之後，利用穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy) 確認形成正確的病毒顆粒構形，利用此SARS-VLPs與具有SARS-CoV受體ACE2之細胞株共同培養，在十分鐘觀察到spike會和ACE2結合形成複合體，並且經由免疫沉澱以及質譜儀分析，得知有三個細胞蛋白質可能和病毒感染過程相關，其中包含二個細胞骨架蛋白質actin和vimentin，以及一個鈣離子依存性磷脂質結合蛋白質annexin A2。進一步的實驗發現 vimentin 蛋白質在和 SARS-VLPs 反應十分鐘，可以被 anti-ACE2抗體免疫沉澱，由共軛焦顯微鏡也觀察到 spike 及 vimentin 在細胞膜上有共位現象，證實 vimentin可能參與在SARS-CoV感染細胞時形成的 spike-ACE2 複合體當中。未來工作將會釐清vimentin在病毒感染過程中實際上扮演的角色，以及其調控機制。
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幽門螺旋桿菌被證實會造成胃部之慢性發炎並且與許多胃部之疾病(例如胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍與胃癌)有很大之關聯，至目前為止雖然有很多致病因子被研究出來，但是幽門螺旋桿菌的致病機制至今還尚未完全釐清。 在實驗室先前的研究中，發現了幽門螺旋桿菌新的致病因子GroES，而且GroES對胃癌病人血清有很高的抗原性，同時也會使得周邊血液單核球細胞釋放前發炎細胞激素，並對胃上皮細胞產生免疫反應及細胞增生之現象，而此造成之現象可能與胃癌的形成有關。GroES是一個熱休克蛋白，並且在細胞中與GroEL形成一個co-chaperone。經由文獻搜尋後得知，Escherichia coli或是其他微生物之 GroES並不會造成細胞之免疫反應，而幽門螺旋桿菌之GroES所造成細胞之免疫反應是否與其蛋白質序列有關，因此，我們分析了不同物種之GroES的蛋白質序列，發現幽門螺旋桿菌之GroES在羧基端有28個胺基酸片段延伸，而這片段是在其他物種中從未發現。 因此，我們想進一步了解此胺基酸片端是否會造成細胞產生免疫反應，所以我們將全長GroES中的後28個胺基酸片段刪除 (deletion)，並藉由分析周邊血液單核球細胞以及胃上皮細胞所釋放之IL-8，發現這樣的刪除會使得原本GroES的喪失誘導細胞釋放IL-8之能力，並且使得GroES無法與胃上皮細胞表面進行結合。再進一步的分析後，我們發現這一段28個胺基酸之片段，會引發周邊血液單核球細胞之IL-8的釋放，似乎這一段胺基酸片段是GroES活性的重要來源，並進一步造成宿主細胞之免疫反應。
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腎細胞癌（Renal cell carcinoma）占成人所有癌症的百分之二，其中又以透明細胞（clear cell）腎細胞癌為最主要及最具侵略性之亞型。由於腎細胞癌對於傳統的化學治療或是輻射線治療等方式具有高度的抗性，所以手術切除仍是目前主要的治療方式；此外，當病人腎細胞癌有轉移現象出現後，五年內存活率將低於百分之二十，且臨床上至今也尚未發展出可作為預測診斷或治療癒後的分子指標。因此，我們希望藉由鑑定與腎細胞癌形成相關之基因來了解其致癌之分子機制並期望發展出新的診斷及治療方法。在先前的研究中，本實驗室已成功建構透明細胞腎細胞癌組織以及正常腎臟組織之全長互補去氧核醣核酸（cDNA）基因庫，藉由分析兩基因庫之基因表現，共比對出201個過度表現與182個表現受抑制之相關基因，而菸鹼胺-氮-甲基轉移
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脂肪肝，肝細胞含脂肪重量達5%以上時稱之。近年來國內成年人口脂肪肝盛行率高達26-34%。脂肪肝可分為酒精性及非酒精性，酒精性脂肪肝起因於飲酒過量，非酒精性脂肪肝則多與肥胖、糖尿病及代謝疾病等相關。近來研究顯示，有相當比例非酒精性脂肪肝會發展為肝纖維化、肝硬化甚至是肝癌。然而目前臨床上尚無令人滿意的藥物，這使得治療非酒精性脂肪肝之藥物開發有相當的空間。 本實驗室與順天堂藥廠合作，將中醫書上記載具有保肝功能之中草藥篩選可降低細胞三酸甘油酯的中草藥，我們篩選出其中兩種複方—黃連解毒湯及柴胡舒肝湯，並探討其用於治療非酒精性脂肪肝之可能性。 