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人類去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶對細胞生長及Methotrexate抗藥性影響之探討

去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）負責催化去氧尿苷三磷酸（dUTP）水解為去氧尿苷單磷酸（dUMP）和焦磷酸鹽（PPi）。有許多證據顯示去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）的表現量和腫瘤形成以及化療抗藥性有關連。本篇研究的目的在於了解去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）在細胞週期進行時的調控及其所扮演的必要角色。 在本篇研究中發現去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）的表現量隨著細胞週期改變，在S phase時大量表現。在293T細胞中抑制去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）的表現，會稍微減緩細胞生長速度。利用aphidicolin進行同步化(synchronization)後，進一步發現抑制去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）表現不但會影響細胞週期的進行，在細胞週期經過S phase時還會有去氧核糖核酸（DNA）損傷的訊號產生，並引發細胞凋亡（apoptosis），顯示去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）對複製壓力(replication stress)反應的重要性。 胸苷酸（dTMP）代謝一直是癌症化療應用的重要作用點。像是5-氟尿嘧啶（5-FU）或葉酸拮抗劑（antifolate）。抑制胸苷三磷酸新生成(de novo dTTP synthesis)的途徑會降低細胞內胸苷三磷酸（dTTP）含量，並導致去氧尿苷單磷酸（dUMP）累積，進一步磷酸化為去氧尿苷三磷酸（dUTP）。dUTP/dTTP比例的增加會導致去氧尿苷三磷酸（dUTP）誤嵌入DNA，引發DNA損傷反應。因此提出去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）的表現量是否會影響細胞對滅殺除癌錠(methotrexate)的感受性。結果顯示在293T細胞中降低去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）的表現量會增加細胞對滅殺除癌錠(methotrexate)的敏感度，並且增強DNA損傷反應。另一方面，表現去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）則可減少因滅殺除癌錠(methotrexate)所引起的損傷訊號。 總結本論文，說明了去氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase）在細胞從複製壓力(replication stress)復原時的重要性，以及在利用抑制胸苷三磷酸新生成(de novo dTTP synthesis)途徑化療藥物治療產生抗藥性所扮演的角色。

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α-次亞麻油酸和二十碳五烯酸抑制人類神經瘤細胞株SH-SY5Y之acyl CoA oxidase基因表現

長鏈多元不飽和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids, PUFAs)包含AA(arachidonic acid)、EPA(eicosapentaenoic acid)及DHA(docosahexaenoic acid)，參與許多生理功能，包括腦部的發育、認知、生殖、發炎反應及身體衡定性。DHA是視網膜及腦部的細胞膜上磷脂質重要的組成份，在嬰兒早期發育過程中會快速累積於這些組織器官。DHA可直接由飲食中的脂肪提供，或者由它的代謝前驅物ALA(α-linolenic acid)或EPA合成而來。首先，ALA先在內質網中合成EPA、DPA(docosapentaenoic acid)及THA (tetracosahexaenoic acid)，接著THA會被運送到過氧化體，經過一次β-oxidation作用形成DHA。肝臟被視為PUFA代謝的重要器官，它會將新合成好的DHA送至視網膜及腦部以供利用；另一方面，有研究指出腦部會轉換ALA成EPA及DHA以維持其在細胞膜中的濃度。然而，不論是在肝臟或是腦部，從ALA或EPA轉換來的DHA量都非常低，但原因至今並不清楚。 　　動物細胞中，這些n-3PUFAs的含量和參與代謝的酵素活性有關，例如desaturases、elongase、acyl CoA oxidase (AOX)，分別在ALA及EPA轉換上扮演不同的角色。先前研究指出此代謝途徑在細胞中並不活躍，但其機制尚未被研究透徹，目前推論Δ-6 desaturase和AOX也許催化途徑中的速率決定步驟。在這個研究中我們使用了兩種細胞株，分別是HepG2 (human hepatoma cell line)和SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line)，我們想知道給予ALA或EPA，在兩種細胞中n-3PUFA代謝情形，以及參與此代謝步驟重要酵素之基因表現情況。我們發現在HepG2，EPA、DPA和DHA的濃度並不會隨著ALA給予而增加；但若給予細胞EPA時，DPA的濃度會上升，並且有dose-response的情形，但DHA的含量並不會提高。在基因表現層次，不論是給予高濃度ALA或是EPA，HepG2細胞中Δ-6 desaturase的基因表現減少。然而，在SH-SY5Y中， DPA的濃度會隨著ALA或EPA給予而增加，而DHA的含量有些微下降，表示從ALA代謝到DPA的過程較不受限制，但卻代謝到DHA的量非常少。由mRNA表現來看，ALA或是EPA皆會明顯抑制AOX基因表現。接著我們想要了解SH-SY5Y隨著EPA處理時間延長，AOX之基因表現是否持續降低，time-course實驗結果顯示，SH-SY5Y中AOX會持續受EPA抑制至96小時。而我們利用Western blot發現當EPA添加濃度增加，AOX蛋白表現量也呈現減少的趨勢。我們想要探討此抑制作用是否透過AOX起動子上PPRE序列，將AOX-promoter Luciferase 報導基因轉染至SH-SY5Y中，在加入EPA或ALA，結果顯示EPA及ALA會降低luciferase的活性。但在HepG2中，我們發現EPA及PPAR agonist會促進AOX起動子的轉錄活性，而EPA也會提高AOX蛋白的表現量，顯示在HepG2中，PPAR會受EPA及agonist活化，促進AOX表現。因此，我們想繼續了解SH-SY5Y中AOX的基因轉錄是否和HepG2同樣受PPAR調控，以PPARα、γ、及δ的agonist分別添加到SH-SY5Y培養液中，發現三種PPAR agonist都會些微促進AOX蛋白表現；而以PPAR-luciferase報導系統的實驗顯示，EPA會透過到三種 PPARs提高Luciferase活性，但是相較於PPAR agonists，EPA活化PPARs的能力較差，因此EPA應該不是透過PPAR抑制AOX蛋白表現。綜合以上結果我們推測，HepG2細胞株中DHA合成率低的部分原因可能是因為ALA及EPA抑制了Δ-6 desaturase；而SH-SY5Y細胞株中由於ALA及EPA抑制了AOX表現，因此可能是導致DHA合成受阻的原因之一，我們的結果也顯示EPA對於AOX抑制作用並不是透過PPAR。

