國立臺灣大學微生物學研究所學位論文/Graduate Institute of Microbiology
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流行性感冒病毒屬於正黏液科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒，大小約為80~120nm，具有八段負股的RNA，分別是-PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，其中PB2、PB1、PA、NP則是參與流感病毒複製的主要蛋白質。而流感病毒不同於其他RNA病毒的地方，在於流感病毒感染宿主細胞後會進入細胞核中進行複製，而一般RNA病毒則是在細胞質中複製。 本文的研究著重於在流行性感冒病毒在細胞內的複製機轉，以及宿主細胞因子對流感病毒的複製是否會造成影響。因為已經有許多研究指出，宿主細胞蛋白質會跟病毒蛋白質結合並影響病毒的複製過程。由於PA的功能目前尚未被完整定義，為了找出可以跟PA有交互作用的細胞蛋白質，我們初步的實驗是利用酵母菌雙雜交的方式，發現參與在流感病毒複製的PA subunit會跟HAX1、HNRPM、hCLE、SIVA、FTH1、PRDX1、MMAB等七個基因所encode的蛋白質進行交互作用。為了觀察HAX1與HNRPM是否真正參與在病毒的複製過程中，我們利用lenitivirus包裹shRNA 感染目標細胞，藉此抑制細胞中HAX1或HNRPM基因mRNA的表現。在HAX1或HNRPM基因的表現即使被抑制卻不影響細胞生長的前提下，接著以流感病毒WSN33病毒株感染基因表現被抑制的細胞株，觀察是否會影響A型流感病毒在細胞內的複製能力。 在H1299_shHAX1細胞中，可以發現HAX1基因表現被抑制之後，流感病毒vRNA的複製有稍微受到影響，但不影響病毒mRNA的合成。而在NPCTW04_HNRPM細胞中，則發現抑制HNRPM之後，病毒的vRNA與mRNA合成都降低，表示病毒的複製及轉錄能力均受到影響。因此推測，這兩個基因有可能藉著和PA之間的交互作用，來影響病毒的複製過程。但PA在人類細胞中是否真的會與HAX1或HNRPM結合，以及抑制的機轉為何都還需要再研究。
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鎘，具有毒性及致癌性，是一種有硫化巨分子能力的過渡金屬。然而目前為止對於其毒性及致癌性的詳細機轉並無一致性的報導，因此我們試圖利用組織培養系統來探討鎘所造成的毒性之可能機制。有趣的是，我們發現在暴露於鎘之後，DNA拓樸異構酶的蛋白質表現量有減少的跡象，意味著鎘或許可以活化細胞中蛋白質降解系統(proteolytic systems)。此外，我們利用許多不同的蛋白酶抑制劑，來探討在鎘所誘發的蛋白質降解及細胞毒性中各種蛋白質降解酶可能扮演的角色。初步的研究結果指出鎘所誘發的蛋白質降解可能與26S proteasome、metalloproteases、serine proteases、cysteine proteases以及活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)等有關。另外，我們亦發現鎘會造成DNA斷裂且隨著處理濃度的增加而DNA斷裂的情形會更為嚴重；同時亦證實第二型拓樸異構酶可能參與在其中，並且反映於鎘所造成之細胞毒性。綜合上述結果，我們證實並討論鎘誘發之蛋白質降解與第二型拓樸異構酶造成DNA斷裂以及活性氧分子對於鎘所引發的細胞毒性之可能重要性。
