國立臺灣大學微生物學研究所學位論文/Graduate Institute of Microbiology
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在大部分的真核生物裡，端粒的複製是藉由端粒酵素（telomerase）維持。缺乏端粒酵素的酵母菌族群仍有一些倖存的細胞，能夠利用DNA重組（recombination）的方式有效的延長端粒長度。第二類型的倖存細胞利用telomerase-independent alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway的方式維持端粒的功能，而YPL014W在酵母菌細胞進入ALT pathway時表現量上升。由於已知Ypl014w可與Cdc28、Cln3等細胞週期調節蛋白形成複合體 (complex)(Uetz et al., 2000)，顯示Ypl014w可能參與細胞週期的調控路徑，又因其在ALT pathway中表現量上升，這暗示端粒延長路徑與細胞週期調控之間的關聯。因此本實驗藉由觀察Ypl014w對Cdc28、Cln3的影響，來推知其功能，目前已知YPL014W的剔除不會影響Cdc28-Cln3複合體對下游蛋白質Whi5的磷酸化，也不會影響細胞週期的進行;另外我們發現Ypl014w為一可被磷酸化之蛋白質，但CLN3的剔除和CDC28的溫度敏感突變株同樣不會影響Ypl014w的磷酸化。另外藉由synthetic lethal method沒有找到YPL014W的redundant gene。進一步利用yeast two hybrid確認Cdc28、Cln3和Ypl014w的結合時，發現Cdc28和Ypl014w沒有直接的結合關係，而Cln3的部分則無法證明，同時也利用Ypl014w做為bait，以酵母菌雙雜交實驗尋找和它結合的蛋白質，還有進行IP，利用SDS-PAGE分開後，解Mass以尋找和Ypl014w有結合的蛋白質，但都沒有所獲。 另一方面之前的實驗證實YPL014W的表現是受到Mcm1所調控，Mcm1是一個調控許多細胞週期相關基因的轉錄因子，在這裡藉由chromatin IP直接證明了Mcm1會結合到YPL014W的啟動子上，且證明了之前所預測的兩個ECB elements的確是Mcm1的結合處。
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Warfarin (華法林) 是一種心臟科常使用的藥物,主要用來預防深部靜脈栓塞，肺栓塞，缺血性冠狀動脈疾病，人工瓣膜置換後，以及心房顫動等，還有跟阿斯匹靈合用以治療急性心肌梗塞。但使用劑量因人而異。如果劑量過高有出血致死的危險存在，過低卻沒有效果。同時亞洲人種使用的劑量普遍比高加索人種低，可是其原因不明。本研究目的在尋找遺傳因素導致華法林用藥劑量上個人間和族群間的差異。 本研究發現一個VKORC1基因啟動子調控區的單核甘酸變異(Single Nucleotide Polymorphism) VKORC1-1639A>G和其啟動子活性可以解釋華法林個人之間和族群之間用藥劑量差異。本實驗利用16個華法林用藥量極端敏感或極端抵抗的病人，找出VKORC1-1639 A>G 的單核甘酸變異。利用MALDI-TOF技術完成了104個隨機病人的基因行鑑定進行統計分析。AA 基因型的維持劑量比AG/GG 基因型的低 (P<0.0001)。本研究並利用啟動子測定，和酵素活性測定確認VKORC1-1639A>G 是一個功能性單核甘酸變異。此變異導致VKORC1基因表現量增加44%。由於VKORC1表現亮增加導致VKOR活性增加，因此需要更高劑量的華法林去抑制。
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EB病毒已被報導與淋巴瘤與鼻咽癌等人類惡性腫瘤有密切相關。過去認為EB病毒潛伏期基因產物與腫瘤的發生有關，而最近的研究顯示當EB病毒活化進入溶裂期時，可能參與了致病的過程。然而針對大多數EB病毒溶裂期基因的表現或功能的瞭解，仍相當有限。 為了進一步瞭解所有溶裂期基因的表現及其可能參與病毒DNA複製的機制。在本論文中，建立了EB病毒DNA微陣列，系統性的分析在Akata細胞利用抗G型免疫球蛋白，活化病毒進入溶裂期時，病毒基因在不同時間點表現的情形。