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幽門螺旋桿菌感染誘導之胃上皮細胞抗細胞凋亡分子分析與機制探討

胃癌是世界上最常見的癌症之一。目前最受科學家注意的是幽門螺旋桿菌感染而造成的胃癌。儘管近年來有許多研究著重於幽門螺旋桿菌其致病機轉的探討，幽門螺旋桿菌導致胃癌發生的詳細機制卻仍還不是完全清楚。由先前的研究指出，幽門螺旋桿菌的寄生將會導致宿主胃部黏膜的發炎，由目前的研究顯示其主要原因之一是二號環氧化酶 (COX-2) 被幽門螺旋桿菌誘導表現所致。二號環氧酶為一製造前列腺素 PGE2 之酵素，除了參與發炎反應外，尚有研究指出，COX-2 以及 PGE2 可能參與抗細胞凋亡反應，然而 COX-2 及 PGE2 是如何參與或調控抗細胞凋亡反應目前尚不清楚。本論文利用幽門螺旋桿菌感染胃上皮細胞 AGS 確立幽門螺旋桿菌的感染可以促進抗細胞凋亡分子「存活素」的大量表現，並發現 COX-2 及 PGE2 均參與減少存活素泛素化之調控，為更進一步研究 COX-2 對存活素之調控，本論文以 shRNA 或者選擇性抑制 COX-2 之藥物 Celecoxib 處理幽門螺旋桿菌感染之 AGS，均有促使 AGS 中存活素下降之趨勢，證明，幽門螺旋桿菌確可以透過 COX-2 的表達以及其下游分子 PGE2 之產生來抑制存活素的泛素化，並減少其降解，因此 COX-2 可能是透過其和其下游分子 PGE2 之作用來穩定存活素，進而行使抗細胞凋亡之功能。除此之外，為了探討存活素是否確實在細胞質中行抗細胞凋亡反應，本論文更使用螢光顯微鏡觀察存活素在細胞中之位置，可觀察到處理幽門螺旋桿菌後，存活素確有自細胞核移至細胞質之現象，因此存活素可能在幽門螺旋桿菌感染後行使抗細胞凋亡之功能。本論文首度證明了幽門螺旋桿菌確有透過 COX-2 以及PGE2 來穩定存活素之現象，並證明了幽門螺旋桿菌可以透過引起存活素在細胞中位置之改變，因此可以產生抗細胞凋亡反應，進而導致胃癌產生。

