臺灣大學植物病理與微生物學研究所學位論文
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
- 學位論文
癌症已被世界衛生組織報導為第二大死因，且乳癌為在女性中最常見之癌症。正確的診斷及預後對於提高乳癌之存活率為關鍵。近年來，液態活檢(liquid biopsy)為精準醫學奠定了基礎。液態活檢存在於血液等各種體液中，具有多種動態生物分子如核酸及蛋白質並提供了許多有用的資訊。胞外體為液態活檢中常見的目標之一，胞外體為由細胞分泌出大小介於30至100奈米雙層脂質脂囊泡，內含許多運送物質如核酸、蛋白質、脂質及代謝物等。胞外體在腫瘤微環境中扮演重要的角色，包含血管新生、細胞遷移、細胞侵襲及轉移。因此，我們分析乳腺癌外泌體的蛋白質含量，以期找出潛在的生物標記和與癌症相關的機制。 為了要找出潛在的生物標誌，我們從癌症病患、良性腫瘤病患及正常受試者分離出胞外體並以液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)分析蛋白質體。接著透過主成分分析(principal component analysis, PCA)驗證在差異表現蛋白質組的重要性。另外，差異表現之蛋白質進行了三種建模，分別為線性判別分析（LDA），廣義線性模型（GLM）和支援向量機（SVM）來預測潛在的生物標記。另一方面，對從細胞株分離出之胞外體之蛋白質體分析以進行機制探討。 功能性註解工具(IPA)和基因集富集分析(GSEA)顯示了乳腺癌發展過程中胞外體參與之生物學途徑。為了探討腫瘤胞外體蛋白質之作用及功能，將進行基因編輯及功能測定。在本研究中，我們發現了潛在的乳腺癌檢測生物標誌，並為參與乳腺癌發展的胞外體提供新的見解。
- 學位論文
蛇紋岩土壤為一富含鎳、鉻的天然環境，低鈣鎂比為此土壤特性。目前台灣蛇紋岩土壤中微生物群相未知，本研究於2019年1月起調查蛇紋岩土壤中線蟲群相，採集我國宜花東共23個區域之蛇紋岩土壤與非蛇紋岩土壤，各分離出20與22科線蟲。比較相同樣本數下分離的線蟲總量，發現蛇紋岩土壤中的線蟲遠少於非蛇紋岩土壤，推論高濃度的鎳、鉻環境不利於線蟲生存。探究線蟲分群類別，Qudsianmenatidae科僅在蛇紋岩土壤中被發現，Anguinidae、Dolichodoridae、Rhabdolaimidae等科之線蟲則僅出現於非蛇紋岩土壤中。在非蛇紋岩土壤中出現頻率最高的Meloidogyne, Heterocephalobellus兩屬線蟲在蛇紋岩土壤中豐度明顯下降，推測該兩屬線蟲可能對於重金屬為較敏感，耐受性較低。因此，本研究首先探究高濃度鎳、鉻於根瘤線蟲體內所產生之生理影響。本研究挑選新興重要入侵病原象耳豆根瘤線蟲作為試驗材料，發現其在鎳、鉻環境中，繁殖、侵染、發育及代謝等生理能力皆受到影響，且高濃度下不利其生存；鎳濃度高於200 ppm時，象耳豆根瘤線蟲的死亡率會顯著上升，而高於50 ppm的鉻，則使象耳豆根瘤線蟲有100%死亡率。當環境中含有鎳時，象耳豆根瘤線蟲的卵孵化率、侵染能力及代謝速度皆下降，然而其卵及幼蟲發育速度皆加快。而環境中的鉻，則使象耳豆根瘤線蟲的卵孵化率、侵染植株及代謝等能力下降，並使幼蟲發育速度加快。於本研究調查中，發現蛇紋岩土壤中有一種對鎳、鉻具有高度耐受性之根瘤線蟲，推測該種類可能獲得環境中微生物之協助而產生較佳適應性。因此，本研究調查蛇紋岩土壤中的細菌群相，進行細菌功能性分析，結果發現，共有十七個屬 (Dongia, Pirellula, Anaerolinea , Haliangium, Sphinogomonas, Geobacter, Streptomyces Gaiella, Pseudolabrys, Rhodopseudomonas, Candidatus, Pedomicrobium, Pseudaminobacter, Steroidobacter, Reyrannella, Bacillus, Bradyrhizobium) 於蛇紋岩土壤中具有較高的相對豐度。其中，Sphinogomonas, Geobacter, Streptomyces, Pseudolabrys, Rhodopseudomonas, Candidatus_Solibacter, Steroidobacter, Reyrannella等八個屬，過去曾被報導於高濃度金屬環境中具耐受性，且有金屬吸附及螯合等能力。本研究發現，Bacillus nealsonii及Solitalea koreensis 與Acidobacteria bacterium等三菌株與土壤中鎳、鉻濃度具有高度正相關性。本研究中所篩選出之與重金屬相關菌群，可做為後續研究高鉻、鎳環境中線蟲-細菌交互作用的潛力菌株。