並依表現模式將基因分為不同的表現群，發現潛伏期基因EB病毒核蛋白EBNA2、EBNA3A、EBNA3C，會隨著病毒活化進入溶裂期而增加。另外，在Akata細胞中加入DNA聚合酶抑制劑PAA，或利用化合物刺激Raji細胞，分析在EB病毒DNA無法複製時，病毒基因表現的情況，意外發現某些被推測為病毒DNA複製完成才會表現之晚期表現基因，卻在EB病毒活化進入溶裂期的早期開始表現，推測這些基因可能具有未知的生物功能。此外將EB病毒特早期表現之轉活化因子Rta轉染進Raji細胞，以及在帶有EB病毒之上皮細胞NA中，利用干擾性RNA抑制另一轉活化因子Zta的蛋白表現，藉以分析Rta轉活化之病毒基因。微陣列分析所得之結果，並經由北方墨漬法、轉錄聚合酶連鎖反應及報導基因表現分析得到證實。本論文分析並整理之資料，對於EB病毒溶裂期基因表現之調控，提供更進一步的瞭解。 根據微陣列之結果，EB病毒複製相關酵素分為兩大表現群，推測其分別參與了EB病毒早期以θ形式，及晚期以Rolling circle形式的複製過程。其中在第二表現群的基因中，BKRF3已被證明在共同轉染的實驗中，能促進帶有OriLyt片段質體的複製。然而對於BKRF3表現之調控及生物功能仍不清楚，經由對BKRF3胺基酸之分析，推測具有尿嘧啶糖苷酶之活性。尿嘧啶糖苷酶參與在DNA修復系統，負責移除DNA上不該存在之尿嘧啶，以確保DNA的正確性。在本論文中，由大腸桿菌所表現並純化之His-BKRF3的重組蛋白的生化特性和大腸桿菌及人類細胞表現的尿嘧啶糖苷酶均很相似。例如，His-BKRF3自單股DNA中移除尿嘧啶之效率高於自雙股DNA之移除，且噬菌體表現的尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白(Ugi)能抑制BKRF3具有的尿嘧啶糖苷酶活性。另外在Rifampicin及Nalidixic acid的抗藥性突變分析中，BKRF3的表現能使得失去尿嘧啶糖苷酶基因的大腸桿菌突變種，恢復成具有野生型大腸桿菌之表現型。本論文也利用專一性偵測BKRF3的抗體，探討EB病毒在上皮細胞及B細胞活化進入溶裂期時，BKRF3所表現的時間點，及在宿主細胞內所表現的位置。其中BKRF3的表現，主要是透過轉活化因子Rta的調控，同時我們也發現，利用干擾性RNA抑制BKRF3蛋白的表現時，EB病毒DNA的合成受到一些的限制。當細胞或病毒所表現的尿嘧啶糖苷酶的活性被Ugi抑制時，或者細胞之UNG2的表現受到干擾性RNA抑制時，均嚴重影響EB病毒DNA的複製。經由上述的實驗結果，本論文證明了BKRF3不論在試管內或體內皆具有尿嘧啶糖苷酶的活性，並推測尿嘧啶糖苷酶可藉由參與DNA複製及修復機制，進而促進病毒DNA的合成。
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梨形鞭毛蟲為寄生在人體小腸中之致病性原蟲。目前研究梨形鞭毛蟲基因功能常使用穩定轉染系統，此系統需使用G418和嘌呤黴素作為篩選蟲株的藥劑，但是目前這些藥劑對梨形鞭毛蟲基因表現的影響並不清楚。此研究中，我們發現G418、嘌呤黴素或穩定轉染系統本身能增加cwp1、cwp2和gmyb2基因表現約1.3-6倍。我進一步利用nuclear run on assay發現此cwp1、cwp2和gmyb2基因RNA增加的現象，有一部分來自轉錄起始速率增加。當梨形鞭毛蟲處於囊體化環境下，G418或嘌呤黴素卻少許抑制或不影響cwp1和cwp2的表現。此外，穩定轉染細胞株會促進囊體的形成，約1.6∼2.1倍，可能是由於這些細胞株之cwp基因表現較高所致。但是G418或嘌呤黴素卻會降低囊體的形成，可能是由於這些藥物抑制梨形鞭毛蟲的生長速度。由此研究結果能了解穩定轉染系統會增加梨形鞭毛蟲囊體化基因表現及囊體形成。 由於此蟲需經過囊體化形成囊體才能存活於外界，所以囊體化為此蟲重要的調控機制。但是目前對囊體化相關基因調控並不清楚，我發現當大量表現滋養體時期中的gmyb2基因時，能使內生性cwp1和cwp2基因表現量上升並且使細胞株囊體形成效率變好。利用基因抑制法降解gmyb2 RNA能使內生性cwp1和cwp2基因表現量下降，並且使細胞株囊體形成效率變差，這些結果顯示gMyb2可能是重要的轉錄活化子，可以促使cwp基因的表現和囊體的形成。我更進一步觀察在cwp3基因coding region的gMyb2結合序列的角色，結果發現改變gMyb2結合序列中的鹼基，並不影響cwp3基因表現。若改變cwp3基因的coding region中之gMyb2結合序列所轉譯出的胺基酸序列，會造成cwp3基因表現下降。另外，我發現大量表現cwp3基因時可增加囊體形成。我的研究結果提供了梨形鞭毛蟲生活史的轉錄調控更深入的了解。