首先我們證實在LXR agonist—T0901317存在與否，此兩複方皆可降低HepG2細胞中三酸甘油酯含量，而以RT-PCR及real-time RT-PCR偵測HepG2中脂質代謝相關基因的mRNA後，我們發現此兩複方皆會降低SREBP-1c、FAS及ACC之mRNA表現量，因此推論它們皆藉由抑制SREBP-1c進而影響FAS及ACC的轉錄。之後我們更以Western-blot發現此兩複方皆降低細胞中FAS蛋白質含量，顯示其具有抑制脂肪酸合成的功效。 接下來我們以十週大的C57BL/6小鼠進行動物實驗，將之分為五組，分別為T0901317、T0901317 +柴胡舒肝湯、lipogenic diet (35% cornstarch +35% sucrose)、lipogenic diet+柴胡舒肝湯及control組。飼養3週後，由肝組織切片觀察，T0901317組並無脂肪肝產生，但出現肝臟血管阻塞情況，而柴胡舒肝湯在此動物模式下可舒緩肝臟血管阻塞情況。然而lipogenic diet組肝組織的三酸甘油酯及總膽固醇含量相較於control組明顯上升，伴隨血漿中AST濃度被提升，並由肝組織切片發現以macrovesicular steatosis型式為主的脂肪肝。柴胡疏肝湯在此動物模式下可降低血漿中ALT活性，並發現其可降低肝臟被提升的FAS蛋白質含量，但尚無減輕肝臟脂肪堆積的情況。 之後我們續以ob/ob小鼠為動物模式，將之分為兩組，分別為黃連解毒湯及control組，飼養2週後，control組肝組織三酸甘油酯約為前一次C57BL/6小鼠實驗control組的三倍，而總膽固醇則約為兩倍，血漿中ALT及AST活性也同時較高，肝組織切片則觀察到較嚴重microvesicular steatosis型式的脂肪肝形成 ，且有發炎現象產生。而黃連解毒湯在此動物模式下可明顯降低血漿中三酸甘油酯及AST活性，並減緩肝組織發炎現象，但無減輕肝臟脂肪堆積。 細胞實驗與動物實驗結果不甚一致，在論文中討論可能的原因及如何規劃更適合的動物模式。本篇論文所建立的研究脂肪肝之動物模式，將可成為本實驗室日後在脂肪肝研究上的參考。
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有效率的遞送系統不論是在治療或是研究中皆是一個重要的課題，利用正價物質可藉由電性間的相互吸引將核酸物質包覆形成幾百奈米之複合體進行基因遞送，但藉由正價物質進行活體基因遞送時會遇到許多障礙因而遞送效率較差，且不能穩定存在於活體中。為了提高粒子在活體內的穩定度及維持粒子大小，在先前的研究中利用強親水性的聚合物聚乙二醇(PEG)修飾粒子表面使其能有效提高在血管中的滯留時間及穩定性。 2-胍基-乙基-氨基甲酸(GEC-Chol)為一以膽固醇為基礎之正價脂質，在先前的研究中發現其在與膽固醇混合形成約100 nm之奈米粒子，在細胞試驗中遞送線型DNA具有良好的遞送效率。同樣的在本實驗中利用異硫氰酸螢光素(FITC)標記之短鏈核苷酸用以追蹤短鏈核苷酸，發現在氮磷比為3時遞送短鏈核苷酸可以展現近乎100 %的遞送效率，但是在加入10 % PEG-DOPE時，遞送效率卻幾乎無法觀察到遞送的效率。為解決遞送效率降低的問題，本實驗在核酸物質與正價脂質形成複合體後再外插入PEG-DOPE，期望可以降低粒子大小同時提高穩定性，使其更適合活體遞送。實驗結果證明使用後插入PEG-DOPE方法之粒子具有較小的粒徑、較高的穩定度。同時在流式細胞儀及螢光顯微鏡的分析中皆可以測定到帶有FITC之短鏈核苷酸即使在10 % PEG-DOPE依然不會影響核酸物質的遞送效率。為了在活體中容易觀察，因此在粒子中加入量子點，再經由共軛焦顯微鏡及洋菜膠電泳跑膠分析後，證明加入量子點不影響短鏈核苷酸的包覆。在活體實驗中發現，這樣的粒子在各組織中都有看到分佈的量子點，且這樣的粒子在體內中不會引發發炎反應，具有相當高的生物相容性。 本論文提出之以後混方式形成之粒子在有聚乙二醇存在時具有高度遞送效率，且在活體試驗中未明顯產生免疫反應，且在含有20 % PEG-DOPE之粒子可降低非專一性的遞送，綜合以上結果顯示，以後混方式形成之粒子比短鏈核酸與正價脂質直接混合之粒子更適合作為體內核酸藥物之載體，未來可同時加入藥物或是專一性遞送的導向性分子，使其成為具有專一性活體治療及活體影像之多功能奈米粒子。
