以真菌的訊息傳導來說,酵母菌Saccharomyces cerevisiae是研究最普遍的生物,目前已經知道S. cerevisiae中有五條mitogen activated protein kinase (MAPK)訊息傳遞路徑,分別負責酵母菌的mating、osmotolerance及invasive/filamentous growth等。參與在此訊息傳遞路徑之蛋白由上游到下游分別為MAPK kinase kinase (MAP3K)、MAPK kinase (MAP2K)、MAPK,MAPK藉由活化下游之transcription factor,將訊息傳遞至細胞核,以誘導特定基因表現。在其他病原真菌的相關研究也發現此MAPK訊息傳遞在Magnaporthe grisea、Ustilago maydis、Cryptococcus neoformans、Candida albicans等的致病過程扮演重要角色。Phytophthora parasitica是台灣重要病原菌,會在蕃茄及枇杷等多種經濟重要作物造成根腐、莖腐、果腐等病害,嚴重時甚至會造成整株植物萎凋。為了探討MAPK訊息傳遞途徑在疫病菌致病機制的重要性,首先自P. infestans及P. sojae 的EST database (Phytophthora Functional Genomics Database) 搜尋MAPK訊息傳遞途徑相關基因,包括活化MAP3K的蛋白Rac及Ste20,還有MAPK下游的transcription factor Ste12,其中ste20-like基因在其他病原真菌如Magnaporthe grisea、Ustilago maydis、Neurospora crassa、Fusarium graminearum、Cryptococcus neoformans、Candida albicans也有發現到,並參與在mating、appressorium formation、infectious growth、virulence等過程。接著根據這些MAPK pathway上相關蛋白的序列設計degenerate primer,進行genomic DNA PCR及TA cloning。序列分析結果顯示所增幅的核酸片段中包含一ste20-like gene,命名為ppste20。後續以RACE進行分子選殖的結果顯示,ppste20全長度cDNA包含一1134 bp的ORF,可轉譯出一378 amino acid的蛋白質,其含有ser/thr protein kinase domain,且在P. parasitica基因體中只存在單一copy。北方雜合分析結果顯示,ppste20在P. parasitica菌絲期表現量很低, real-time RT-PCR之分析結果顯示ppste20在疫病菌zoosporogenesis的過程中似乎會被誘導表現。為了確定此基因確實具有ser/thr protein kinase activity,將此基因送到E. coli進行表現,並進行蛋白質純化,然後進行in-gel kinase activity assay。但截至目前為止,仍然沒有偵測到Ppste20的活性。
本研究主要利用較為簡便而迅速的異戊二烯採樣及分析方法,針對台灣常見的部分植物進行異戊二烯排放情形檢測工作。在植物排放異戊二烯之採樣上,係採用聚丙烯全透明塑膠袋圍封法,對欲檢測的植株直接進行全株或部分枝條之套袋圍封。在異戊二烯之分析上,係選用Se-30層析管柱搭配火焰離子化檢知器進行。 經檢測41種植物後,發現計有垂榕、印度橡膠樹、麵包樹、楓香、水黃皮、印度黃壇、白千層、蓮霧及芒果等9種植物具有相對較高的異戊二烯排放量。其中,垂榕、印度橡膠樹、麵包樹屬於桑科,楓香屬於金縷梅科,水黃皮、印度黃檀屬於豆科,白千層、蓮霧屬於桃金孃科,芒果屬於漆樹科。