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肝癌自體抗原之鑑定與生物標記開發

肝癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是台灣最常見的惡性腫瘤之一，位居台灣十大癌症死亡原因的前二位。目前肝癌血液檢查的診斷方式是偵測甲型胎兒蛋白 (alpha-fetoprotein, AFP) 的含量，若 AFP 的量超過 20 ng/mL 則可能罹患肝癌，然而在慢性肝炎病人中肝細胞再生時 AFP 也會增高表特異性不佳，此外腫瘤小於兩公分的肝癌病人 AFP 的靈敏度只有 43 %，顯示 AFP 在肝癌早期無法成為有效的檢測工具，因此尋找有效的生物標記作為診斷肝癌早期的指標是非常重要的。腫瘤細胞異常表現的蛋白質會引發身體的免疫反應產生自體抗體 (autoantibody)，這些引起免疫反應的蛋白質稱為腫瘤相關抗原 (tumor-associated antigen, TAA)，過去利用血清蛋白質體分析 (serological proteome analysis, SERPA) 鑑定到數個可能為肝癌 TAA 的蛋白質，挑選肝癌血清反應較高的蛋白質 hnRNP L、DEAD、lamin A/C 與 hnRNP B1 作確認。由一維電泳免疫轉染法發現肝癌病人血清與 hnRNP L 及 DEAD 反應頻率較高，分別為 64.5 % 和 67.7 %，與正常人、B型肝炎帶原者及肝硬化病人血清比較都有顯著差異，p value 小於 0.01。肝癌病人血清與 hnRNP L 或 DEAD 有反應的頻率是 85.5 % 特異性為 45 %。肝癌病人血清與 hnRNP L 和 DEAD 同時有反應的頻率是 46.8 % 特異性為 95 %。利用酵素連結免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 發現肝癌病人血清對具有抗原決定部位 (epitope) 之短肽 hnRNP L 反應頻率較好，與其他三組血清比較 p value 小於 0.01。為了實行多重生物標記偵測，初步利用 Illumina Veracode Carboxyl Beads 作為 multiplexed protein assay，發現肝癌病人血清與短肽 hnRNP L 反應的頻率是 67.0 %，與其他三組血清比較 p value 小於 0.01。這些結果顯示 hnRNP L 與 DEAD 可為肝癌的 TAA，且短肽 hnRNP L 較適合作為肝癌生物標記。

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牡丹皮抑制腎癌細胞的轉移與增生

腎細胞癌在2007年為全世界發生率第七位的癌症，也是最常見的腎臟惡性腫瘤。而在人類惡性腫瘤中，腎細胞癌佔3 %且每年影響全世界約150,000人，造成約78,000人死亡。大部分的腎細胞癌常常出現血管新生以及細胞入侵能力的提升，加上對傳統治療具有抗性，因此針對有抗性的腎細胞癌患者，近年來細胞激素治療，包含干擾素-α (IFN-α) 與介白素-1，-2，-12 (IL-1,-2,-12) 被大量發展，美國食品暨藥物管制局也允許應用於高度轉移性腎細胞癌已快二十年。然而，細胞激素的使用在中等風險的病人中仍然受限，因此針對於治療腎細胞癌，新藥物的開發與研究應要持續進行。 由於許多國家中的癌症病人開始接受中藥搭配或取代傳統化學治療方式，因此我們以786O細胞株來檢測許多中藥在抑制細胞增生與細胞轉移的效果。我們發現相較於其他中藥，牡丹皮（Paeonia suffruticosa, PS）在細胞實驗與動物實驗中都顯著地抑制細胞轉移與增生，牡丹皮源自牡丹花的樹皮並在過去被應用於許多疾病上，例如：斑、癲癇、經期不規律等。而在過去幾十年的科學研究上，牡丹皮已經被證明有抗增生、抗發炎、抗糖尿病、神經保護等功能。 在本篇研究中，為了探究牡丹皮如何達到抑制細轉移與增生的效果。我們先以即時定量聚合酶連鎖反應 (Quantitative Real-time PCR) 與西方點墨法 (Western blot) 找出被牡丹皮影響的轉移相關基因。我們證明牡丹皮抑制N-cadherin表現量。這樣的抑制效果可能是透過細胞核內β-catenin減少而使Slug表現量下降加上Slug轉置至到細胞核的量也減少；除此之外，我們還發現牡丹皮會影響VEGFR-3/FAK/PI3K訊息傳導路徑來抑制Rac-1的活化而導致肌動蛋白絲形成減少，造成細胞轉移或移動能力降低。 除了抗轉移能力之外，牡丹皮也有良好的抗增生能力，可抑制cyclin A使細胞停滯於細胞周期中的S期，另外，也可以發現Bcl-2減少以及PARP切割增加的情形，代表牡丹皮也可促進細胞凋亡。牡丹皮的抗增生效果可藉由搭配cisplatin與adriamycin來達到協同作用；牡丹皮與cisplatin的協同作用範圍坐落在高抑制區，更具有臨床上的應用價值。根據以上的實驗結果，我們證明牡丹皮同時擁有抑制轉移與增生的能力，亦可以與傳統化學治療一起使用達到協同效果，在未來腎細胞癌的治療上，牡丹皮具有相當大的發展潛力。