- 學位論文
隱球菌（Cryptococcus neoformans），屬於擔子菌門，為異宗交配型真菌具有MATa與MAT兩種不同交配型。隱球菌存在兩種不同細胞形態，在營養充足環境下，以酵母細胞無性繁殖，而當氮素源缺乏誘導有性生殖時，兩性細胞融合可產生菌絲形態。隱球菌有性生殖過程中，包括酵母菌絲形態轉換、菌絲延長、擔子柄形成、減數分裂，及產生擔孢子等過程。隱球菌 CRK1 基因，為啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）IME2 與玉米黑穗病菌（Ustilago maydis）crk1之同源基因，具有負向調控隱球菌雙性有性生殖之角色。本研究探討CRK1對隱球菌有性生殖及菌絲發育之影響、Crk1在細胞中的分布，及其在訊息網絡的交互作用。crk1突變株的有性生殖過程，其細胞融合效率及雙核生殖菌絲發育時程，皆顯著提高及加速，並且相較於野生株，其擔子柄（basidium）與擔孢子（basidiospore）的形成皆提早18小時；雖然突變株雙核菌絲的長度明顯的短於野生株，但相關構造皆完整存在。基因表現分析顯示，CRK1調控有性生殖各階段，如 ZNF2, DMC1與CSA1等基因的表現。而有性生殖表型分析結果顯示，NAT2與ZNF2基因的突變，皆造成crk1突變株無法形成雙核生殖菌絲。藉由基因體生物資訊的分析，預測轉錄因子Gat1與 Rgm1可能為 Crk1 下游的標的蛋白質。經由表型與遺傳分析結果顯示，Crk1與Gat1在有性生殖的過程具有重疊功能，形成一迴路調控Mat2，參與生殖菌絲發育進程及形態轉換的調控。總結，隱球菌Crk1為雙核生殖菌絲分化的調控因子，透過調控Gat1負向調控隱球菌的有性生殖。
- 學位論文
茭白，為禾本科（Gramineae）菰屬（Zizania）多年生宿根性草本植物。茭白黑穗菌，為黑穗菌（smut fungi）的一員，感染茭白後，導致茭白植株無法正常結穗，並在莖基部產生膨大的菌癭，經由農民留種無性繁殖，成為鮮嫩可口的茭白筍。茭白的膨大結筍，普遍認為是因植物賀爾蒙的改變，進而誘發組織膨大所致，唯其機制仍不甚清楚。本研究的目的，在探討茭白黑穗菌生合成的吲哚乙酸（IAA）是否為茭白結筍的重要因子。首先，根據真菌IAA生合成路徑相關基因資訊，利用生物資訊學的方式，於茭白黑穗菌基因體資料庫中進行分析比對，鑑定IAA主要生合成路徑「IPA pathway」及次要生合成路徑「TAM pathway」生合成相關基因。其中，發現茭白黑穗菌Ueipdc（indole-pyruvate decarboxylase）基因，為IPA pathway中間步驟單一調控基因，故本研究以IPA pathway及Ueipdc基因為主要研究對象。為了進一步探討茭白黑穗菌IAA的生合成，利用split-marker突變技術及基因槍轉殖法進行Ueipdc基因的剔除，分析突變株IAA生合成能力發現與野生型菌株並無差異，比較ΔUeipdc突變株與野生株間IAA pathway生合成之基因，發現IPA pathway Ueiad1基因及TAM pathway Uegdc3與Uenit2二基因表現有所變化，推測Ueipdc基因的突變可能促使茭白黑穗菌使用旁支路徑TAM pathway回復IAA生合成的能力，此現象值得進一步剖析驗證。針對結筍樣品轉錄體及real time qRT-PCR基因表現分析，可偵測到茭白黑穗菌IAA生合成基因於結筍初期的表現，而後期階段則觀察到茭白ZlYUCCA基因有明顯持續上升的現象。進一步地，將野生株及ΔUeipdc突變株配對接種於公株誘導結筍，結果顯示突變株感染及誘導結筍能力皆與野生株相似，無明顯差別。綜合本研究結果顯示，茭白黑穗菌具有多重路徑進行IAA的生合成，茭白黑穗菌合成的IAA可能在茭白結筍並非扮演主要角色，未來可能需建構不同路徑的多重突變株，方能更明確闡明茭白黑穗菌IAA與茭白結筍的關係。