建議這些高異戊二烯排放植物不宜列為環保或景觀植物,而在都會地區更新樹種或推廣造林時,宜僅量避免選種此9種植物。另外,在選種此9種植物的同科或同屬植物之前,宜先進行異戊二烯排放檢測,確認無異戊二烯排放疑慮後再行種植。 進一步選擇印度橡膠樹、印度黃檀及楓香三種植物進行異戊二烯排放率研究。將三種植物的全株或部分枝條以聚丙烯塑膠袋圍封後置入植物清淨生態箱中,以6,300 lux之三波光照射1小時後,計算三種植物的異戊二烯排放率分別為12、15、32 μg/g/h。 在光質對異戊二烯之排放影響方面,選取楓香及印度黃檀進一步探討紅光、黃光、綠光及藍光等四種不同色光對其排放異戊二烯之影響,並以低排放力之茄苳作為對照。結果顯示四種光皆可促使楓香及印度黃檀排放異戊二烯,但以紅光的效率最佳,藍光其次,黃光再其次,而綠光之效率最差。而四種光皆無法促使茄苳排放異戊二烯。研判因紅光及藍光係植物行光合作用所需之主要色光,可促進植物行光合作用之速率,而異戊二烯之生成與排放與光合作用速率有關,因而促進異戊二烯之排放。 嘗試在前述9種具高異戊二烯排放力之植物下風區直接以氣密式針筒抽取大氣中之氣體進行GC-FID分析,結果皆無法檢測出GC-FID儀器可判讀之異戊二烯濃度,但有疑似波峰出現。此外,分析圖譜上皆可出現乙烯之分析波峰。這些結果顯示台北地區大氣中異戊二烯的濃度要比乙烯為低,其原因應是乙烯的主要排放源為汽機車及石化工廠,而異戊二烯的主要排放源僅為植物。 關鍵字:生物源揮發性有機物、異戊二烯
近年來由於工業廢水或其它廢棄物,造成水或農業用地的污染,導致許多公害的發生,但因一般水土污染的監測必須依賴儀器,費用高且不易普及,因而本研究考慮以植物作為監測污染之工具。 本實驗以水耕移苗法在1ppm鎘濃度下篩選二十種臺灣常見豆類植物,發現鎘對此二十種豆類植物皆會造成專一性紅棕色病徵,但經由病徵出現的快慢、健株是否帶有顏色及栽種的普遍性,初選出台南大豆4號、毛豆高雄6號、紅豆高雄3號及紅豆高雄7號進行各項研究。 以八種重金屬處理上述4種初選豆類植物,結果僅鎘會對此4種植物產生紅棕色病徵,顯示此病徵甚為專一。進行不同濃度鎘水耕液的測試發現0.1ppm即可對上述4種豆類植物產生病徵,且濃度越高者,病徵越快出現。 因為霍格蘭養營液無法調整其pH值,故以Peter,s肥料作為測試pH影響鎘反應之水耕栽培液,在不同的pH下加鎘處理上述4種豆類植物,發現大豆台南4號和高雄毛豆6號皆在pH6.2下病徵最快出現。而紅豆高雄3號和紅豆高雄7號在pH4.7及6.2下以鎘處理者,全數死亡。得知Peter,s肥料僅適用於大豆鎘污染指標植物,並不適用於紅豆。 以移苗法將上述4種豆類植物移植於不同濃度人工加鎘污染土,發現土壤中含鎘1ppm以上即可令此4種豆類產生紅棕色病徵,濃度越高者,病徵越快出現。 以直播法將上述4種豆類植物播於不同濃度人工加鎘污染土中,結果發現只有毛豆高雄6號、紅豆高雄7號,病徵的出現時間隨著鎘濃度的增加而越早出現;大豆台南4號及紅豆高雄3號病徵出現的早晚則和濃度沒有一定相關,高濃度者反而病徵較晚出現。此實驗結果顯示直播法較適用於土壤中鎘濃度低者,而不適用於含有高濃度鎘之污染土。 以移苗法將4種豆類植物移植在不同pH的人工加鎘污染土中,結果移苗後3天,種植於pH4.1之大豆台南4號、紅豆高雄3號及紅豆高雄7號已出現病徵,毛豆高雄6號則是在移植後4天出現病徵,而pH5.6及6.7者,則直至移植後十天,4種豆類植物皆尚未出現病徵。顯示土壤的酸鹼度會影響病徵出現的快慢,土壤pH值越高者,病徵越慢出現。 以移苗法測試自彰化採樣之七個田間鎘污染土,結果全部都會產生紅棕色病徵,唯其病徵出現的時間較相似濃度的人工加鎘污染土晚了許多天。主要是因為田間鎘污染土的pH值高於人工加鎘污染土之緣故。