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抑制胸苷酸激酶及DNA拓樸異構酶II促進癌細胞死亡

胸苷三磷酸(dTTP)的供給是受嚴密的機制所調控，且對DNA合成及修補非常重要的過程。細胞內有兩條路徑可以提供胸苷三磷酸(dTTP)的合成，分別是新生成和回收路徑。無論是經由新生成或是回收路徑形成的胸苷酸(dTMP)都必須經由胸苷酸激酶(thymidylate kinase, TMPK)進一步的磷酸化形成胸苷二磷酸(dTDP)，再透過核苷二磷酸激酶(NDK)的磷酸化最後完成dTTP的合成。抑制胸苷三磷酸(dTTP）的新合成路徑，已經是許多癌症化學治療藥劑發展的重要策略。 因為胸苷酸激酶(TMPK)在胸苷三磷酸(dTTP)新生成和回收路徑上都扮演重要的角色，我測試是否抑制胸苷酸激酶(TMPK)的表現，能夠降低胸苷三磷酸 (dTTP)的含量並促使癌細胞敏感於基因毒化物的毒殺能力。我使用p53功能正常和缺失的HCT-116結腸癌細胞作為研究材料，並利用以慢病毒為載體的shRNA去抑制TMPK的表現。結果顯示：表現TMPK shRNA可有效降低結腸癌細胞中胸苷酸激酶(TMPK)與胸苷三磷酸(dTTP)的含量。結合TMPK shRNA與廣泛使用於癌症化學治療的試劑–小紅莓(doxorubicin)，則可顯著增加p53功能正常和缺失的HCT-116結腸癌細胞對於小紅莓(doxorubicin)的敏感度。相對而言，若只是降低胸苷三磷酸（dTTP）新合成路徑中重要酵素—胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)的表現量與結合小紅莓(doxorubicin)的治療，並無法增進p53功能缺失的結腸癌細胞走向死亡，因為回收路徑的胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase1, TK1)會彌補新合成路徑中胸苷酸合成酶(TS) 表現量的降低，以維持細胞中胸苷三磷酸(dTTP)的含量，導致治療效果不佳。因此，專一的抑制胸苷酸激酶(TMPK)的功能並結合低劑量小紅莓(doxorubicin)的治療，是一種非常有用的策略，可使癌細胞更容易被化療藥物所毒殺且不受p53功能影響。 因為小片段干擾RNA的應用仍然受限於其遞送的效率，因此利用小分子去抑制胸苷酸激酶(TMPK)的活性應是較為可行的策略。但目前針對人類胸苷酸激酶(TMPK)並沒有專一性高的抑制劑，因此為了去尋找專一性高的人類胸苷酸激酶(TMPK)抑制劑。我建立一種新方法適用於高效率藥物篩選，透過此新方法，篩選到一個化合物，命名為H9805，它可以有效的降低人類TMPK的活性，其IC50為0.61 ± 0.02 μM。更進一步，用H9805化合物處理各種癌細胞，結果發現：H9805化合物可以有效降低各種癌細胞內胸苷三磷酸(dTTP)的含量。MTS分析和克隆形成分析都顯示:經過H9805化合物處理的細胞，增加低劑量小紅莓所誘導的細胞死亡。這些研究資料暗示:H9805化合物是一個有潛力的前驅化合物，可以應用在促進癌細胞對於化學治療之毒殺作用。 總結，本論文的工作，闡明了新生成和回收路徑供給胸苷三磷酸(dTTP)，對於DNA修復過程的重要性，以及提供一種治療癌症的新洞見，抑制胸苷酸激酶(TMPK)的活性可增加癌細胞對於化學治療的敏感度，而有效促使癌細胞死亡。