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BCL10與MALT1均是淋巴細胞抗原受體BCR/TCR至NF-κB活化過程中重要的訊息傳遞分子，過去研究發現NF-κB活化作用經常伴隨BCL10磷酸化修飾共同出現。然而，BCL10磷酸化具有何種生理意義目前仍不清楚。因此，我們期望藉由找出BCL10磷酸化位置，以對於BCL10磷酸化有所瞭解。此外，共同表現MALT1與BCL10的研究中，我們發現BCL10會被誘導切割。因此，希望找出BCL10受MALT1誘導之切割位。 BCL10具有233個胺基酸，包含N端CARD domain，可藉此與其他具有CARD domain的分子結合；C端Serine/Threonine rich domain，根據過去研究推測，可能是磷酸化的主要標的區域。大量表現BCL10時會發生磷酸化現象、NF-κB活化，且在顯微鏡下可見絲狀構造產生。當BCL10第41個高度保留之胺基酸Leucine突變，則CARD domain失去與其他分子結合的能力，且磷酸化現象消失、蛋白質均勻分佈於細胞質和細胞核，NF-κB不活化。N端(1~114 a.a.)或C端(114~233 a.a.) BCL10均無高度磷酸化現象，顯示BCL10磷酸化需同時具有CARD及Serine/Threonine rich domain。然而，CARD domain正常之N端BCL10仍可活化NF-κB，並能產生絲狀構造，顯示BCL10磷酸化並非活化NF-κB的必要因素。共同轉染BCL10與可抑制NF-κB活化的Dominant Negative-IκB質體至293T細胞，發現BCL10磷酸化程度減弱。表示BCL10磷酸化雖不是NF-κB活化的必要因素，但會受到NF-κB活化作用影響。針對BCL10可能磷酸化區域進行刪除或點突變作用，構築BCL10 deletion constructs D1(△134~150 a.a.)、D2(△185 a.a.)、D3(△218~231 a.a.)、D4(△134~150 & 218~231 a.a.)，及site mutated BCL10 constructs S7A、S48A、S60,61A、S85A。這些表現質體仍具有活化NF-κB、產生絲狀構造及磷酸化修飾的能力，只是不同mutants之間磷酸化程度略有差異，由上述結果推測BCL10可能具有多重磷酸化修飾。此外，我們發現BCL10表現量越少則磷酸化現象越不明顯。 以TPA/ionomycin刺激Jurkat細胞，內生性BCL10似有被切割現象。據報導MALT1有paracaspase特性且能與BCL10產生結合作用。為檢測MALT1是否具有誘導BCL10被切割的可能性，我們將不同的BCL10 constructs與MALT1共同表現，以西方墨點法分析切割情形。結果顯示除了D3和D4無法被誘導切割之外，其餘mutant BCL10均可被誘導切割，推測D3與D4共同被刪除之區域(218~231 a.a.)具有可能的MALT1誘導切割位。進一步針對此區域構築BCL10 deletion constructs C1 (△218~224 a.a.)、C2 (△219~225 a.a.)、C3 (△220~226 a.a.)、C4 (△221~227 a.a.)、C5 (△222~228 a.a.)、C6 (△223~229 a.a.)、C7 (△224~230 a.a.)、C8 (△225~231 a.a.)來研究切割位置。結果僅C1可被誘導切割，顯示BCL10 Leucine 225可能是MALT1誘導切割位。而由誘導切割後之產物分子量大於原本BCL10分子量的現象看來，在切割產物上似乎具有修飾作用，經由去磷酸酵素實驗證實是磷酸化修飾的結果。由於切割作用與BCL10磷酸化形式比例減少的現象常伴隨出現，並且BCL10L41RGFP與C’BCL10GFP均無法被有效切割，表示磷酸化的BCL10才是較好的MALT1誘導切割受質。 MALT1具有一個Death Domain、兩個Immunoglobulin like domain及caspase like domain (CLD)。