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腫瘤易感基因101 (Tumor susceptibility gene 101，TSG101)，首先利用老鼠纖維母細胞 (fibroblast) 進行heterozygous knockout strategy中所篩選出來，如今被認為反而與細胞癌化有著顯著的關連性。先前研究發現TSG101為細胞生長所必需，並且也在某些惡性腫瘤細胞當中可見到TSG101表現量有上升之情況。除此之外，TSG101在內體運輸、細胞質分裂、調控細胞內基因表現和病毒出芽均扮演重要的角色。在惡性腫瘤細胞當中可發現tsg101基因並不會發生基因序列上之突變，但卻會因為選擇性剪接產生不同之mRNA isoform並且更進一步也証實某些特定的isoform與腫瘤的發展有著極重要的關連性。根據本實驗室先前的研究發現，在鼻咽癌組織中可偵測到一特定選擇性剪接之產物TSGΔ154-1054，但在非惡性細胞之淋巴增生組織則不會偵測到，另外也發現在表現TSGΔ154-1054之鼻咽癌組織當中TSG101表現量也有上升的情形，因此本篇研究主要著重於TSGΔ154-1054之表現與TSG101表現之關係。利用短期轉染實驗，可見TSGΔ154-1054影響TSG101表現是透過轉譯層次而非轉錄層次。在pulse-chase和cycloheximide-chase實驗中證實TSG101表現量上升並非增加TSG101之新生合成而是延長其半衰期，除此之外，將TSGΔ154-1054之起始密碼ATG置換成AAA後，TSGΔ154-1054無法轉譯成蛋白質其延長TSG101半衰期之能力也隨之失去，証實了TSGΔ154-1054影響了TSG101表現是透過其蛋白質產物。進一步分析，TSGΔ154-1054可藉由與TSG101競爭和Tal之結合，進而防止了TSG101降解，而延長了TSG101之半衰期。最後亦證實了TSGΔ154-1054可以藉由增加TSG101的表現量促進細胞的增生和腫瘤的生成。
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Epstein-Barr virus (EBV)為感染性單核球增多症 (infectious mononucleosis)與口黏膜白斑症 (oral hairy leukoplakia)的病原，並且發現與許多人類癌症，例如巴氏淋巴癌 (Burkitt's lymphoma)、何杰金氏淋巴癌 (Hodgin's lymphoma)及鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma, NPC)等有關。鼻咽癌為發源於鼻咽部上皮細胞的腫瘤，以細胞遺傳學方法分析發現鼻咽癌細胞有基因體不穩定現象，而基因體不穩定與癌症的發生過程息息相關。在NPC活組織切片檢體中發現的EBV相關基因產物主要為潛伏期表現的基因產物，但在這些檢體中亦發現有EBV溶裂期基因的產物。此外，NPC病人的血清中能偵測到較高效價的抗EBV溶裂期基因產物抗體，這些發現提供了EBV溶裂期的進行與NPC發生有關的線索。依據我們實驗室之前的研究，EBV特早期基因BRLF1基因產物Rta會干擾細胞周期行進並造成基因體不穩定，在這篇研究中，更進一步發現Rta可以透過ERK (extracellular signal-regulated kinase)訊息傳遞路徑造成微核生成。細胞經MEK1/2抑制劑U0126處理即能抑制微核生成。同時亦發現表現Rta的細胞中ERK活化程度較高，且細胞中執行絲裂期檢查點的Aurora B kinase活性較低，造成細胞絲裂期較早結束。
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MicroRNAs 是具有19至25個核苷酸的小片段RNA，它主要會辨認到 mRNA 的3端未轉譯區，形成不完全的配對而抑制基因的蛋白質表現。它在細胞裡扮演著很重要的功能，例如發育的調控，還有細胞的脂肪代謝、增生、分化及細胞的死亡和抗病毒機制等。另外，miRNA 的不正常表現可能和疾病的發生有相關，已有文獻指出 miRNA 在腫瘤細胞中可能扮演著致癌基因或是腫瘤抑制基因的角色，因此分析在腫瘤的形成過程中，有哪些的miRNA 有不正常的表現情形，可以幫助我們了解腫瘤的致病機轉。 