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調節rRNA合成及D型肝炎病毒複製的重要小型D型抗原保守胺基酸序列

D型肝炎病毒(hepatitis delta virus, HDV)為一具有外套膜之負向單股環狀RNA病毒顆粒，其基因體全長約為1.7 kb。D型肝炎病毒是一種缺陷型的病毒(defective virus)，必須獲得B型肝炎病毒的外套膜才具有感染力，因此被歸類為B型肝炎病毒的衛星病毒。D型肝炎病毒可轉譯出兩種抗原，小型D型抗原(small delta antigen, HDAg-S；195個胺基酸，約24 kDa)參與病毒基因體之複製，而大型D型抗原(large delta antigen, HDAg-L；214個胺基酸，約27 kDa)則與病毒顆粒之組裝有關。許多研究指出D型肝炎病毒的genomic及antigenomic RNA複製可能是透過不同的宿主聚合酶來達成。目前已知genomic RNA複製是利用宿主第二型RNA聚合酶(RNA polymerase II)，小型D型抗原的羧基端(C-terminus)會與第二型RNA聚合酶的clamp domain有交互作用，並且可能參與調控genomic RNA複製的精確性。然而，antigenomic RNA的合成需要何種聚合酶則尚未定論。研究發現，antigenomic RNA的複製不受高濃度α-amanitin影響。先前本實驗室發現小型D型抗原與核仁素(nucleolin)的結合對於小型D型抗原分佈於核仁及D型肝炎病毒複製是重要的。小型D型抗原的中間片段(胺基酸序列87-165)會與第一型RNA聚合酶之最大次單元RPA194有交互作用，而且RPA194與D型肝炎病毒之genomic RNA可以被共同沈澱下來。再綜合其他學者的研究，許多的證據皆指向第一型RNA聚合酶可能參與D型肝炎病毒antigenomic RNA的合成。除此之外，大量表達小型D型肝炎會抑制宿主rRNA新生成。其他研究發現，人類核仁磷酸化蛋白140 (human nucleolar phosphoprotein 140; hNopp140)的中間片段(胺基酸序列204-382)會與RPA194結合，hNopp140為組成核仁的最小單元並且與rRNA合成相關。根據序列比對結果發現，小型D型抗原及hNopp140的RPA194結合區域，其胺基酸序列具有相當程度的相似性，推測可能是小型D型抗原會利用相似序列競爭hNopp140與RPA194或rDNA promoter之交互作用。 本研究首先利用同源性模擬法(homology modeling)預測RPA194 clamp domain可能包含胺基酸序列1-409 (pol IA)。利用pull-down assay證明此片段會和小型D型抗原結合。進一步，分析小型D型抗原的保守胺基酸序列並交叉比對hNopp140的演化保守胺基酸序列，將小型D型抗原保守性胺基酸Lys106及Ala107分別突變成Ala及Asp (HDAg-S-106AD)，125EEE127則皆突變成Ala (HDAg-S-125AAA)。由pull-down assay的結果發現HDAg-S-106AD與pol IA的結合能力較野生型小型D型抗原弱，而HDAg-S-125AAA與pol IA的結合卻會增強。RT real-time PCR的結果發現HDAg-S-125AAA幾乎不會抑制45S rRNA的新生成，而HDAg-S-106AD抑制45S rRNA新生成的情況則與野生型小型D型抗原差異不大。此外，RT real-time PCR結果也顯示此兩種突變型小型D型抗原皆不支持D型肝炎病毒total RNA及antigenomic RNA之複製。以上結果顯示保守性胺基酸Lys106、Ala107及Glu125-127對於病毒RNA的複製及抑制宿主rRNA合成扮演不同的重要角色，然而pol I是否參與病毒RNA複製及小型D型抗原抑制rRNA新生成的詳細機制，則需要更進一步的釐清。

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探討薑黃素在攝護腺癌細胞移動、侵襲以及間質蛋白酶活化的影響

