國立臺灣大學微生物學研究所學位論文/Graduate Institute of Microbiology
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Sindbis virus等alphavirus載體系統能在動物細胞內表現大量外來基因，且其寄主廣泛，操作便利，近十年來已引起眾多研究人員的注意。其RNA自我複製時所產生之雙股RNA會引發細胞先天對抗病毒的免疫機制，再加上其感染細胞後導致細胞凋亡，吸引樹狀細胞吞噬，致使利用此種載體設計成的疫苗，能引起體液、細胞及腸道全面性的免疫反應，效果更優於傳統的DNA疫苗。我們希望將Sindbis病毒載體系統，應用在腫瘤治療的研究，我的研究即在建立起一個易操作的Sindbis病毒載體系統。我將攜帶病毒非結構基因和外來基因的replicon vector，以及攜帶病毒結構基因的helper vector，分別建構於CMV啟動子的控制之下。以磷酸鈣沉澱的方法將構築出之replicon DNA及helper DNA共轉染至293T細胞中，結果能成功製備出大量的重組病毒。接著將重組病毒感染BHK細胞，經由北方墨點法的分析，證明攜帶VP22-mAFP、CRT-mAFP、mAFP或EGFP基因的各個replicon RNA，都能成功地於細胞內複製出genomic RNA及生成subgenomic RNA；再以西方墨點法分析結果，亦證明至少EGFP、CRT-mAFP能成功地在細胞內表現出其蛋白質。最後以製備出之重組病毒分別感染七種不同的腫瘤細胞株，發現其對人類肝腫瘤細胞株Huh-7及HepG2有很高的感染效率，但對小鼠的腫瘤細胞株CT26、BNL及EL-4的感染效率則不佳。此載體系統目前的缺點是會發生helper RNA與replicon RNA共同被包裹進病毒顆粒的問題，這有待作更進一步的改進。
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不同的致病菌為適應不同的生活形態其生理和毒力特性反映出有不同的基因存在，近十年來，眾多的致病菌基因圖譜已被建構完成，加速了對細菌基因演化的了解。利用基因體比對，顯示參與細菌基因體演化的機轉主要可分為兩種：一是基因的獲得；另一則為基因的喪失。黴漿菌、披衣菌、分枝桿菌屬和立克次體等細胞內病原生物的基因會有缺失的情形，而一些感染性病原菌，則可從不同的跳躍因子獲得毒力基因。此外，越來越多的研究發現，不管是高度保留性或高度重組性的細菌，皆有大規模的基因體重組經由大片段基因互換所產生，且經常是沿著複製的起始點具有對稱性。 轉糖鏈球菌（Streptococcus mutans）為草綠色鏈球菌的一員，是人類齲齒、及感染性心內膜炎等疾病的病原菌。利用生化鑑定或血清型鑑定已證實該菌具有高度變異性存在，而同一血清型c的分離株間仍有變異性存在其中，例如產生bacteriocin，發酵melibiose和其他醣類的能力。本實驗室先前的研究已發現轉糖鏈球菌同一血清型c的分離株之營養需求不同，而且與致病力相關之細菌表面蛋白質的表現例如 gbpA的合成與否，也有差異。但至今尚未有系統性關於轉糖鏈球菌染色體中，是否具有大規模的基因重組或大片段的基因互換的研究。而另一方面，卻有新菌種不屬於已知任何之血清型的菌株，自心內膜炎的血液中分離出來。因此更加顯示利用基因體尋找分類及與致病力相關的因子之重要性及必要性。本實驗的目的是 (1) 利用分子生物學方法分析分別從健康人、高齟齒罹患者口腔當中，和心內膜炎患者血液中分離出之臨床菌株轉糖鏈球菌染色體的變異性，(2) 找到基因重組或大片段的基因互換的位置及分子機轉。 我們總共篩選了7株實驗室菌株，58株臨床菌株（50株口腔菌株，8株血液菌株），利用NotI和I-CeuI水解不同Streptococcus mutans菌株的DNA，利用PFGE分析其基因變異，並以已定序出來的S. mutans UA159當作比對的依據。比較實驗室菌株之間的差異性，設計不同的探針分別與實驗室菌株S. mutans UA159、GS-5(S)、和GS-5(R)不同的限制酵素水解片段雜合，顯示，GS-5(S)當中有一個大片段的基因互換在兩個相反方向的核醣體之間。而GS-5(R)中有約10 kb的基因缺失位於gbpA基因附近和I-CeuI 189 kb的水解片段，另外還有一段約8 kb的基因增加位於可能是穿膜蛋白的未知基因，和recA基因之間，且可能有IS序列參與在GS-5(R)的基因變異中。