線蟲捕捉菌Arthrobotrys musiformis之幾丁質分解酵素蛋白生化特性分析 幾丁質(chitin)是由N-acetyl-β-D-glucosamine(GlcNAc)單體,經β-1,4鍵結所聚合而成的一種直鏈狀多醣類聚合物,廣泛存在許多生物體中,包括甲殼類動物、真菌、線蟲及昆蟲。某些線蟲內部寄生菌已知在侵染線蟲過程中時,需分泌幾丁質分解酵素以突破線蟲卵壁幾丁質層之障礙。本研究的主要目的在於探討線蟲捕捉菌Arthrobtrys musiformis是否產生幾丁質分解酵素及其於侵染線蟲寄主時所賦有之功能。 Arthrobtrys musiformis培養於可誘導幾丁脢培養基,其幾丁脢及總蛋白含量於第四天到達高峰,以減壓濃縮,等電點分離,陰離子樹脂管柱,疏水性蛋白質管柱層析,純化並檢測各部分純化分割液之活性。獲知Arthrobtrys musiformis之幾丁脢偏酸性等電點為pH 3.4-pH 3.8,可能為trimer,由分子量大小約為29kDa,33kDa以及 38kDa之單體蛋白質所組成,擬由此純化之幾丁脢解序N端胺基酸序列進行相關基因選殖,因量偏低,並未獲得結果。 小花蔓澤蘭Mikania micrantha之本土真菌性病原生物防治潛力評估 於民國九十二年五月至九十三年六月期間在南投縣鹿谷鄉、竹山鎮、水里鎮、魚池鄉、埔里鎮、國姓鄉,台中縣太平市。彰化縣彰化市、埔心鄉。嘉義市,嘉義縣中埔鄉、竹崎鎮、梅山鄉,台南縣龍崎鄉、關廟鄉、新化鎮、玉井鄉,高雄縣杉林鄉、三民鄉、旗山鎮,屏東縣霧臺鄉、內埔鄉、泰武鄉,花蓮市,花蓮縣秀林鄉、吉安鄉、壽豐鄉、豐濱鄉,台東縣台東市等地調查、分離、鑑定可侵染小花蔓澤蘭之莖、葉、花部之本土性寄生性真菌天敵。由病班所分離之菌株共297株,初步鑑定至少涵蓋13屬真菌:Acremonium sp. Alternaria sp. Colletotrichum sp. Curcularia sp. Cyllindrocladium sp. Fusarium sp. Leptosphaeria sp. Macrophomina sp. Nigrospora sp. Pestalotiopsis sp. Phoma sp. Phomopsis sp. Phyllostica sp.。在此主要以Colletotrichum sp.侵染小花蔓澤蘭造成的葉、莖部炭疽病班最為常見;Phomposis sp.可引起小花蔓澤蘭葉部及莖部壞疽病班及葉脈及莖部褐化;Phoma sp.及Macrophomina sp. 感染葉片造成嚴重的黃化、水浸狀壞疽病班,常可導致野外小花蔓澤蘭區塊性風土病。此外,多種真菌性病原天敵也可同時感染小花蔓澤蘭,而加劇其罹病程度。經由菌絲圓盤接種、胞子懸浮液接種測試分離之真菌對小花蔓澤蘭之侵染病原性強弱,有9屬34種真菌可造成小花蔓澤蘭葉片黃化至壞疽病徵。但以真菌培養濾液噴灑小花蔓澤蘭葉片並無任何明顯之病徵呈現。
近年來,觀察台灣流行於田間木瓜輪點病所引起之病徵與過去報告已經有所變異,病徵傾向嚴重化而容易產生畸型葉,且夏季病徵依然嚴重,顯示田間病毒系統可能產生改變。因此為了再次確認目前台灣田間PRSV的系統,由屏東採集了各種不同病徵型之木瓜病葉,並在白藜上進行三代單斑分離,再回接至感病種台農二號木瓜,依據在接種台農二號木瓜上所引起之不同病徵而可得到三個不同病徵型之病毒分離株,作為目前PRSV系統之代表。嚴重嵌紋系統(PRSV-SM train)可引起葉片嚴重嵌紋之病徵,此一系統為過去台灣主要之流行系統;畸形系統(PRSV-DF strain)主要可引起葉片嚴重扭曲變形之病徵,此系統為目前台灣南部主要木瓜產區所流行之系統。壞疽嵌紋系統(PRSV-SMN strain)引起葉片嵌紋,伴隨有壞疽的病斑出現並且容易快速萎凋,其病害嚴重度似乎更甚於其他系統,為一極具破壞力之系統。為釐清此三種PRSV系統之生物性與分子性差異,本論文除細加探討三系統於木瓜寄主上病徵之差別外,也配合電子顯微鏡的觀察,了解各系統在木瓜組織所引起之細胞組織學上的變異;並將三種不同病毒系統進行近全長核酸解序且比較其基因上的差異度(Identity)。