攝護腺癌的癌症致死率在西方男性世界中排名第二位；在台灣，攝護腺癌的發生率以及死亡率亦有逐年提升的現象。攝護腺癌的高致死率主要是由於癌症的病程發展到癌細胞具有較高移動、侵襲和轉移能力或變成雄激素非依賴型的徵狀。薑黃素 (Curcumin) 是由中草藥和薑黃萃取出來的多酚類物質，近年研究指出薑黃素具有抗氧化、抗發炎、抗癌以及預防癌症產生 (chemoprevention) 的能力，然而，薑黃素是如何抑制攝護腺癌細胞侵襲的分子機制尚未清楚了解。在本篇研究裡，我檢測了薑黃素對於攝護腺癌細胞 (PC-3) 的生長、移動與侵襲的影響。實驗結果指出薑黃素可有效地抑制攝護腺癌細胞的生長、移動與侵襲的能力。為了更進一步研究薑黃素抑制攝護腺癌細胞移動與侵襲的分子機制，我檢測了薑黃素對於間質蛋白酶 (Matriptase) 的影響。間質蛋白酶是第二型嵌膜絲胺酸蛋白酶，近年來研究指出不正常活化的間質蛋白酶可能參與了許多癌症的演進，包括攝護腺癌。而實驗結果指出，薑黃素可以降低間質蛋白酶的表現量及活化，但不影響其基因的表現。此外，薑黃素可以促進已活化的間質蛋白酶釋出到細胞外。更進一步地，我們建立了攝護腺癌細胞侵襲能力進化的細胞模式 (PC-3 以及M2I1 PC-3 cells)，並檢驗了薑黃素對此 PC-3 侵襲細胞模式的侵襲能力之影響。 M2I1 細胞比起 PC-3 細胞具有大約多達一倍的侵襲能力。而薑黃素可抑制M2I1細胞侵襲能力，其原因可能是藉由抑制了活化的間質蛋白酶，而非透過影響上皮-間質轉化 (Epithelial-mesenchymal transitions) 的過程。此外，我也檢驗了薑黃素對於過量表達間質蛋白酶的細胞其侵襲能力的影響，透過建立大量穩定表現間質蛋白酶的 CWR22Rv1 細胞，發現大量表現間質蛋白酶的CWR22Rv1細胞可提升高達一倍的侵襲能力。而薑黃素亦可抑制這些大量表現間質蛋白酶的 CWR22Rv1 細胞之侵襲能力，且抑制的現象隨著薑黃素的濃度上升而增加。此外，實驗結果也顯示出薑黃素可以抑制因表皮生長因子 (EGF和Heregulin) 所刺激而增加的PC-3 細胞侵襲能力。整體來說，實驗結果指出薑黃素具有抑制間質蛋白酶功能而達到壓抑攝護腺癌細胞侵襲的能力。

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C型肝炎病毒非結構性蛋白質NS5A透過MAPK訊息傳遞路徑調控抗氧化防禦相關基因