利用專一性的探針來偵測臨床菌株，顯示在臨床菌株中大片段基因互換頻率較實驗室菌株高，且臨床菌株中gbpA基因缺失的頻率約有12.3%。 我們選用PFGE分類法將S. mutans分類並以GelCompar軟體分析Streptococcus mutans菌株的PFGE形式，試圖將之分類，結果顯示NotI水解的片段過於複雜，難以將其分類。因此我們選用I-CeuI水解的PFGE形式分類，因其保留性高且水解片段較不複雜，依水解片段的缺失或增加分為四大類，第一類其三個I-CeuI水解的片段都比Streptococcus mutans UA159的高或是有一個特別的高，顯示可能有大片段的基因增加；第二類菌株其I-CeuI水解的片段跟S. mutans UA159位置相似，但其中有一至兩個片段比S. mutans UA159高一點，顯示可能有小片段基因的增加；第三類菌株其水解的片段都偏低且有一個片段特別低，顯示可能有大片段的基因缺失；第四類菌株水解的片段位置與S. mutans UA159相似，但其中有一至兩個片段比UA159低一點，顯示可能有小片段基因缺失。 利用統計分析不同來源的菌種之間，其外觀特性和基因變異性的比例是否有差異性，結果顯示，外觀上，大多數菌株都是粗糙、深藍色的菌落，在大片段的基因互換比率上，臨床菌株比實驗室菌株高。相反的，臨床菌株gbpA基因缺失的比率卻少很多。此外，分析實驗室菌株與臨床菌株I-CeuI水解片段，臨床菌株基因增加的比例比實驗室菌株的比例高，約為53.4%比14.3%，且從血液分離出來的菌株其基因缺失的比例較其他來源的菌株高一些，綜合以上的結果，我們發現在S. mutans臨床菌株中有高頻率的染色體互換（約41.4%）及各種不同長度的增加或缺失的基因片段散佈在基因複製起始點附近，顯示S. mutans具有很高的基因特異性。
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轉糖鏈球菌的產酸性與酸耐受性是造成齲齒的重要致病因子之一。先前實驗已證明，先利用弱酸刺激對數生長期的細菌會誘發酸耐受性反應(Acid tolerance response,ATR)可以增加在強酸環境下的存活。此種對數生長期的ATR需要上游調控作用與下游調控作用以調控蛋白質合成。本實驗室先前已發現citBZC operon為會受到酸鹼值5.5與外生性檸檬酸下游調控的基因，顯示此operon在轉糖鏈球菌的ATR上扮演某種角色。 在本篇實驗中分析野生株GS-5R與isogenic mutants之間耐酸性的差異，並驗證了生長期與細胞濃度皆可調控轉糖鏈球菌的酸適應力。我們發現citB mutant可以在致死性酸鹼值下稍微增加存活率，且比野生株與其他突變株能維持較高的胞內酸鹼值。培養基中僅含檸檬酸(citrate)無法支持轉糖鏈球菌生長，但外加檸檬酸到培養基中會產生dose-dependent抑制生長的現象。利用defined medium我們發現此種抑制生長的現象是由於檸檬酸螯合掉金屬離子所致。檸檬酸可以幫助轉糖鏈球菌產生酸耐受性，特別對未經弱酸適應的citB mutant效果最為顯著；而單獨剔除掉citM(citrate transporter)的突變株卻仍然保有外加檸檬酸可增加耐酸性的現象，推測檸檬酸可能在細胞外就具有幫助產生酸耐受性的作用；由基因資料庫比對找到在轉糖鏈球菌中含有檸檬酸發酵途徑中必需酵素的gene cluster，其中包括一組two component system genes，實驗室中已建構了其sensor 與regulator的突變株並預備分析並比較其酸耐受性。由實驗結果初步瞭解，檸檬酸除了在細胞內可以發揮部分緩衝溶液系統的功用外，或許在細胞外就可當作一個訊息分子誘發轉糖鏈球菌的酸耐受性。
