國立臺灣大學微生物學研究所學位論文/Graduate Institute of Microbiology
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慢性HBV感染仍是全球性的公共衛生問題。迄今為止，全長3.2 kb的HBV病毒可經由轉錄出四個主要的未剪接型unspliced RNA以及十六種剪接型spliced RNA (SpRNA) 。而spliced RNA裡發現最多的spliced 產物為SP1，其功能對於HBV 病毒複製仍然不清楚。研究發現SP1 所編碼出的新蛋白中，C端半胱胺酸(cysteine) 缺少之core 蛋白質 (HBc-cys) 會干擾HBV蛋白質外殼 (nucleocapsid) 的形成，這與感染過程中HBV核殼分解和病毒複製有關。從而發現增加HBc-cys的表現在HBV複製過程中扮演了一定的角色。先前的研究已報導這些spliced RNA對於轉染系統中的病毒複製並不重要。在動物實驗的初步結果指出，在人肝嵌合鼠中(chimera mice) ，缺乏splicing的HBV與野生型 HBV相比顯示出感染力受損。此外，在處理 β-巰基乙醇 (mercaptoethanol) 之下，相較野生型HBV病毒顆粒中單分子型式的HBc明顯多於剪接位點487突變的病毒顆粒。這個結果可能顯示蛋白質外殼之形成會受到胱胺酸之間的雙硫建差異而影響整個外殼的完整性。 在本篇研究中，我們試圖去探討HBV spliced RNA產物SP1所編碼的HBc-cys的功能作用。利用細胞實驗去了解缺乏HBc-cys的HBV是否會影響病毒初期感染進程中進入細胞或脫去蛋白質外殼的步驟。因此我們的結果顯示與spliced-deficient HBV相比，野生型HBV PF-rcDNA透過DNA脫蛋白以及蛋白質外殼結構變化在細胞質中測到的量比較多。
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克隆氏症（Crohn's disease, CD）為發炎性大腸疾病（Inflammatory bowel disease, IBD）的一種，屬於慢性的腸道發炎疾病且容易復發。目前有研究指出，黏附侵襲性大腸桿菌（Adherent-invasive E. coli, AIEC）與克隆氏症有關，克隆氏症的治療方法主要針對疾病中的過度免疫反應，以抗發炎藥物為主，但近年來也有針對腸內菌的標靶療法被提出，噬菌體療法屬於其中之一。在本篇研究中，希望藉由建構AIEC的突變菌株庫，找出噬菌體所辨認的標的受體。先前本實驗室研究中，已經從污水中分離出可以感染LF82（AIEC之人類參考菌株）的噬菌體ФLF82，以及可感染LI60C3（小鼠腸胃道分離出的AIEC）的噬菌體ФLI60C3。我們一開始推測莢膜有可能作為噬菌體的受體而感染宿主，透過pKO3質體帶有四環黴素（Tetracycline）抗藥基因，去置換AIEC LF82莢膜形成的相關基因，成功建構了帶有抗藥性基因的AIEC LF82莢膜缺失菌株，但發現噬菌體對其感染效率並無減低。而後利用pUT-Km1質體帶有mini-Tn5跳躍基因建構AIEC LI60C3的跳躍子突變基因庫（Transposon mutant library），並收集了2688株突變菌株，實驗結果發現噬菌體對其感染能力並無下降，因此推測此突變基因庫中跳躍子插入的位置，並沒有剔除到影響AIEC噬菌體感染力的基因。 細菌抗藥性在全世界日趨嚴重，早期開發的磷黴素（Fosfomycin）也重新被檢視，磷黴素毒性低、殺菌力強，且對產生廣效性乙內醯胺酶（Extended spectrum beta-lactamase；ESBL）分解酶的腸內菌具有高度感受性，但也有抗藥性菌株的發現。本實驗室先前測試15株CRKP後發現，這些菌株對磷黴素具有抗性，且最小抑制濃度（Minimum inhibitory concentration；MIC）為256 µg/mL或512 µg/mL，稱為低抗性菌株。