電顯之細胞病理學觀察圓柱型形內含體(cylindeical inclusion)結果發現,PRSV-DF在細胞質有大量風車狀(pinwheel)與捲軸狀(scrolls) 內涵體,以及少量長直狀層板(laminated aggregates)的內涵體;PRSV-SMN除可見到大量風車狀 (pinwheel)、捲軸狀(scrolls) 內涵體外,尚可見短彎曲層板狀的內涵體,另還發現PRSV-SMN可在細胞質累積龐大之黑色帶狀病毒集合體;PRSV-SM系統可見到風車狀及大量捲軸狀的內涵體外,亦可見到大量的短直層板狀的內涵體。在序列分析上,除兩端點之極少部分序列外,此三個病毒系統已解序完成約9.8K。經由各基因之比對結果可發現,PRSV-SMN在大多數基因序列上與PRSV-SM、PRSV-DF差異性較大,在CP、NIb、NIa-Pro、P3、Hc-Pro、P1等基因上皆有明顯之變異;而目前台灣優勢的PRSV-DF與過去優勢PRSV-SM其基因則較相似。為了研發一般性或具系統特異性的RT-PCR快速偵測法,以應用於快速系統鑑別與田間感染生態研究,特以基因體序列分析結果作為基礎,先選出三個系統皆能通用的引子對”PRSV 857”應用於PRSV普測。另外選出三條特異性引子對 PRSV-SM517、PRSV-DF703與PRSV-SMN467,可分別對SM、DF與SMN系統做專一性RT-PCR增幅。經數百個樣品的測試已經證實其可正確而穩定的鑑別出不同PRSV系統。為了解不同病毒系統在不同的木瓜品種體內增殖情形、病徵表現型,以及各系統之交互作用關係,本論文挑選了目前台灣優勢之PRSV-DF與具潛在毀滅性之PRSV-SMN個別單獨或混合接種於「台農二號」、「台大十號」與「台大十一號」木瓜品系,發現在接種後兩星期病徵極不明顯之潛伏期即可以RT-PCR偵測到病毒複製的訊號,經6星期追蹤病毒複製及病徵演變情形,可證明台大十一號木瓜對於PRSV-DF系統具有非常高之耐受度,台大十號對PRSV-DF則為中度耐受度,目前最廣受台灣農民栽培之耐病性台農二號則最為罹病,RT-PCR的偵測結果與病徵之表現呈現一致性。另外亦證實同時接種PRSV-DF與PRSV-SMN至木瓜上,利用專一性引子對的偵測可發現PRSV-SMN複製優勢會抑制PRSV-DF之複製發展,而使得PRSV-DF之RT-PCR訊號會隨著感染時間慢慢減弱,似乎說明PRSV不同系統之間存在著相互競爭之關係。為能更經濟而有效地偵測PRSV,本論文亦從事單元抗體的研發,且已篩選到對矮南瓜純化的病毒具有高度反應之三個抗體細胞株,其在罹病與健康的矮南瓜純化液之間具有顯著差異性,但對罹病木瓜樣本的敏感度尚嫌不足;進行西方印漬法證實這些細胞株可以與病毒鞘蛋白36 KDa的位置具有強烈訊號,期再改進木瓜萃取緩衝液,以便實際應用在木瓜之偵測。
以Rhizoctonia solani為碳素源,培養Schizophyllum commune可促進產生β-1,3-glucanase。於25℃、培養八天,所得之粗酵素10,000ml以超音波震盪過濾,經減壓濃縮機濃縮10倍,進行硫酸銨分割,利用等電點分離、陰離子交換樹脂和疏水性層析管柱純化後,增加251.5倍純化度,增加比活性13,579 (unti/mg),其pI值為3.45。再由活性電泳檢測及10% SDS-PAGE電泳分析得四個主要蛋白質片段,其分子量分別為63kDa、58 kDa 、29 kDa 和27 kDa,63 kDa之蛋白質經N端定序後得到8個胺基酸序列LDNGVGAL;58 kDa之蛋白質經N端定序後得到8個胺基酸序列LDNGVGRL,根據此N端胺基酸序列設計引子;另以NCBI上已發表之植物與真菌β-1,3-glucanase胺基酸序列設計C端引子,以多種組合進行反轉錄聚合酶連鎖反應,可獲得約500 bp 產物,定序後與NCBI資料庫之BLAST軟體進行序列比對,但比對結果尚未在NCBI資料庫中收尋到相似性或已註冊之序列。此外在大腸桿菌中建構了約2,000 個Fosmid DNA library clones,將再以製成的探針進行雜合,藉此選殖出完整的β-1,3-glucanase基因。