- 學位論文
百合灰黴病是百合重要病害之一，主要由Botrytis elliptica造成，可發生於全株地上部，產生黃褐色壞疽病斑，影響光合作用及花器觀賞價值，目前仍不清楚B. elliptica的致病因子。前人研究指出B. elliptica在孢子萌芽時會產生酯酶，並且分泌蛋白，造成百合細胞死亡；本研究以真菌外泌性蛋白為研究對象，期了解B. elliptica毒力因子及其於灰黴病菌致病過程中之角色。本研究發現相較於僅除去菌體之B. elliptica培養液及經聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride)過濾之濾液，混合纖維膜(mixed cellulose ester)之濾液明顯減少對百合細胞的致死能力。以質譜分析差異性蛋白質條帶，找到與灰黴病菌B. cinerea之BcPME1序列高度相似的外泌蛋白(BePME1)，預測其帶有一訊息胜肽及果膠甲基酯酶酵素活性區段。百合灰黴病菌感染72小時內，在中度抗病性百合‘Star Gazer’上，接種B. elliptica後24小時，bepme1表現量上升，並在接種後60小時有最高相對表現量；在高度感受性百合‘Tresor’上，接種B. elliptica後12小時，表現量上升並隨即下降，接種後36小時後的表現量再度上升，並在接種後48小時達到最高相對表現量，指出BePME1參與B. elliptica與寄主的早期交互作用以及B. elliptica感染後的病徵擴展。以dsRNA進行bepme1基因靜默，反轉錄-即時定量聚合酶連鎖反應偵測較少的bepme1表現，百合灰黴病菌感染導致的病斑擴展速率較慢，並且延遲植體上的菌體增加量；以高濃度菌量接種感病寄主時，bepme1基因靜默則不會影響灰黴病病徵發展。以Pichia pastoris生產移除訊息胜肽的BePME1 (BePME1ΔS)未能檢測出具果膠甲基酯酶活性；然將BePME1ΔS導入百合葉盤，則可使百合細胞內離子外漏，以Evans blue染色後亦可檢測出死亡的百合細胞。將B. elliptica接種於處理1 µM BePME1ΔS或以農桿菌浸潤法短暫表現bepme1之百合葉盤，均可造成較大的病斑。本研究結果指出BePME1可做為毒力因子，引起百合細胞死亡，有助於B. elliptica侵染寄主後的病徵發展。
- 學位論文
紅龍果在分類上屬於仙人掌科(Cactaceae)三角柱屬(Hylocereus)，為現今重要經濟果樹。臺灣栽種的紅龍果大多受到紅龍果X病毒(Pitaya virus X, PiVX)、仙人掌X病毒(Cactus virus X, CVX)與蟹爪蘭X病毒(Zygocactus virus X, ZyVX)三種 Potexvirus 屬病毒的感染，然而紅龍果病毒在植物中的感染機制仍有許多未知的地方。曾有研究發現 Potexvirus 屬病毒鞘蛋白可和寄主蛋白產生交互作用，進而影響病毒的累積與移動。據前人研究，PiVX 的鞘蛋白突變株會影響病毒在圓葉菸草原生質體中的累積量，但尚不知道有哪些寄主因子參與在此過程中。本研究目標為找尋可和 PiVX 鞘蛋白產生交互作用之植物蛋白，並研究該蛋白對於病毒感染過程的影響。以接種PiVX的紅龍果與白藜作為材料，進行交聯免疫共沉澱，確立各項條件後，進行 LC-MS/MS 與資料分析。在四次獨立試驗中，共找到 64 個紅龍果蛋白可能和 PiVX 鞘蛋白產生交互作用，而這些僅出現一次的蛋白大致上可分為三大類群，分別是葉綠體與粒線體相關蛋白、核醣體相關蛋白，以及其他蛋白。以白藜作為植物材料之實驗中，共有8 個白藜蛋白於三次獨立試驗中都被發現可以和 PiVX 鞘蛋白產生交互作用。目前先挑選TOM1-like protein 9 (TOM1L-9)、reticulon like protein B8 (RTNLB8)以及 pathogenesis-related protein PRB1-3-like (PRB1-3L)三個蛋白進行後續實驗。