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近年來隨著奈米科技以及光電顯微影像技術的蓬勃發展，於是科學家們整合奈米技術與光學影像兩大研究領域，將奈米粒子與顯微影像系統結合應用於生物醫學影像研究中。常見之奈米粒子如量子點，因具有獨特光學特性故常被應用於生物影像學上，作為螢光探針。 由於量子點比起傳統之螢光染劑具有極高的光穩定性，不易因為光源長時間激發而有光褪色的現象產生。因此，將量子點與超靈敏性光學技術結合不僅可提供較佳之訊雜比外同時更允許長時間觀察。藉由兩者結合之優勢，我們可以利用光學之方式去探討研究活細胞上之單一分子的動態變化、追蹤單一分子之移動軌跡或是分子間之交互作用，確切了解特定單一分子於時間以及空間上之變化，更進一步去了解細胞分子層次的改變。 因此本研究即是透過凝集素：刀豆凝集素與小麥凝集素；以及抗細胞黏附因子抗體：anti-integrin αv與anti-integrin β1分別辨識老鼠神經纖維瘤細胞Neuro2A與人類神經纖維瘤細胞SH-SY5Y上之特定分子，進一步追蹤表面特定分子之動態變化。於實驗中，我們利用中性脂質( DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG/DOPE-biotin )包覆量子點，不僅可以降低量子點本身對於細胞之毒性同時因為DSPE-PEG之存在可以減少量子點非專一性的黏附於細胞膜上。由於量子點本身具有螢光訊號，而經過脂質修飾後之量子點因為界面差異故於三倍頻顯微影像系統之下亦具有強烈訊號存在。因此，在本研究中，我們透過螢光顯微鏡以及三倍頻顯微影像系統可以觀察到活細胞上被標定之特定分子的動態變化以及移動軌跡。 未來，脂質包覆量子點結合光學影像系統於活細胞影像之應用，可深入探討單一受體與藥物間之反應或分子與分子間之交互作用，並紀錄其動態變化。
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1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase (AGPAT)又稱為 lysophosphatidic acid acyltransferase (LPAAT)，是催化脂肪酸由acyl-CoA (通常為不飽和脂肪酸) 鍵結到1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate的sn-2上產生phosphatidic acid (PA)的酵素。因此AGPAT在整個磷脂質及三酸甘油酯的生合成過程扮演其相當程度的角色。根據其酵素活性與序列的相似性得知大約有9種亞型 (isoforms)，這些AGPAT都具有2到4個細胞嵌合區(transmembrane domains)和acyltransferases中高度保留的催化活性區(catalytic motif, NHX4D)以及受質結合區(substrate binding motif, EGTR)。Docosahexanoic acid (DHA, 22:6n-3)，為一長鏈n-3不飽和脂肪酸，在腦及視網膜的磷脂質sn-2位置上含量比起身體其他組織高出許多。相關的研究也指出DHA能維持神經細胞的正常功能，但是我們仍然不知道為何DHA選擇性結合到這些組織磷脂質的sn-2位置上。以酵素作用看來，AGPAT在sn-2脂肪酸的酯化扮演重要角色，九種AGPAT isoforms在不同組織表現量有很大的差別，因此認為各種isoform可能具有受質特異性，對特定的脂肪酸或是LPA進行sn-2的acylation。在腦部AGPAT mRNA表現量最高是AGPAT4，因此我們推測AGPAT4可能與DHA在大腦的累積有關。 利用RT-qPCR的方式測得隨著年齡增長(胚胎、七天大、一個月大及十個月大)，大鼠大腦中AGPAT4的mRNA表現量跟著降低，利用氣相層析分析法(Gas chromatography, GC) 發現其DHA的含量也相對跟著降低；另外，在DHA缺乏的大鼠腦部AGPAT4的表現，相較於控制組的表現量來的高。為了探討AGPAT4的功能，我們建立了含有大鼠AGPAT4 cDNA的表現質體並轉染到SH-SY5Y細胞，Western blot 及螢光免疫染色法可以看出AGPAT4的表現及其在細胞中之分佈。