番石榴( Psidium guajava Linn ),為台灣重要果樹之一,其於生長期中,遭受許多植物病原菌之危害,其中尤以番石榴立枯病最為嚴重。番石榴立枯病於1926年首先由黑澤英一(E. Kurosawa)在台灣報導,其後經黑澤英一與澤田兼吉(K. Sawada)分離及鑑定,確定由不完全菌所引起,並命名為Myxosporium psidii Sawada et Kurosawa。 本病害為台灣本土性病害,除南非(Guava wilt disease)與印度(Sunken brown discolouration of guava)有類似病害的報導外,在其它番石榴分佈國家中,並無此病害之發生。為釐清該病原菌之分類地位,本研究首先針對其菌落與產孢形態及18s rDNA和ITS等輔助分子分類依據,進行分析。結果顯示,其產孢方式至少有三種,一為短橢圓形孢子,成鏈著生於分枝之分生孢子柄上;二為長橢圓形孢子,著生於不分枝之分生孢子柄上;而第三種產孢形態,孢子為卵圓形,成鏈著生於不分枝之分生孢子柄上。18s rDNA與ITS區域之增幅、選殖、定序及親緣分析之結果顯示,其與子囊菌肉座菌目( Hypocreales )中的菌株,具有高度之相似性。而分析我國主要栽培區分離菌株之ITS區域序列後發現,所有菌株之序列完全相同,無任何差異存在。進一步ITS區域序列比對發現,七株Penicillium sp.之不同分離株,ITS序列之相似度高達95%以上,其中三株分離株之ITS序列甚至完全相同,進一步查詢其來源,發現為南非Guava wilt disease之病原菌分離株。另外,由野生番石榴植株表面,分離到10株具有不同程度拮抗效力的細菌菌株,經鑑定結果,一株為Paenibacillus lentimorbus,二株為Bacillus licheniformis,並皆具產生幾丁質分解酵素(chitinase)之能力,其餘七株皆為Bacillus subtilis。利用掃描式電子顯微鏡觀察,拮抗細菌P. lentimorbus TP-2會造成M. psidii菌絲變形,而B. licheniformis TP-9則會造菌絲變形與孢子崩解之現象。在四種不同營養成份之培養基進行對峙試驗時,其中以P. lentimorbus TP-2在四種培養基上,對所有供試植物病原真菌的菌絲生長皆具有不同程度之抑制效果,並且以稀釋10倍之馬鈴薯葡萄糖培養基,所表現之抑制能力最佳。而以M. psidii與Magnaporthe grisea進行孢子發芽抑制試驗顯示,除B. licheniformis TP-9無明顯抑制效果外,P. lentimorbus TP-2及B. subtilis TP-7與TP-8皆具有不同程度之抑制效果,其中亦以P. lentimorbus TP-2抑制效果最佳,可降低M. psidii與M. grisea之孢子發芽率,分別達22%和2.5%。以光學顯微鏡觀察發現,被抑制發芽之孢子具有原生質顆粒化之現象,縱使有些孢子可以發芽,但其發芽管及菌絲有膨大且外壁不平滑之不正常情形。另一方面,應用M. psidii pXH9轉形菌株,進行生物防治技術之開發上,吾人成功地利用基因槍轉殖系統將帶有Cryphonectria parasitica dsRNA virus之 infectious cDNA的質體pXH9轉殖進入M. psidii中,並共獲得36株具有Hygromycin B抗性之轉形株,其中二株轉形株具有形態異常之情形,包括菌落顏色改變、菌絲稀疏與產孢量減少。進一步以PCR與南方雜合分析,確定pXH9已插入此二株轉形株之染色體中,但是否dsRNA存於此二轉形株中,則有待進一步之實驗分析。