在本篇研究中，以定量逆轉錄聚合酶連鎖反應測定這些低抗性菌株之fosA基因，與對磷黴素具感受性之NTUH-K2044菌株相比並沒有過度表現，而後將其fosA基因序列進行定序，並同樣利用NTUH-K2044菌株進行比對，結果顯示低抗性菌株之FosA蛋白質的第91個胺基酸皆為纈胺酸（Valine），而NTUH-K2044則為異白胺酸（Isoleucine），我們推測此胺基酸的變異可能與低抗性菌株之抗藥機制相關，透過pKO3質體成功建構NTUH-K2044胺基酸置換突變株（Ile91Val）後，利用最小抑菌濃度試驗測得磷黴素對其最小抑制濃度由64 µg/ml上升至256 µg/ml，提升了4倍，證實這些低抗性菌株的抗藥機制與FosA蛋白質上第91個胺基酸的改變有關。
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病媒蚊的生活史需要藉由吸取脊椎動物的血以完成其卵巢的發育。目前已知有某些病媒蚊能傳播人類重要疾病的病原體。因而，了解如何調節病媒蚊生殖調控與病原體複製的機制，對於開發嶄新的蚊媒蚊控制策略是重要的。Wnt訊息傳遞和未折疊的蛋白反應（UPR）在果蠅的胚胎發育和細胞的逆境反應中扮演重要的角色。但是，我們對於這兩種途徑與病媒蚊中卵黃生成的交互作用了解甚少。此外，先前在哺乳類細胞的研究中也發現，登革病毒感染需要高血糖和蛋白質的轉錄後修飾（例如: SUMOylation），這些對哺乳動物中的病毒複製是重要的。然而，對於登革病毒的主要傳播媒介埃及斑蚊中，吸血時血液中葡萄糖濃度和病媒蚊體內蛋白質SUMOylation對登革熱病毒複製的影響知之甚少。在本論文中，我們證明了Wnt和TOR信號之間的交互作用與埃及斑蚊生殖調控有關。我們也發現，在埃及斑蚊中，母蚊吸血後可以藉由活化未折疊的蛋白反應來啟動細胞自噬，而這些反應對於病媒蚊的生殖調控也扮演了重要的角色。另外，我們也證實了血糖和蛋白質SUMOylation有利於病毒在埃及斑蚊體內複製。
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肺炎鏈球菌是一種格蘭氏陽性胞外菌，具有極高的致病率及致死率，尤其在孩 童及老人影響甚巨。因此，讓我們更迫切需要研究肺炎鏈球菌致病機轉及其與宿主 間的交互作用去找到預防及治療的方法。所有的肺炎鏈球菌臨床菌株皆有表現神 經氨酸酶，先前研究大多發現神經氨酸酶可以移除宿主細胞表面的唾液酸，並且 NanA 可幫助肺炎鏈球菌定殖在宿主組織上。我們先前的研究結果顯示肺炎鏈球菌 的神經氨酸酶移除宿主細胞表面的唾液酸後，可能會影響 TLR-2 與 Siglec-5 間的 交互作用，因而促使此細胞的 TNF-α表現量增加，並且會活化 MAPK, PI3k/Akt 和 NF-κB 等路徑。然而，神經氨酸酶如何調控宿主發炎的詳細機制目前仍不清楚，因 此於本篇論文中，我們將進一步探討神經氨酸酶影響發炎相關路徑的詳細機制，而 加劇宿主的發炎反應。實驗結果發現，具有神經氨酸酶的肺炎鏈球菌透過影響 TLR-2 下游分子 IKK complex 的活化，因而造成受感染的 THP-1 細胞中多種促發炎激 素表現量增加，包含 IL-1β , IL-8 和 TNF-α，此劇烈發炎的現象可能來自於神經氨 酸酶影響 Siglec-5 和 SHP-1 間的交互作用。另外，神經氨酸酶主要透過活化 NLRP3 inflammasome, Caspase-1,GSDMD 和部分影響 Caspase-8，而促進 IL-1β的產生，並 且造成受細胞的存活率降低。
本文將於2025/09/19開放下載。若您希望在開放下載時收到通知，可將文章加入收藏。