我們根據 (1) 之前在文獻中利用microarray分析所指出在HCC中有顯著差異的miRNAs 或是可能有性別表現差異的 miRNAs；(2)經由網站預測出與肝癌形成可能相關基因之miRNAs；(3) 在肝臟細胞內有高度表現量的 miRNA；(4) 和位在第四對染色體上於肝癌好發易斷裂區的miRNAs，經由此種方式，我們共選擇了29 個miRNAs來進行本論文針對miRNA於HCC癌化過程中是否產生變化之分析。為探討miRNA之變化是否和病毒感染因子以及男女性別差異之特性相關，我們分析之臨床檢體主要包含了不同病毒感染因子相關之男女配對之tumor 及其non-tumor肝臟組織，並以配對 FNH (Focal nodular hyperplasia，肝臟結節性增生)肝臟組織當作對照組。我們使用定量real-time PCR 的方式去偵測肝組織內的 miRNA 的表現量，以t-test 分析並把p-value 小於0.05視為有顯著的差異。 在我們的研究中，我們發現有好幾個 miRNAs 在 HCC 內的表現量有明顯的改變。另外，我們也發現有些 miRNAs 在依病毒或是性別分群上有表現量的差異，但仍需要進一步證明。為了指出 miRNAs 在癌化過程中的作用機制，我們選擇了2個 miRNAs : mir-130a 和 mir-493-5p 做為進一步實驗。 因為我們發現mir-130a 和 mir-493-5p 在 HCC 的表現量是有顯著下降，且mir-130a 和 mir-493-5p是被預測會去調控 AR 的miRNAs，因此我們進行實驗想去探討mir-130a 或mir-493-5p 是否能辨認到 AR 並調控其表現。 我們所使用的方法是把具有AR的3端未轉譯區接在 pGL3-promoter 之後，轉染入人類肝癌細胞株，再使用感染 lentivirus 的方式去大量表現 mir-130a 或是 mir-493-5p。為了證實這辨識的特異性，我們把 mir-130a 和 mir-493-5p 所辨識的 seed site 做了4個核苷酸的突變。雖然在初步的實驗中，可以發現這兩個 miRNA 可以造成具有AR-3端未轉譯區的reporter 活性下降，但是這兩個 miRNAs 對於內生性 AR 的蛋白質表現量抑制的程度並不明顯。 結論，在我們的研究中指出有幾個miRNAs 在HCC 的表現量有顯著的差異，但它們在癌化過程中所扮演的角色，則需要更進一步的實驗去證明。
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肝癌(Hepatocellular cacinoma)為台灣最常見的惡性腫瘤，在造成肝癌的危險因子中又以B型肝炎病毒(HBV)的感染最為重要，但HBV導致癌症發生過程可能的分子機轉到目前仍不清楚，而HBV引起的肝癌病例有個顯著的特徵是在性別上的偏好性，男性的罹病率相較於女性約高三~七倍左右。本實驗室先前研究中就已發現HBx具有正向調控男性荷爾蒙受體(androgen receptor)對帶有ARE(androgen-response element)基因的轉錄活性，而這可能是HBV相關肝癌好發於男性的可能機制。 在探討HBx促進男性荷爾蒙受體轉錄活化分子機制的研究中，我們著重在調控AR轉錄活性重要的兩步驟：AR N/C interaction及AR NTD活性。我們發現HBx可透過這兩個步驟來促進AR轉錄活性，分別藉由調控細胞中c-Src與GSK-3β的活性，我們首先證實了c-Src kinase活性在HBx促進AR NTD活性過程中扮演重要的角色，所以本研究接著想進一步探討HBx造成AR N/C interaction增加的機制為何。過去分別有文獻指出HBx可活化Erk kinase使GSK-3β活性受到抑制，且於prostate cancer cell中GSK-3β具有抑制AR N/C interaction的功能，因此我們假設於肝細胞中HBx或許可透過抑制GSK-3β的活性來造成AR N/C interaction的上升。這部分的研究成果大致簡述如下： (1)我們利用mammalian two-hybrid assay的方法證實了GSK-3β確實於肝細胞中在AR N/C interaction調控中扮演負調控的角色。 (2)在HepG2細胞株中，HBx的表現並不足以抑制GSK-3β，必須在AR與HBx的協同作用下，經AR ligand刺激下GSK-3β活性才受到抑制，GSK-3β活性遭抑制後AR N/C interaction就會增加，進而轉錄活化promoter帶有ARE的基因。 (3)針對GSK-3β調控的下游分子中最關鍵的β-catenin，我們進一步探討GSK-3β調控AR N/C interaction機制裡是否β-catenin有參與，實驗結果說明了GSK-3β並非藉由抑制β-catenin的活性來調控AR N/C interaction。 (4)最後，我們在分別證實了AR N/C interaction與AR NTD活性各自有GSK-3β與c-Src調控之後，想釐清這兩個步驟影響AR轉錄活性的程度，結果發現到HBx活化AR的轉錄活性主要就是藉由AR N/C interaction及AR NTD活性兩步驟加以調控，因此確立了GSK-3β與c-Src在HBx活化AR轉錄活性過程中的重要樞紐性質。 另一方面，被認為與HCC形成有關的抑癌基因p53，過去也有研究指出AR具有負調控AR N/C interaction的功能，所以我們假設p53在HBx促進AR轉錄活性增加的過程中，可能也是重要的負調控者。關於這部份的研究成果則簡述如下： (1) p53可透過抑制AR N/C interaction及AR NTD活性在HBx促進AR轉錄活性增加過程中扮演負調控者的角色。 (2) R249S突變的p53會失去抑制AR轉錄活性的功能。 (3)我們證實了GSK-3β的活性對於p53調控AR N/C interaction是重要的，但p53抑制AR轉錄活性不僅只倚賴GSK-3β的調控路徑。 在本研究中，我們證實了AR N/C interaction與AR NTD活性兩步驟是主要決定HBx 促進AR轉錄活性的關鍵，也針對AR N/C interaction的兩個負調控者GSK-3β及p53做了較深入的探討，希望藉由對HBx促進AR轉錄活化的負調控機制的了解，知曉如何阻礙細胞癌化的過程，而本研究結果可做為將來HBV相關男性肝癌治療上的參考。
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肝癌為全球最常見的惡性腫瘤，B型肝炎病毒(HBV)感染為引發肝癌的危險因子之一。台灣為B型肝炎病毒(HBV)感染高流行區，HBV相關之肝癌，有好發於男性之特性，但HBV如何影響肝癌發展及造成性別上的差異，其機制尚未清楚。本實驗室先前研究發現，HBV所表現的病毒蛋白HBx可在男性荷爾蒙的存在下正向調控男性荷爾蒙受體(androgen receptor, AR)的轉錄能力，為HBV相關肝癌好發於男性提供一可能機制。有鑑於在前列腺癌研究中，發現許多AR 協同作用蛋白(co-regulator)可藉由影響AR的轉錄活性促進癌症的發展。為了瞭解HBx如何影響AR轉錄活性，本研究著眼於探討HBx是否可能藉由影響AR的co-regulator而增強AR轉錄活性。研究策略即尋找HBx存在下，與AR結合發生改變之特定蛋白質，純化之並利用蛋白質譜(Mass spectrophotometry) 方式決定其身份，並進一步探討此特定蛋白於HBx促進AR轉錄活性過程中所扮演之角色進行功能性分析。 本實驗所使用的蛋白純化方法為Tandem Affinity Purification (TAP)系統。實驗設計為製備TAP-AR融合質體，於Huh-7 hepatoma細胞株細胞中表現，再利用兩步驟的樹脂純化AR及其結合蛋白。此方法的優點為可使蛋白複合體在接近生理狀態下，被完整的分離出來，且無損蛋白的活性。首先製備pN(C)TAP-AR融合質體，將質體送入細胞中表現，觀察AR的蛋白質表現及確定HBx增強AR的活性之效果。實驗結果發現，HBx 增強NTAP-AR之轉錄活性相較於CTAP-AR 顯著許多，因此決定使用NTAP-AR進行後續純化實驗。