柑桔破葉病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV),分類上隸屬於Capillovirus屬,基因體為(+)ssRNA,長650nm。CTLV主要引起柑桔破葉病(citrus tatter leaf ),病毒可經由嫁接及機械感染傳播,對多數之柑桔品種呈潛伏感染,通常無病徵;但當感染某些特殊柑桔品種如Kalpi lime (Citrus excelsa)或Rusk citrange (Poncirus trifoliata × C. sinensis )時,則會產生萎縮、畸形、斑紋及破裂的葉片,並也會在許多柑桔品種上造成砧木與接穗不親和的裂痕,不但影響植株發育且易受強風摧折。蘇等人曾利用指示植物(Rusk)做生物檢測進行台灣CTLV的罹病率調查,結果顯示樣本中約有70~80%的柑桔株帶有CTLV,分佈遍及全省。前年在嘉義農試分所柑桔原種保存園中,發現許多以枳殼或枳柚為砧木的植株呈現砧木與接穗不親和現象,以Rusk生物檢測法鑑定出是受到CTLV的感染。為了進一步了解此病毒,本論文即從生物性與分子性兩方面探討並鑑定不同的CTLV系統。生物性方面,由指示植物枳橙Rusk citrange上的病徵表現為最初鑑定依據,並且再經三代局部病斑分離接種於單斑寄主白藜(Chenopodium quinoa)葉片上,分置於高溫30℃及低溫22℃的溫室中觀察其病徵表現,結果可區分出台灣柳橙分離株(LCd-NA-1)、台灣金柑分離株(Kq-6-2-46)、浙江溫州柑分離株 (Sat-HY-2)與廣西四季桔分離株(Cal-KS-1)在生物性上的差異。為了解台灣CTLV系統之分子特性,將台灣柳橙及金柑分離株逕行基因體全長定序,並已登錄至GenBank。與國外已發表之Capillovirus屬病毒比對的結果發現,台灣兩代表性分離株之相似度達95%,與日本所發表的CTLV只有81%相似度,與其它幾個Capillovirus屬的病毒則約有80%的相似度。另外,因為CTLV過去一直沒有良好的檢測方法,所以利用RT-PCR技術建立一套標準靈敏度高的檢測方法。在多種RNA的萃取方法,得到四種可行良方,其中以TRIzol Reagent 法最符合經濟、靈敏及穩定度高等特點,故將之推薦為最佳CTLV-RNA之萃取法。另外以全長序列分析結果為基礎選出兩特異性引子對:CTLV 636,用於CLTV之普測;CTLV 527,專對CTLV台灣分離株的特異性偵測,再配合最佳條件化之one-step RT-PCR,建立RT-PCR快速偵測法。利用此研發之方法針對嘉義柑桔原種保存園進行檢測,發現甜橙類受害比例甚高,其餘品種受害也不少。由此保存園中收集到來自不同柑桔品種的CTLV分離株,再加上所收集到的國外分離株,以CTLV 636引子對進行RT-PCR增幅,並將這636 bp的增幅片段做定序,再予以序列比對,繪製出國內外所有不同CTLV系統之親源關係圖,由此樹狀圖獲知各分離株之分子歧異度受到地理位置的影響頗大。本論文以生物性及分子性的證據證實CTLV確實具有系統多樣性,此研究結果有助於柑桔破葉病發病生態之進一步瞭解;而論文中所建立的RT-PCR快速偵測法則可提供正確而敏感的CTLV檢疫技術,直接應用於我國柑桔健康種苗制度之建立上。