我們利用五種MALT1表現質體： MALT1△N (127~824 a.a.)、MALT1 1~548 a.a.、MALT1△498~548 a.a.、MALT1△199~498 a.a. 與IAP2-MALT1 (MALT lymphoma基因轉位之融合蛋白質)檢視哪些區域負責於誘導切割作用發生。結果顯示僅MALT1△N與IAP2-MALT1保有誘導切割能力，MALT1 1~548 a.a.、MALT1△498~548 a.a.以及MALT1△199~498 a.a.則無法誘導切割。表示MALT1需同時具有CLD與其C-端區域才能執行誘導切割作用。
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當今全世界約有三億五千萬人患有慢性B型肝炎，由慢性B型肝炎所引發之肝硬化及肝癌等相關疾病，每年造成的全球死亡人數高達一百多萬，嚴重危害人類的健康。目前治療慢性B型肝炎藥物有免疫調節劑及抗病毒藥物兩類，它們在臨床上雖皆具一定療效，但前者會爲病患帶來諸多不適的副作用，而後者則面臨著引起病毒抗藥性的挑戰。因此，研發對抗B型肝炎病毒的新型藥物，遂成為刻不容緩的研究課題。 基於與抗原間的結合極具專一性及親和力，單株抗體素被廣泛應用於疾病的診斷，近年來更逐漸成為新藥研發的主流之一。過去，抗體藥物的研發方向多著重於調控細胞外蛋白質之生物功能，而涵蓋多數致病因子的細胞內蛋白質反被忽略。隨著抗體工程技術的進展，一個原應分泌至細胞外的抗體分子，經過適當修飾後，可以停留在細胞內部與細胞內抗原結合，進而干擾抗原之正常生理作用。有鑑於此，本研究欲探討此類細胞內抗體（intrabody）作為治療慢性B型肝炎之藥物的可行性。在諸多B型肝炎病毒之病毒蛋白中，大型表面蛋白（LHBsAg）對病毒之複製有舉足輕重的影響，故本研究選其作為細胞內抗體之抗原標的。 過去，我們已將一個能有效辨認大型表面蛋白preS1區域之單株抗體—MA18/7—轉成單鏈抗體型態（single-chain Fv）。本研究中，我們證實該表現質體轉染進入細胞後確能順利表現出MA18/7scFv蛋白質，以作為細胞內抗體。接著，我們分別在兩種B型肝炎病毒體外複製之模式系統中檢驗MA18/7細胞內抗體對病毒複製的影響：一、將病毒基因組DNA與細胞內抗體表現質體DNA共同轉染入肝細胞株；二、以腺病毒載體攜帶病毒基因組DNA進入已穩定表現細胞內抗體之肝細胞株。初步結果發現：在系統一中，MA18/7細胞內抗體對B型肝炎病毒表面蛋白（HBsAg）的分泌量無顯著影響。至於在系統二中，MA18/7細胞內抗體卻能明顯抑制肝細胞分泌B型肝炎病毒大型表面蛋白，然而B型肝炎病毒DNA的總釋放量，以及子代病毒外套膜之存在與否皆不因MA18/7細胞內抗體有所改變。造成此間差異之原因究竟為何，尚需後續實驗加以驗證。 此外，本研究亦計畫修飾MA18/7細胞內抗體之蛋白組成，使之專一地分佈於細胞內特定胞器中，以期提高其尋找目標抗原的成功率，進而加強其抑制能力。目前我們已完成了分布在細胞核或細胞質中的兩種MA18/7細胞內抗體的構築，並藉由免疫螢光染色法證實其分佈位置確如預期。 最後，本研究更進一步探討前述抑制作用之機制。我們分別利用螢光蛋白標籤以及免疫螢光染色法兩種方法證實，MA18/7細胞內抗體與其目標抗原—大型表面蛋白—在細胞內的分佈位置相疊合，初步證明兩者之間可能存有交互作用。 綜合而言，本研究初步發現，抗B型肝炎病毒大型表面蛋白之MA18/7細胞內抗體在蛋白質層次上對病毒有顯著抑制效果。另一方面，雖然抗體與抗原間之交互作用已被證實，惟其詳盡機制尚待日後研究方能解答。不論答案為何，以細胞內抗體作為治療慢性B型肝炎藥物確為值得發展的方向。