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B 型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)在感染肝細胞後，其基因體會以共價閉合環狀去氧核糖核酸(covalently closed circular DNA, cccDNA)結構或嵌入宿主基因體中存在宿主肝細胞內。現行治療 HBV的藥物雖然可以有效抑制病毒的反轉錄複製，但無法完全清除病毒的複製模板- cccDNA，以至於無法達到根除 HBV 感染。另外，嵌入型的 B 型肝炎基因體(Integrated HBV DNA)有特定嵌入的熱點基因，會導致特定基因的活性上升導致癌化，其中以端粒酶逆轉錄酶基因(TERT gene)為首，若能抑制嵌入型的 B 型肝炎基因體中重要的增強子區域就有機會能降低肝癌的危險因子。在實驗室先前的研究以及其他文獻中，都證明了 HBV 的基因體可以被CRISPR-Cas9 此基因編輯工具破壞，然而CRISPR / Cas系統不可避免地會靶向嵌入型的 B 型肝炎基因體，並誘導宿主基因組的雙股斷裂 ，即伴隨著基因組重組與破壞的風險。因此本篇研究中，我們的目標為利用CRISPR / Cas9 介導的非切割鹼基編輯工具-單鹼基編輯器（base editors）與先導編輯器（prime editors）來修改HBV基因組中增強子的區域，來達到抑制HBV基因組，並評估能否降低HBV嵌入端粒酶啟動子(HBV integrant-fused telomerase promoter)的活性。 當 HBV 在患者體內無法被順利清除時，病毒抗原長存在患者體內循環，導致過度刺激而產生免疫耐受性 (immune tolerance)，但免疫耐受的機制迄今尚不清楚。目前許多研究的實驗證據表明，誘發後天免疫系統產生強而有力的 HBV 抗原專一性毒殺型Tc細胞(cytotoxic T cell)，才是徹底清除病毒完全治癒HBV 慢性感染的關鍵。免疫系統產生具抗原專一性毒殺型 Tc 細胞的過程，主要有幾個關鍵步驟。首先抗原呈現細胞在接受抗原而活化後，透過人類白血球抗原(Human Leukocyte Antigen, HLA)將抗原決定位(epitopes) 呈獻給 CD4+ 與 CD8+ T 細胞，CD4+T 細胞分化成 Th 細胞(Helper T cells)，而CD8+ T 細胞活化成 Tc 細胞的過程除了 APCs 也需要 Th 細胞的協助。我們認為，T細胞調節的保護力對於慢性病毒感染能更有效且持久，為了建立T細胞療法必須瞭解特定HLA呈現的胜肽與表現特定TCR之T細胞之間的關聯。由於HLA具有高度多型性，且等位基因至少表現出三種不同HLA基因，不利於鑑定出特定HLA呈現的胜肽。因此，我們利用CRISPR / Cas9基因編輯工具建立HLA class I null cell lines作為研究的工具，再使HLA class I null cell lines表達單一class I HLA基因，以利我們對於特定class I HLA對應特定T細胞調節免疫進行研究。將來有潛力做為根除 B 型肝炎病毒之抗病毒藥物。
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熱休克蛋白90 (HSP90) 在真核生物中具有高度的保留性，其功能參與了細胞中許多重要機制，包括蛋白質的折疊與運送、訊息傳導以及蛋白質降解等。且由於許多HSP90之受質被發現與人類疾病如免疫發炎反應、神經退化性疾病、囊腫性纖維化等有關，使得越來越多研究以熱休克蛋白作為潛在治療標的。在熱休克蛋白90執行其摺疊機制時，需要一群輔助摺疊蛋白的協助以調控熱休克蛋白之活性並且改變其構型，其中，某些輔助摺疊蛋白也被發現具有召集與結合特定受質的能力。在先前研究中，IME2依賴性訊息蛋白 (Ids2) 被認為是HSP90之輔助摺疊蛋白，且其磷酸化能影響Hsp90之水解ATP之活性並影響HSP90與Ids2間的結合。研究中也觀察到在剔除IDS2之酵母菌株具有粒線體失能的現象，然而當中之分子機制仍尚未被研究透徹。因此，本研究透過篩選與粒線體與呼吸作用相關之蛋白質尋找Ids2之潛在受質，透過細胞外蛋白質交互作用證實了ATP生成酶γ次單位 (Atp3) 為其主要受質之一，並進一步尋找出兩者進行結合的位置。