在轉染AGPAT4的細胞給予50μM的各種脂肪酸24小時，當給予DHA及α-linolenic acid (ALA, 18:3n-3)時，細胞中DHA及ALA相較於控制組分別高出3.0%及2.8%；但是當給予eicosapentaenoic acid (EPA)、 arachidonic acid (AA)、palmitoleic acid (PA, 16:1)和 miristic acid (MA, 14:0)細胞中AA、EPA、PA及MA含量則沒有明顯的改變。當分別給予10μM 及50μM DHA，轉染AGPAT4 cDNA 的細胞比只轉染載體的細胞多了1% 及 3%。用retinoic acid (RA) 及mitotic inhibitors分化SH-SY5Y成神經細胞， AGPAT4 mRNA表現量會隨著分化而增加，DHA的累積也有增加的趨勢，最高達1.76倍 (由2.7%提到至4.7%)。為了更進一步證明AGPAT4對於DHA在細胞膜累積的重要性，我們利用RNAi 干擾技術減少AGPAT4的表現，當給予50μM DHA時，累積在磷脂質的DHA比起對照組低了4-8%的含量。本實驗的結果顯示，AGPAT4在神經發育及DHA在神經細胞的累積扮演重要角色。
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奈米粒子因體積小且具有特殊物理特性而被廣泛應用於生醫研究。其中超順磁氧化鐵奈米粒子 (USPIO) 因具有強烈的順磁性，可作為核磁共振造影的顯影劑。配合磁場之使用，進一步的能夠應用在收集特定細胞和轉染研究上。除此之外， USPIO 還可以應用在癌症組織中作為非侵入性的偵測或幹細胞追蹤。但是，要能在活體中追蹤細胞，其細胞內的訊號必須夠強。因此如何讓能大量的氧化鐵奈米粒子有效率地進入細胞而又不會造成傷害，一直是科學家研究致力的目標。 在先前的研究中，已經有很多方法像是化學或是蛋白的修飾於氧化鐵奈米粒子的表面，使細胞容易吸收。然而這樣的方式通常是直接以共價鍵連接在粒子表面，步驟較複雜，所需時間也較長。為了能簡單的修飾氧化鐵奈米粒子表面，本研究以微胞體包覆氧化鐵奈米粒子。這樣的修飾方法簡單，而且只要在一個小時內即可完成。另一方面，為了有效率地將氧化鐵奈米粒子送入細胞內，吾人連接實驗室已經建立的一種穿透性胜
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肝癌是正常肝細胞變異所產生的惡性腫瘤，同時是國人因癌症致死的主因之一。在大部分亞洲國家中，肝癌也是常見致死的病症。在西方國家中，攝護腺癌是好發於男性的惡性腫瘤。近幾年來，由於生活方式與習慣趨於西化，在許多亞洲國家中，攝護腺癌的罹患率也有逐漸攀升的趨勢。 第二型穿膜絲胺酸蛋白酶 2（TMPRSS2）屬於第二型絲胺酸蛋白酶（TTSP）的一員。早期的文獻中指出第二型絲胺酸蛋白酶 2 大量表現於攝護腺癌病人身上，但其表現在不受賀爾蒙調控之實驗動物攝護腺癌細胞中，則有明顯下降的趨勢。 為了進一步研究第二型絲胺酸蛋白酶2在肝癌以及攝護腺癌中所扮演的角色，我們分析統計臨床上第二型絲胺酸蛋白酶 2在肝癌病人組織切片中的表現量。結果顯示，約有六成的肝癌患者，有下降的第二型絲胺酸蛋白酶 2的表現。相較於第一、二期的肝癌患者，在第三、四期的患者，此蛋白酶表現量更是大幅地降低。在癒後方面，我們發現第二型絲胺酸蛋白酶2表現量愈高的患者，其存活率也有愈高的趨勢。在肝癌細胞株及攝護腺癌細胞株中，較惡化的癌細胞株（如SK-Hep1以及DU-145細胞）表現其第二型絲胺酸蛋白酶2的量，較早期腫瘤形成能力低的癌細胞（HUH7以及LNCaP C-33細胞）少，其下降程度非常顯著。藉由大量表現外源性第二型絲胺酸蛋白酶2在肝癌細胞株（HUH7）中，結果發現癌細胞生長速度趨緩及其移動能力減弱的現象。 在非賀爾蒙依賴型攝護線癌細胞株（DU-145）中，外源性的第二型絲胺酸蛋白酶2 可降低癌細胞的移動及侵襲能力。若將癌細胞株(LNCaP C-33)中的第二型絲胺酸蛋白酶表現量壓低，發現癌細胞生長明顯加快。我們推測是由於癌細胞中的第二型絲胺酸蛋白酶表現量下降，造成某些抑癌基因，如P53，的表現量下降，進而導致癌細胞生長加速。 在共軛焦螢光顯微鏡的分析中，可以發現癌細胞因第二型絲胺酸蛋白酶2的表現量下降，促成細胞形態明顯地變圓；同時觀察到，原本位於細胞膜周邊的beta-catenin蛋白，在膜上的量也有降低的現象。因此，綜合以上實驗結果，在肝癌和攝護腺癌中，第二型絲胺酸蛋白酶2扮演一個負向調控者的角色，以抑制癌細胞生長、移動以及侵襲能力。