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最近的研究發現，哺乳動物具有兩個 DNA 拓樸酶III之同功酶 － TOP3α 和 TOP3β ，致使科學家們感興趣於剖析兩個同功酶各自的酵素活性及功能。在本篇研究中，我們利用酵母菌雙雜交以及 RNA 干擾壓制細胞內基因表現的技術，找出和 hTOP3 同功酶有交互作用的蛋白質候選者且推論 hTOP3 同功酶在細胞內可能的功能；且分別勾勒兩個 hTOP3 同功酶的蛋白質交互作用圖譜亦應可使我們區分兩者分別的細胞功能。依據實驗結果，我們發現與 hTOP3α 同功酶有交互作用的蛋白質候選者在數量上和種類上都跟與 hTOP3β 同功酶有交互作用的蛋白質候選者不同。我們也檢測了兩個 hTOP3 同功酶的基因表現程度，結果顯示： hTOP3α基因表現在 G1/S 時期達到最高，而 hTOP3β則是在 G2/M 時期為高峰；此外， hTOP3α在腫瘤組織的基因表達程度較同來源的正常組織低。令人驚訝的，我們發現了 hTOP3α在細胞週期檢控點的調控上扮演角色，而這樣的調控很有可能是經由轉錄機制調控細胞週期檢控點相關蛋白的表現量。總括以上，我們的實驗結果支持了兩個 hTOP3 同功酶有不同功能的假設，且 hTOP3α在 S 時期檢控點上扮演重要的角色。除此之外，由於 hTOP3α在腫瘤組織的基因表達較低且 hTOP3α在細胞週期檢控點的調控上扮演角色，因此我們推測 hTOP3α可能作為一腫瘤抑制因子。兩個 hTOP3 同功酶在細胞瘤化上是否扮演不同的角色亦在本篇論文中被討論。
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C 型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV) 為非 A 非 B 型肝炎的主要致病原，與慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌的形成密切相關。HCV 為一正向單股 RNA 病毒，基因體全長約 9600 個核苷酸，包含 5' 端非轉譯區 (noncoding region, NCR)、可轉譯出約 3010 個胺基酸多蛋白質之開放編閱架構、以及 3' 端非轉譯區，其中 5' 端非轉譯區在各個不同病毒分離株之間具有高度保守性。HCV 的轉譯起始是由 internal ribosome entry site (IRES) 所調控，其範圍幾乎涵蓋整個 5' 端非轉譯區，並延伸至轉譯起始點後核心蛋白質的前 10 個胺基酸相對序列。IRES 可形成穩定的二級和三級結構，在功能上取代許多轉譯起始因子，能直接與 40S 核醣體次單元、真核細胞轉譯起始因子 Ⅲ (eukaryotic translation initiation factor 3, eIF3)，以及其他許多細胞因子進行交互作用。然而，目前對於 HCV 內部起始轉譯的詳細機制仍不完全清楚。 真核細胞轉譯起始因子 Ⅲ 為一 800 kDa 之巨大複合體，包含至少 13 個不同的次單元，其中次單元 p170、p116、p66 及 p47會與 C 型肝炎病毒的 IRES 有專一性的結合。根據二級結構預測，p116 在靠近氨基端 (a.a. 185-268) 具有一個可能的 RNA 結合區 (RNA recognition motif, RRM)，可和HCV IRES 結合。過去的研究顯示 p116-RRM 與IRES domain Ⅲ (nt 134-314) 之間有交互作用；但亦有研究指出 p116 會與 domain Ⅱ (nt 44-118) 結合。根據本實驗室先前的研究結果，顯示 domain Ⅱ 的頂端 (nt 65-102) 與domain Ⅲ 中的 abcd subdomains (nt 131-278) 對於 p116-RRM 有相類似的結合能力。因此，p116 在 HCV IRES上的實際結合區域仍有待確認。本研究主要著重在探討 p116-RRM 與 HCV 5' 端 RNA 的結合情形︰藉著將 C型肝炎病毒 5' 端非轉譯區及 core protein coding region 前段序列分割成較小片段，分別與純化的 p116-RRM 進行 filter binding、gel mobility shift、以及UV-crosslinking 等結合測試，試圖找出 p116 在 IRES 上最小的結合區域。結果發現，包含 domain Ⅲab 的 NCR123-232 RNA 即足以與p116-RRM 有很強之結合能力，顯示 p116 與 IRES 的接合位置應位在此區域內。此外，在核心蛋白質轉譯區也偵測到與 p116-RRM 結合的能力。在活體外轉譯實驗中加入涵蓋不同 domain 之 IRES 片段，會對 HCV IRES 所引導之核心蛋白質的合成造成程度不等的抑制效果。對於與 p116-RRM 有較強結合的 RNA 片段，對 IRES 引導的活體外轉譯也具有較強的抑制能力，顯示 C 型肝炎病毒 IRES 與 eIF3 次單元 p116 的結合對於此病毒的轉譯起始是重要的。