將NTAP-AR送入Huh-7細胞後收細胞進行純化，發現HBV存在下，有幾條蛋白質band與單獨表現AR時得到的純化蛋白質結果不同，其中尤以大於170KD之蛋白質band表現差異最大。經蛋白質譜結果得知其為Acetyl-CoA carboxylase-alpha(ACCα)蛋白，為一參與脂肪酸合成過程之重要酵素。以ACCα專一性抗體分析TAP純化及共同免疫沉澱(co-immunoprecipitation)分析，證實ACCα蛋白的確會與AR結合，同時也發現ACCa與AR的交互作用可受到HBx影響。 進一步探討ACCα與AR之結合是否影響了AR的轉錄活性或蛋白表現之研究，利用核質分離方式發現兩者的交互作用位置主要於細胞質中，推測ACCα不會直接影響AR的轉錄活性。接著利用lenti-si-ACCα降低Huh-7細胞中ACCα蛋白表現量，以探討ACCα對HBV活化AR轉錄活性的影響。結果發現降低ACCα表現量，AR蛋白量也隨之下降，利用定量PCR(quantitative PCR)證實此調控不在RNA層面。接著，以蛋白水解酶(proteasome)抑制劑(MG132)發現此調控可影響proteasome的作用。 以上研究結果發現了一個新的AR結合蛋白ACCα。ACCα與AR的交互作用可受HBx調控且影響了AR蛋白表現量，為HBx促進AR轉錄活性過程提出另一可能調控機制。由於AR訊息傳遞路徑之過度活化為男性肝癌形成之一重要機制，此研究結果因此提出可針對抑制ACCα表現作為為來治療男性肝癌之可能性
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Fas-associated phosphatase-1 (FAP-1)基因屬於protein tyrosine phosphatase的一員。根據本實驗室先前之位置選殖研究指出，FAP-1有可能是位於染色體4q21-23上之一可能參與肝癌之腫瘤抑制基因，但其參與肝癌過程真正的功能角色仍未釐清。 因為FAP-1結構中有很多protein-protein interacting domain，包括KIND domain、FERM domain、5個PDZ domain，於細胞中為一會與許多蛋白質交互作用之scaffold 蛋白。要了解FAP-1在肝臟疾病扮演的功能性角色，我們的策略是在肝細胞中尋找會與FAP-1有交互作用的蛋白質。本實驗室先前利用yeast two hybrid system在liver cDNA library以FAP-1的N’端為餌，找到一個新的FAP-1 associated protein，Keratin 18 (K18)，目前已知K18會與Keratin 8 (K8)形成非共價結合的heterodimer，共同組成肝細胞中主要的intermediate filaments (IFs)。
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摘要 Survivin是屬於IAP (inhibitor of apoptosis protein) 蛋白質家族的一員，此類蛋白質家族可以藉著直接結合Caspase而抑制其活性，藉此抑制細胞凋亡 (apoptosis) 的進行。近年來諸多研究指出Survivin也可以幫助細胞週期 (cell cycle) 的進行與染色體的分裂。除此之外，Survivin已經被認為是非常重要的腫瘤標誌物 (tumor marker)，因其高度表現於快速增生的細胞，而不表現在分化完全的成人細胞，甚至幾乎所有的癌細胞都可以偵測到Survivin大量的表現。在先前實驗室研究中觀察到與EB病毒高度相關的鼻咽癌 (NPC) 和移植後淋巴增殖性疾病 (PTLD) 的組織切片，Survivin均有大量表現的現象，同樣在EB病毒感染B細胞後也能觀察到Survivin高度表現的現象。然而EB病毒究竟如何調控Survivin表現，則目前並不清楚，因此於本研究我們嚐試探索EB病毒調控Survivin的機轉。