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核受體交互作用蛋白 (Nuclear receptor interaction protein, NRIP)，是一種鈣離子依賴性的攜鈣素 (calmodulin) 結合蛋白，由860個胺基酸組成，具有7個WD40 domain和1個IQ domain。在實驗室先前的研究中，我們發現NRIP可以調節肌肉的收縮和再生。此外，NRIP在小鼠腓腸肌中與乙醯膽鹼受體 (acetylcholine receptors, AChR) 複合物共定位，其中乙醯膽鹼受體複合物包括輔肌動蛋白異構體 (α-actitin 2, ACTN2)，受體相連突觸蛋白 (rapsyn) 和AChR。而在本研究中，我們發現小鼠肌母細胞 (C2C12 cells) 中的內生性NRIP與內生性AChR彼此可有交互作用，從而進一步證實NRIP是AChR複合物在神經肌肉接合處 (neuromuscular junction, NMJ) 上的一個組成部分。 重症肌無力 (myasthenia gravis, MG) 是一種自體免疫疾病，其常見特徵是眼睛或骨骼肌的疲勞與無力。重症肌無力是由自身抗體攻擊NMJ的突觸後膜所引起，而在這項研究中，我們新發現了一種與MG相關的自身抗體，即NRIP自身抗體。我們使用西方墨點法 (Western blot) 對43名MG患者的血清進行了NRIP自身抗體檢測，發現了6例(14.0%)具有NRIP自身抗體的患者。我們還對NRIP自身抗體進行了抗原表位 (epitope) 分析，並確定了它們的主要免疫原性區域 (main immunogenic region, MIR) 可能位於NRIP之C端的IQ domain。此外，我們也分析了NRIP自身抗體的IgG亞類，發現它們主要由IgG1組成。為了了解NRIP自身抗體在MG中的角色，我們尚分析了MG患者的嚴重程度與NRIP自身抗體存在的相關性。我們發現，當AChR自身抗體存在時，若擁有NRIP自身抗體則會與更嚴重的MG有所關連。此外，MG嚴重程度會隨NRIP自身抗體的濃度上升而增加。綜上所述，NRIP自身抗體是一種新發現的MG相關自身抗體，其或可作為較嚴重型的MG之標誌。
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B 細胞經由輔助型T 細胞 (T helper cell) 活化後會進行體細胞超突變 (somatic hyper-mutation, SHM) 以及免疫球蛋白類型轉換 (class switch recombination, CSR)。 體細胞超突變 (somatic hyper-mutation, SHM) 會在免疫球蛋白重鏈及輕鏈 (immunoglobulin heavy chain and light chain) 的可變區 (variable region) 產生高機率的點突變，增加抗體的多樣性進而對抗原的親和力產生影響，而對抗原親和力較強的抗體會逐漸增加，此為抗體親和力成熟過程。免疫球蛋白類型轉換 (class switch recombination, CSR) 會改變免疫球蛋白重鏈 (immunoglobulin heavy chain) 的恆定區 (constant region) ，但可變區 (variable region) 保持不變，因此抗體對抗原的親和力不會改變，而改變抗體的恆定區 (constant region) 會使B 細胞初始表現的IgM 及IgD 轉換成IgG、IgE 或IgA 等其他不同種類的抗體，而在這個轉換的過程中，在免疫球蛋白重鏈 (immunoglobulin heavy chain) 上的轉換區 (switch region) 會產生R-loop。R-loop 是由RNA:DNA hybrid 及single-stranded DNA 所組成的結構，然而，在細胞中過多的R-loop 累積會造成DNA 雙股斷裂，進而影響基因的穩定性，因此，R-loop 需要被嚴格的調控。在本篇論文中，我們致力於找尋在 免疫球蛋白類型轉換 (class switch recombination, CSR) 中調控R-loop 的因子，其中，我們發現Fancd2 (Fanconi anemia group D2) 可能參與調控免疫球蛋白類型轉換 (class switch recombination, CSR) 中的R-loop 形成過程進而影響抗體的多樣性。