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C型肝炎病毒 (Hepatitis C Virus，HCV) 是造成非A非B型肝炎的主要致病因子，屬於黃病毒科 (Flaviviridae)，具外套膜，為一單股正向RNA病毒。根據本實驗室對HCV subgenomic replicon細胞株和其母細胞株Huh7進行比較之cDNA microarray分析，以及其他實驗室比較肝癌病人癌細胞和正常細胞基因表現差異的研究結果，顯示在HCV感染時一些細胞基因的表現可能會受到調控，例如：SAA、DUSP1、GRB14、VEGF-A、integrin、FASTK、H-ras、HRG、SULT2A1等。為確認此調節作用並釐清造成此現象的病毒蛋白質，本研究利用DNA轉染的方式，分別將HCV非結構性蛋白質之表現質體送至培養細胞中表現，並以即時定量聚合酵素鏈鎖反應 (real-time quantitative PCR) 分析不同病毒蛋白質對於細胞基因表現的影響。結果發現NS4B會造成FASTK與HRG表現量的下降。NS4B為病毒非結構性蛋白質之一，分子量 27 kD，具疏水性，其在病毒生活史的功能目前尚不清楚，但有研究指出NS4B對於NS5A的磷酸化，和病毒RNA複製是重要的；另外NS4B具有GTPase活性，有抑制宿主細胞轉譯的能力，也會與Ha-ras基因共同造成細胞轉型，可能在HCV的致病機轉中扮演重要角色。已知FASTK為一survival protein，因此嘗試分析NS4B對細胞存活的影響，以西方墨點法偵測細胞中caspase3的含量，發現在受到anti-Fas抗體刺激誘導細胞凋亡的293細胞中，NS4B會使細胞凋亡的情形更為嚴重。不過在nucleosome ELISA assay和flow cytometry的分析上，NS4B對細胞凋亡的影響則不明顯。細胞凋亡為幫助病毒顆粒散播的方式之一，NS4B是否藉由細胞凋亡調節C型肝炎病毒的傳播過程，則需進ㄧ步的釐清。另一方面，HRG為一含量豐富的血漿蛋白質，主要在肝臟細胞中表現，本研究發現在表現NS4B的Huh7細胞中，HRG的mRNA量和蛋白質量均有下降的情形。將NS4B表現質體與帶有長度約450 bp的HRG promoter之luciferase reporter進行共同轉染時，發現NS4B並不會影響luciferase的活性，顯示NS4B不會藉由此段HRG promoter調控HRG mRNA的合成。其調控機制仍有待進一步的研究。
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BGLF4是EB病毒在進入溶裂期時表現的serine/threonine蛋白激酶，目前已知BGLF4的受質包含有：BMRF1、Zta、EBNA-LP、EF-1δ等。已知BGLF4存在於病毒DNA複製區以及成熟病毒顆粒中，推測BGLF4在病毒的複製過程以及殼體化（encapsidation）中扮演重要的角色。我們實驗室先前利用5’RACE在BGLF4開放譯讀架上游201 bp和255 bp的位置找到其轉錄起始位點。而在本篇論文中除了先前已知的轉錄起始點外，我們在BGLF4開放譯讀架上游472 bp位置上發現另一轉錄起始點。而對於BGLF4長片段的5’端未轉譯區，我們進一步的探討是否具有內部核糖體進入位點（Internal Ribosome Entry Site , IRES）的調控機制。藉由雙譯讀架（bicistronic reporter）DNA以及RNA短暫轉染至293T細胞中證明BGLF4的5’端未轉譯區含有IRES的活性。另外本篇論文中發現BGLF4基因的IRES活性會受到內質網壓力(ER Stress)反應刺激增加，同時我們在EBV positive Akata細胞中觀察到EB病毒的再活化（reactivation）會使細胞產生ER Stress。而在NA細胞中，當利用Rta刺激EB病毒進入溶裂期後BGLF4基因IRES活性會因為EB病毒進入溶裂期而增加。表示BGLF4 5’端未轉譯區上的IRES對於EB病毒在進入溶裂期時能夠幫助BGLF4蛋白激酶的表現。
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