實驗中利用反轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 與西方墨點法 (Western blotting)，我們發現EB病毒所表現的轉錄活化子，Zta和EBNA2可以增加Survivin mRNA與蛋白質的表現。除此之外，我們也證明Zta與EBNA2可以藉由活化Survivin啟動子增加Survivin的表現。而利用報導者分析法 (reporter assay)，我們發現Survivin啟動子上對於Zta調控Survivin啟動子重要的片段，並且在電泳位移分析法 (EMSA) 的實驗也證明Zta可結合Survivin啟動子上的ZRE (Zta response element)，這些結果指出Zta可能是透過結合至Survivin啟動子上的ZRE活化Survivin的啟動子。此外我們藉由細胞核質分離法 (Subcellular fractionation) 發現Zta所增加的Survivin主要表現在細胞核裡，目前已知當Survivin大量表現在細胞核裡可以幫助細胞週期的進行與細胞的增生。而在[3H]胸腺嘧啶嵌入法實驗中我們也發現，表現Zta的細胞其生長速率較控制組細胞迅速。但是當我們利用siRNA的技術抑制Survivin的表現後，即使細胞表現Zta也無法幫助細胞增生，此結果顯示Zta可藉由增加Survivin表現促進細胞的增生。
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異嘌呤醇 (Allopurinol)被用來治療痛風已經持續了近半個世紀，且到現今還是最常用的藥物之ㄧ，但是在某些服用這個藥物的病人身上會產生嚴重性皮膚不良反應 (SCAR)，包括了過敏症候群 (Hypersensitivity Syndrome)、史蒂文生氏-強生症候群 (Steven-Johnson Syndrome)與毒性表皮壞死溶解症 (Toxic Epidermal Necrolysis)。其中後者造成的死亡率高達30%。在之前的研究中，我們的研究團隊在這些病人的體內發現到HLA-B*5801這一個共同的基因標記，這個標記在所有的病人(51/51)體內都有發現，但是20% (20/135)也帶有這一個基因的病人在吃了異嘌呤醇之後並不會發病，這個發現說明了HLA-B*5801對於造成異嘌呤醇引起的嚴重性皮膚不良反應是必需的，但是單單只帶有這一個基因吃了藥後並不一定會發病。因為嚴重性皮膚不良反應的致病機轉可能包括了由HLA-藥物複合體與T 淋巴受器之間的交互作用並進一步活化藥物專一性的T細胞。因此我們假設這些病人的T細胞可能擁有同樣的T淋巴受器以辨識HLA-藥物所形成的複合體並進一步造成疾病。在這篇研究當中，我們使用一個常被用來培養藥物專一性T細胞的系統，我們使用這個系統將8個異嘌呤醇過敏病人血液中藥物專一性的細胞活化並分離出來。在經過5到6次的藥物與同源B細胞株的刺激之後，我們發現到CD4+ T細胞在過敏症候群與毒性表皮壞死溶解症病人血液活化出來T細胞中活化且成為主要的族群；而CD8+ T細胞則在史蒂文生氏-強生症候群病人血液活化出來的T細胞中成了主要族群。此外7個不帶有HLA-B*5801和2個帶有此基因的正常人的血液也在這個活化系統中依照和病人一樣的條件來刺激，但是這些正常人血液中的T細胞無法被活化並最後凋亡。在那些分離出來的藥物專一性細胞中，經過T淋巴受器的分析與定序之後，我們發現在Vβ2、Vβ13A、Vβ15 和Vβ18中，某些病人的CD4+ T細胞有使用類似的T淋巴受器；而在Vβ12和Vβ13A中，某些病人的CD8+ T細胞也有使用類似的T淋巴受器。更甚於此的是，我們發現在一個HSS、一個TEN的CD4+ T細胞還有一個HSS病人的CD8+ T細胞上發現到一模一樣的Vβ13A T淋巴球受器與互補決定區3序列：CASSYSPGRNEGFF。總的來說，這一篇研究支持了這些上述的相似T淋巴球受器，特別是Vβ13A-CASSYSPGRNEGFF可能參與在異嘌呤醇所引起嚴重皮膚過敏反應的致病機轉當中。
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