自然界中,許多物種會受光的調控而表現不同的生理現象與形態發生,包括趨光性或背光性、誘導器官發生、生物週期、色素的生合成及特定生殖構造的發育。生物並非可感受每一種波長的光線,大部分生物對光的反應是受紅光、遠紅光、UV-A、UV-B及藍光的調控。而大部分真菌受藍光及UV-A之調控,如Neurospora crassa,藍光會調控其色素的形成,生物週期性,無性及有性生殖構造的誘導,產孢構造之向光性等。隱球菌(Cryptococcus neoformans)是人體伺機性病原性真菌,主要感染免疫不全的病人,若不加以治療,將造成極高之致死率。隱球菌為異宗交配型 (heterothallic)之擔子菌,在一般培養狀態,以酵母菌的形態存在,當兩種交配型細胞混和在合適的環境下,會進行細胞融合產生雙核菌絲,最終形成擔孢子。研究隱球菌之有性生殖,發現雙核菌絲之產生會受光照影響 (Shen et al., 2002)。在本研究中,確認C. neoformans雙核菌絲之生成受光抑制,並證實C. neoformans可感受藍光,光譜中之藍光抑制雙核菌絲之形成。為進一步探討隱球菌光反應的分子調控機制,以紅色麵包黴為模式,利用其藍光光受器WC-1氨基酸序列,在隱球菌的基因體中找到一同源基因,並命名為CWC1。Cwc1蛋白序列保守功能區之分析顯示,其亦具有與chromophore結合之LOV domain。為了進一步探討CWC1基因在隱球菌上扮演的功能,吾人進行cwc1突變株之建構及其性狀分析。由交配菌絲生長分析結果顯示,CWC1的確參與隱球菌光反應之調控,cwc1突變株生殖菌絲之形成,不再受光之抑制。在基因表現分析實驗中顯示,CWC1轉錄不受光照活化,但光照為活化Cwc1蛋白質功能之必要因子。綜合各項實驗結果,推測Cwc1為隱球菌之藍光接受器。
彩色海芋為台灣新興花卉之一,由於花形獨特且花色變化多,廣受消費者喜愛,為最具潛力之球根花卉。但栽培過程極易遭受病毒病害侵襲,造成經濟損失。2002年,自田間取得一複合感染之彩色海芋葉片組織,將其汁液接種於指示植物白藜上,結果出現褪綠單斑病徵。經三次單斑分離並回接彩色海芋組培苗,出現黃色斑點及條斑病徵;以間接酵素連結免疫分析,顯示其與anti-potyvirus之抗體呈正反應;以陰染法染色,於電子顯微鏡下亦可觀察到絲狀病毒顆粒。由於本實驗室所研究感染彩色海芋的potyvirus,如芋頭嵌紋病毒、彩色海芋嵌紋病毒及彩色海芋微嵌紋病毒,寄主植物多侷限在天南星科植物,故推測可能是異於前三者之另一potyvirus。為了更進一步獲得序列資料以鑑定此病毒種類,以針對Potyvirus屬所設計之廣效性引子對(degenerate primers)進行RT-PCR,得1.7 kb片段。經選殖及解序等工作,取得部份NIb至3’端非轉譯區之序列,與NCBI資料庫進行比對,確認此一病毒為危害十字花科甚為嚴重的蕪菁嵌紋病毒(Turnip mosaic virus, TuMV),並將此病毒分離株稱之為TuMV-ZAN。進一步進行全長度基因體序列之解序,得全長序列共9834個核苷酸,包含5’及3’端非轉譯區及P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa、NIb及CP等基因。2004年再於田間分離到另一感染彩色海芋的蕪菁嵌紋病毒,將其3’端之基因選殖並定序,發現其CP基因與TuMV-ZAN只有89%相同度,因此命名為TuMV-ZAN2分離株。將這兩個分離株鞘蛋白基因與來自其他國家的蕪菁嵌紋病毒分離株進行類緣分析,結果顯示這兩個分離株分別落在world-B及basal-BR group中。 為方便將來蕪菁嵌紋病毒之學術研究及田間檢測,將此一病毒之鞘蛋白基因選殖至表現載體pET-29a(+),並以大腸桿菌系統(Escherichia coli BL21 (DE3))之表現重組鞘蛋白作為免疫抗原,生產抗體。所得之抗血清以間接酵素連結免疫分析及西方轉漬法測試抗體力價及專一性,結果抗血清力價至少達25000倍,並且只與TuMV有專一性反應。此外,也將此類表現蛋白免疫注射小白鼠,經融合瘤等技術篩選到一單元抗體細胞株,稱之為Mab403。以間接酵素連結免疫分析,發現這個單元抗體不只對蕪菁嵌紋病毒之鞘蛋白有反應,亦可廣效地偵測到至少另外八種potyvirus。
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