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肝細胞癌為全世界性的疾病，長期位居國人十大死因之一，引起肝細胞癌的原因有許多種，包括病毒性感染、酒精及藥物濫用引起的肝硬化而導致肝細胞癌化，或者是由其他器官腫瘤轉移而來的肝細胞癌。由目前已具有的傳統治療中，如外科手術治療、動脈栓塞或者是化學療法而言，大多只對於較小的肝細胞腫瘤及尚未轉移的腫瘤細胞才具有較好的治療效果;肝臟移植為較好的根除肝細胞腫瘤方法，但是每年捐肝的人數有限，因此找尋新的治療方法並搭配傳統治療就成為近幾年來熱門的研究方向，我們實驗室以免疫基因療法來治療原位性肝腫瘤動物模式，在學長先前的實驗中，以3 x 106 GP7TB細胞建立位在Fischer 344大鼠肝葉上的原位性肝細胞腫瘤，再以3x109 重組腺病毒攜帶GM-CSF基因，以腫瘤內的注射方式治療三天大及七天大的動物腫瘤，實驗結果發現，對於三天大的動物腫瘤，攜帶GM-CSF的重組腺病毒具有很好的療效，但是對於七天大的腫瘤治療效果不好。在我的實驗中，除了大鼠的動物模式之外，尚增加了以3x105 BNL細胞建立位在BALB/c小鼠肝葉上的原位性肝腫瘤。在免疫基因治療中，更進一步合併1x109 攜帶IL-12基因及1 x 109攜帶GM-CSF基因的腺病毒載體，治療七天大及十四天大的原位肝細胞腫瘤，實驗結果發現，對於七天大的原位肝細胞腫瘤，在小鼠或大鼠的動物模式，IL-12合併GM-CSF對腫瘤的清除效果分別達到96.4%及98%，但是對於十四天大的肝細胞腫瘤，治療效果則明顯降低至50%及76%。在以細胞激素刺激的免疫治療中，為了能更進一步有效的治療十四天大的肝細胞腫瘤，我合併抗血管生成基因療法，希望以血管內膜阻生素( endostatin )，抑制腫瘤腫瘤內血管的生成，使得IL-12及GM-CSF刺激的免疫細胞能更進一步有效的清除腫瘤。在實驗中，在重組腺病毒治療的同時，以電擊的方式，分別將100μg及300μg的endostatin質體DNA打入小鼠及大鼠的大腿四頭肌中，並且一星期後再以DNA電擊治療一次，在第28天觀察結果，對於小鼠及大鼠的抑制腫瘤效果分別達到57%及86%。除了腫瘤治療的實驗之外，我另外以特定的抗體去除小鼠內的特定免疫細胞，結果發現，由於GM-CSF對於抑制七天大的小鼠腫瘤模式效果不好，因此去除小鼠的自然殺手細胞、CD4 T細胞及CD8 T細胞，對於GM-CSF抑制腫瘤的結果影響不明顯。以IL-12治療腫瘤，去除自然殺手細胞，會大部分抑制IL-12抑制腫瘤的效果;去除CD4、CD8 T細胞也會些許的抑制IL-12治療腫瘤的效果。以GM-CSF合併IL-12治療腫瘤，抑制小鼠的自然殺手細胞對於治療腫瘤的效果不受影響，推測可能是CD4及CD8細胞在抑制腫瘤細胞扮演重要的角色。
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急性嚴重呼吸道症候群(SARS)是一種由新興冠狀病毒所引發的非典型肺炎，自大陸廣東省第一起病例發生，已在許多國家造成恐慌。目前雖然疫情得到控制，但是否會爆發第二次的流行尚無法得知。台灣於2003年3月出現第一個指標病例-勤姓台商時，台大SARS研究群便開始著手研究分析SARS-CoV，也成功在感染檢體之非洲綠猴上皮細胞株Vero E6 cell line培養出冠狀病毒顆粒。本實驗室首先將勤姓台商系病毒株中的外套膜蛋白質以反轉錄聚合酶連鎖反應將基因序列增殖，並利用重組基因體的技術放入各種載體中，其中包括利用GST的系統來研究。先前已利用酵母菌雙雜合法(yeast two-hybrid system)找尋到數個與細胞凋亡機制相關的蛋白質會和SARS-CoV外套膜蛋白質有結合作用。在本研究中利用GST pull-down assay對此交互作用作進一步驗證。另一方面，為了探討這些結合作用在細胞凋亡過程中所扮演的角色及其與SARS-CoV致病的相關性，在本研究中亦同時分析比較SARS-CoV外套膜蛋白質與人類冠狀病毒HCoV-229E外套膜蛋白質和這些細胞凋亡蛋白質交互作用的差異性，並同步分析另一新鑑定出的SARS-p30蛋白質在致病機制上可能扮演的角色。結果發現這三種蛋白質在與RAIDD蛋白質或Bcl-xL蛋白質的結合有較大的差異。進一步探討其交互作用之次單元時，發現SARS-CoV外套膜蛋白質C端會與RAIDD蛋白質的N端作用，而SARS-CoV外套膜蛋白質N或C端都可與Bcl-xL蛋白質結合。過去的研究已知RAIDD蛋白質的N端具有caspase recruitment domain (CARD)會與caspase2蛋白質結合，而C端具有death domain (DD)會與receptor interacting protein (RIP)結合，透過如此雙重的結合進而將TNF-α所誘發的細胞凋亡訊息傳遞下去。因此SARS-CoV外套膜蛋白質與RAIDD蛋白質的結合是否會影響death receptor signaling的進行，是值得探討之處。未來進一步暸解SARS-CoV外套膜蛋白質與這些蛋白質結合對細胞產生的影響，將有助於對SARS-CoV致病機轉的認識。