C型肝炎病毒(hepatitis C virus)感染，常會演變成持續性感染並且可能引發肝癌。C型肝炎病毒非結構性蛋白質NS5A，目前已知會影響宿主細胞的生長和存活能力。本實驗室先前的研究顯示，NS5A蛋白質會與宿主細胞PKR (double-strand RNA-activated protein kinase)形成異源雙體並抑制PKR活性，使細胞通過細胞週期G2/M階段受到阻礙而延遲離開，造成染色體不穩定，可能為引發肝癌的原因之一。為了進一步釐清NS5A-PKR訊息傳遞路徑對於肝癌發生是否扮演重要角色，本論文首先於人類肝癌細胞株Huh7建立可穩定表現突變型NS5A蛋白質(NS5A-mPTT)的細胞株。在此Huh7系統中，突變型NS5A-mPTT蛋白質喪失與PKR形成異源雙體的能力，而NS5A蛋白質所造成的細胞週期異常調控及增殖速度變緩慢的現象，在突變型NS5A-mPTT蛋白質存在下則不會發生。使用軟瓊脂培養(soft agar)測試轉型(transformation)能力，結果發現穩定表現NS5A蛋白質的細胞相對於表現突變型NS5A-mPTT的細胞具有較高的轉型能力，顯示NS5A-PKR路徑對於肝癌發生扮演重要角色。過去研究顯示，NS5A蛋白質誘導活性氧化物(ROS)生成，造成DNA損傷(DNA damage)，可能因此促使細胞走向癌化。而細胞內抗氧化防禦機制主要由Nrf2 (NF-E2-related factor-2)及small Maf (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family)異源雙體所調控。本論文在可穩定表現C型肝炎病毒1b strain之次基因體複製體細胞株(HCV subgenomic replicon)發現DNA損傷標記物8-hydroxyguanosine明顯增加。根據軟體分析發現small Maf家族成員中MafF啟動子上擁有可受NS5A蛋白質調控之轉錄因子的結合位置。利用反轉錄酶-即時聚合酶連鎖反應顯示，C型肝炎病毒1b strain之次基因體複製體，NS5A及突變型NS5A-mPTT細胞中，MafF基因表現量均下降。由MAPK及PI3K抑制劑的實驗結果推測，NS5A可能透過PKR-p38及ERK訊息傳遞路徑抑制MafF的基因表現，且此二路徑相互影響，此一立論進一步在螢光素酶分析(Luciferase reporter assay)得到了證實。相反的，在C型肝炎病毒1b strain之次基因體複製體細胞株發現Nrf2蛋白質的表現量及活性卻增加，可能是病毒調控細胞存活的作用機制之一。當細胞大量表現NS5A蛋白質時，再處理H2O2之後，確實會使細胞累積更大量DNA損傷。由本論文結果推測，NS5A蛋白質透過PKR-p38及EKR訊息傳遞路徑抑制MafF 基因表現而導致抗氧化防禦(antioxidant defense)能力降低，使DNA 受到傷害，可能是促使C型肝炎病毒感染細胞走向癌化的方式之一。

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人類鳥胺酸脫羧酶與抗酶複合體之結構研究

多元胺 (polyamines) 為結構中帶有多個胺基的脂肪族小分子，包含腐胺 (putrescine) 、亞精胺 (spermidine) 和精胺 (spermine)，此類帶正電的物質可和帶負電的DNA、RNA或蛋白質產生交互作用，參與細胞生長、分化與凋亡的過程。 人類鳥胺酸脫羧酶 (Ornithine decarboxylase, ODC；EC 4.1.1.17) 為依賴5’-磷酸吡哆醛 (pyridoxal 5’-phosphate, PLP) 輔酶之酵素，負責催化鳥胺酸 (ornithine) 之脫羧反應得到腐胺，此為胞內多元胺合成途徑之第一與速率決定的步驟，亦是多元胺合成的主要調控點。ODC結構包含兩個domains，N端為TIM-like α/β-barrel domain；C端為β-sheet domain。兩個ODC單體 (monomer) 以頭尾相連 (head-to-tail) 的方式組成雙聚體 (homodimer)，其活性中心之胺基酸Lys-69會以Schiff base方式和輔酶PLP結合，形成具有催化活性的酵素。 胞內多元胺的含量會直接影響多元胺的合成，當細胞內多元胺含量過高時，會使抗酶 (antizyme；AZ) 的mRNA藉由轉譯調控合成具有功能的全長AZ蛋白。AZ為ODC之負回饋調控因子，可和ODC單體結合形成異雙聚體 (heterodimer)。AZ與ODC結合後不但會使ODC失去酵素活性，還會使ODC C端發生構型變化，露出可被26S 蛋白酶體 (proteasome) 辨認的降解訊號，進行不依賴泛素的降解路徑 (ubiquitin-independent degradation pathway)，進而抑制多元胺的合成。除了上述的負調控機制外，細胞尚可藉由抗酶抑制因子 (Antizyme inhibitor, AZI) 正向調控多元胺的合成，AZI與ODC具有序列與結構上的同源性，能與AZ形成更穩定的複合體而釋放出ODC，使胞內ODC雙體的含量上升。 本篇論文的主要目的在於解析ODC-AZ蛋白複合體的晶體結構，以深入探討ODC與AZ交互作用的方式，進而解釋AZ如何促使ODC進行不依賴泛素的蛋白降解機制。我們已經成功置備ODC與多種AZ刪除突變形成之複合體，並順利得到複合體的晶體。目前最好的繞射數據其解析度約為3.2 Å，初步分析顯示此晶體屬於Primitive tetragonal 晶系，空間群為P41212，晶胞參數為 a=b=266.64 Å，c=52.37 Å，α=β=γ=90˚。未來希望能得到品質更高的晶體，以利後續結構的解析。