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茲卡(Zika)與登革熱同樣都是藉由埃及斑蚊傳播的重要疾病。孕婦感染茲卡病毒甚至可能導致胎兒出現小頭症，再加上現今並無疫苗及藥物可使用，因此積極開發新穎的防疫策略是各個國家重視的議題之一。過去已知蛋白質的磷酸化會影響其構造和活性，進而調控細胞內訊息傳遞的過程，而蛋白激酶(Protein kinase)為主要負責蛋白質磷酸化的酵素。現在已知的蛋白激酶種類非常多，其中Protein kinase C (PKC)被認為是一類可以透過磷酸化serine以及threonine的烴基(hydroxyl group)而控制其功能的蛋白激酶。過去在哺乳類動物的研究發現，當宿主體內的PKC受到抑制時，會使登革病毒的非結構性蛋白(non-structural protein 5, NS5)無法被磷酸化，進而影響登革病毒的複製，但病媒蚊Protein kinase對於病毒調控的機制至今仍所知甚少。因此在本研究中，我們想探討埃及斑蚊的PKC是否對於病毒的複製扮演重要角色。我們首先使用PKC的抑制劑—Calphostin C對埃及斑蚊細胞株(ATC10)進行抑制，我們的結果顯示病毒感染前加入抑制劑可有效抑制病毒E蛋白(E protein)的產生，且使病毒的感染力下降。接著我們比對人類的PKC與埃及斑蚊的PKC，發現埃及斑蚊PKC3與人類影響登革病毒複製的PKC相似程度較高，因此我們利用過表現的方式使埃及斑蚊細胞株表現帶有HA標記的PKC3，根據實驗結果顯示，當PKC3過表現時，茲卡病毒的表現量也隨之上升，而病毒的感染力下降，因此我們推測PKC3可能影響病毒進入與釋出細胞的階段。我們也使用RNA干擾的方式抑制蚊子體內PKC3和PKC5的表現，結果顯示當埃及斑蚊PKC5表現被抑制後，E protein含量相對於控制組有減少的趨勢。根據目前的研究結果，我們推測埃及斑蚊蛋白激酶可能參與調控茲卡病毒的複製，未來我們將深入探討茲卡病毒與埃及斑蚊PKC之間的交互作用，同時將進一步探討宿主蛋白激酶影響茲卡病毒的詳細分子機制。
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樹突細胞對於活化抗流感病毒的T細胞免疫反應相當的重要，但是目前對於樹突細胞是如何調節形成肺部記憶型T細胞仍不是非常的清楚。目前發現的肺部樹突細胞主要有三群：CD103+的樹突細胞、CD11b+的樹突細胞以及單核球衍伸的樹突細胞。根據先前許多研究發現這三種樹突細胞對於建立肺部記憶型T細胞皆非常重要，但是哪一群樹突細胞對於建立肺部駐留記憶型T細胞扮演最主要的角色抑或是不同時間不同樹突細胞所扮演的角色目前仍不是非常清楚。本篇研究中發現，CpG最主要傾向刺激CD11b+樹突細胞，此外我也發現以PLGA包裹CpG以及OVA-I相較於其他疫苗佐劑的組別可以產生最多數量的肺部常駐型記憶T細胞。另外，我也更深入探討了之前比較少討論的肺部常駐型記憶T細胞的前體發現肺部T細胞中Runx3的表達量會隨著時間的推移而發生改變且與肺部常駐型記憶T細胞的前體的數目有一定的關係。最後，我發現以PLGA包裹CpG以及OVA-I所產生的肺部常駐型記憶T細胞的前體的數目有比其他組別還要多的趨勢，因此很可能是因為CpG所誘導產生的肺部常駐型記憶T細胞的前體數目就較多導致其最後所建立的肺部常駐型記憶T細胞也就較多。