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血清學的方法是目前廣泛使用於檢測是否有幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori ) 感染的方法之一，但目前使用的血清學檢測方法，在準確度、靈敏度上仍有一定的限制，並且需培養大量的幽門螺旋桿菌抽取蛋白質，因此進一步鑑定幽門螺旋桿菌中具有高抗原性的蛋白質，可能進一步提高血清學診斷的準確性並節省檢驗的成本。我們將幽門螺旋桿菌液態培養液中的蛋白質經二維電泳技術分離，樣本血清根據血清檢測試劑（HEL-pTEST®Ⅱ kit）以ELISA 方式檢驗及細菌培養確認幽門螺旋桿菌感染，將血清類分為真陽性及偽陰性，各取兩個血清進行西方墨點法篩選抗原。偵測結果發現有兩群共通的訊號出現，進一步以微量蛋白質N端定序及基質輔助雷射脫附游離／飛行時間質譜分析方法來鑑定其中數點，與資料庫比對分析結果，與幽門螺旋桿菌的蛋白質 catalase以及flagellar hook-associated protein 2（HAP2）有相當高的相似度。以分子生物學的技術表現catalase及HAP2的重組蛋白，接著再用27個真陽性，5個偽陰性、10個真陰性血清來分析其抗原性。其中catalase的靈敏度（sensitivity）和準確度（specificity）為25％和100％，而HAP2則為90.6％及60％，顯示HAP2具有較佳的抗原性，並對偽陰性血清樣本有很高的靈敏度，未來可與其他高抗原性蛋白組合應用於幽門螺旋桿菌感染的檢測。
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C型肝炎病毒 (Hepatitis C virus) 為一單股正向RNA病毒，會感染人類造成C型肝炎。約有85% 的感染者會轉變成慢性肝炎，伴隨肝硬化的併發症，甚至導致肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma)，臨床上多以干擾素合併ribavirin來治療患者。由於目前仍無法利用細胞培養的系統培養出C型肝炎病毒，對其致病機轉的了解還不十分清楚。近幾年的研究指出，HCV的非結構性蛋白質NS5A是造成干擾素抗藥性的可能因子之一；NS5A也會與細胞內的訊息蛋白質結合，干擾細胞内的訊息傳導路徑，例如MAPK (mitogen activated protein kinase) 與TNF-α(tumor necrosis factor-α) 的傳導路徑。MAPK傳導路徑可以調控細胞的生長與分化，而Ras-ERK 為其中的一條訊息傳遞路徑。在本實驗中利用受doxycycline調控表現NS5A的HeLa-tetoff-NS5A細胞株與HepG2-teton-NS5A細胞株，探討NS5A對Ras-ERK訊息傳遞路徑以及下游分子的影響。在HepG2-teton-NS5A細胞株中，當NS5A被誘導表現時，ERK1/2磷酸化的情形會受到抑制，但上游分子MEK1/2的磷酸化與MKP1蛋白質表現量皆不受NS5A影響。以流式細胞儀分析HepG2-teton-NS5A細胞株時，發現誘導NS5A表現並不會對細胞周期造成影響。因此，NS5A如何抑制ERK磷酸化以及ERK磷酸化減少後對細胞生長的影響仍需進一步探討。 目前已知HCV非結構性蛋白質NS4A為NS3的輔助因子 (cofactor)，NS4A會與NS3結合，增進NS3在serine protease的切割作用，對於HCV的非結構性蛋白質的成熟扮演重要的角色。本實驗室先前利用GST pull down的方法發現GST-NS4A與eEF1A有結合作用，更進一步利用活體外轉譯系統發現eEF1A是利用羧基端與 GST-NS4A結合。此外，最近的研究顯示NS4A會抑制蛋白質的合成，但其作用機制則不明瞭。本研究利用免疫沉澱，觀察細胞內兩個蛋白質互相作用的情形。結果發現NS4A會與細胞內全長的eEF1A互相結合，但卻無法與eEF1A氨基端(1-240)或羧基端(201-462)的次功能區域結合。由定點突變的實驗，發現NS4A胺基酸28的位置由arginine變異成alanine時會破壞其與eEF1A之間的結合能力。是否NS4A對細胞內蛋白質合成的抑制是因其與eEF1A結合導致，以及eEF1A在HCV複製時所扮演的角色，則需作進一步的探討。
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HER-2屬於表皮生長因子接受器家族(epidermal growth factor receptor family；EGF receptor family)的一員。HER-2基因在許多人類癌症中時常有放大(amplification)或過度表現(overexpression)的現象，目前已知HER-2可以傳遞數個不同的信號路徑，這些路徑導致HER-2具有強大的致癌能力，因此，HER-2被認為是治療癌症的標的之一。 我們實驗室設計了HER-2的siRNA，可以有效抑制HER-2的表現，並在數株HER-2-overexpressing細胞中，發現可以導致細胞走向凋亡，而對於HER-2 low-expressing細胞無影響，因此，此siRNA具有用於治療HER-2-overexpressing癌症的潛力。
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酵母菌主要是藉由端粒酵素來複製端粒。當端粒酵素缺乏時，細胞會逐漸走向老化 (senescence)、死亡，只有少數細胞可以倖存。這些倖存細胞主要是藉由選擇性重組路徑(alternative recombination pathway)來延長端粒。YPL014W在細胞老化、重組作用發生的過程中表現量上升。由於Ypl014w可與Cdc28、Cln3等細胞週期蛋白結合，為Cdc28蛋白複合體（Cdc28p-associated complex）的一部份，所以我們藉由研究對ypl014w△突變株及cln3△ypl014w△突變株的生長特徵分析、YPL014W 的轉錄是否受到葡萄糖的影響以及Ypl014w是否會影響葡萄糖所引起的CLN3 mRNA的表現量上升、Ypl014w對Cln3-Cdc28激酶活性之影響，來探討Ypl014w可能的功能。在外觀型態及細胞週期分析實驗中，我們發現YPL014W會影響細胞週期的分佈，而此影響可能是藉由影響Cln3來達成。在生長速率的研究中，YPL014W的剔除則對於細胞生長速率並沒有影響。在YPL014W與葡萄糖調控的實驗裡，發現YPL014W的轉錄會受到葡萄糖的影響而YPL014W並不會影響由葡萄糖所引起的CLN3 mRNA的表現量上升。藉由生長特徵分析及Ypl014w與葡萄糖相關的研究，我們已初步觀察到Ypl014w在細胞週期與葡萄糖調控上的影響。
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利用1500株幽門桿菌突變株，篩選其對胃癌上皮細胞株黏著能力，以尋找幽門桿菌之黏著因子，發現6株突變株黏著能力降低，但光學及電子顯微鏡下觀察發現菌體型態明顯延長。定序後發現這6株突變株破壞的基因是相同的，但幽門桿菌26695及J99菌株全基因體中並無該核酸及胺基酸的相似序列。這個開放讀架由1617個鹼基對組成，胺基酸序列和Bacillus halodurans的一個推斷的單股剪切酶有24%的相似性，和二個第IIS型限制內切酶，PleI和MlyI，分別有23%及20%相似度。分析這個純化的未知限制酶，HpyC1I，其辨識及剪切位置為5’-CCATC(4/5)-3’。此基因上游二個開放讀架，M1.HpyC1I和M2.HpyC1I，都含有甲基轉移酶的弁鈰礡A因此這三個基因可能構成一個調控組，且負責限制-修飾弁遄C這段序列和全基因體比較，G+C含量明顯較低，推測可能經由水平基因轉移獲得。測試15株幽門桿菌菌株，有9株菌株具有這個HpyC1I限制-修飾基因。質體DNA轉型和染色體裁切的實驗證明擁有HpyC1I限制-修飾系統可以使DNA受到保護不被HpyC1I剪切。在本研究中我們發現一個新的限制-修飾系統-HpyC1I限制-修飾系統，此系統存在於~60%的幽門桿菌菌株中，且破壞會導致細菌型態延長和HpyC1I限制酶的裁切。