為瞭解目標植物蛋白對於病毒感染過程的影響，先將目標白黎蛋白基因進行靜默，再接種 PiVX，而後分析在目標基因靜默時，植株中之 PiVX 累積量。使用 Tobacco rattle virus (TRV) 病毒載體進行病毒誘導基因靜默，以帶有目標基因片段的 TRV 植物汁液機械接種白黎，三天後白藜接種葉顯著表現出病毒誘導之基因靜默；反之，未接種之系統葉則無基因靜默表現。接種 PiVX 於目標基因靜默後的白藜接種葉，並與無靜默表現之對照組相比，結果發現三個目標基因無論靜默與否，都對於 PiVX 在白藜上的累積沒有影響。為驗證白藜蛋白與 PiVX 鞘蛋白在植物細胞內是否會產生交互作用，分別表現以 EGFP 與 mCherry標定之目標蛋白，觀察兩者在植物細胞中的坐落位置。於螢光顯微鏡與共軛焦雷射掃描顯微鏡下，觀察到 PRB1-3L 位於細胞膜與細胞核周圍，細胞質內亦有少量存在；而 PiVX 鞘蛋白則坐落在細胞膜和細胞核中，但不存在於核仁；並由螢光疊合結果推測兩蛋白可以在細胞膜產生交互作用。
- 學位論文
OPEL為Phytophthora parasitica所分泌的質外體效應蛋白 (apoplastic effector)，序列分析顯示其具有signal peptide, thaumatin-like domain, glycine-rich domain及glycosyl hydrolase (GH) 16 domain，後者包含β-1,3-glucanase的保守性序列。以OPEL重組蛋白處理Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN可引發明顯之壞疽斑 (necrosis)、癒傷葡聚醣 (callose) 沉積、活性氧分子 (reactive oxygen species, ROS) 累積及誘導防禦相關基因表現。此外，OPEL引發植物免疫反應的關鍵構造為GH16 domain，將其預測的酵素活性位點進行單點突變後，即大幅降低OPEL激發植物防禦反應的能力，因此OPEL很可能藉由分解植物細胞壁產生DAMP而引發免疫反應。為探討這個可能性，本研究製備OPEL重組蛋白及其酵素活性區雙點突變蛋白 (OPEL-dm)，用以處理菸草後，收集質外體液 (分別稱為AF-OPEL及AF-OPEL-dm)，防禦反應分析結果顯示AF-OPEL可引發菸草細胞壞疽、誘導防禦相關基因表現及增加對P. parasitica的抗性，但AF-OPEL-dm僅在菸草葉片引發微弱黃化。以95 oC加熱15分鐘後，AF-OPEL仍具有引發菸草細胞壞疽的活性；除此之外，AF-OPEL也較AF-OPEL-dm含有較多的還原糖。為了進一步找出AF-OPEL內引發植物免疫反應的活性物質，先後以正己烷及乙酸乙酯萃取，將AF-OPEL的成分分成低極性、中極性以及高極性等三個部份，續以the luminol-based chemiluminescence分析方法檢測各極性層萃取物引發活性氧分子累積的活性。結果顯示AF-OPEL的低極性層 (AF-OPEL/H)、中極性層 (AF-OPEL/EA) 及高極性層 (AF-OPEL-A) 萃取物均具有誘導活性氧分子累積的能力，但AF-OPEL/EA展現的活性明顯高於其他二者。進一步以高效液相層析法分析，發現三個AF-OPEL/EA特有的波峰，分別稱為peak I, peak II與peak III，其中僅peak II具有誘導活性氧分子累積的能力。這些結果顯示OPEL引發植物免疫反應之機制很可能是藉由辨識DAMPs而不是PAMPs且與其酵素活性密切相關。未來研究目標將著重於找出peak II所代表之物質，以瞭解其對於OPEL及植物間的交互作用。
- 學位論文
仙人掌科三角柱屬(Hylocereus spp.)的紅龍果是熱帶地區常見的水果作物。根據報告，目前台灣感染紅龍果的病毒有仙人掌X病毒(CVX)、紅龍果X病毒(PiVX)和蟹爪蘭X病毒(ZyVX)三種。田間調查顯示，在台灣主要紅龍果種植區中紅龍果植株均至少感染這三種Potexvirus屬病毒中的一種，且常見複合感染。因這些紅龍果病毒的分子感染機制仍待探討，本論文採用轉錄體與文獻搜尋的方法研究紅龍果與這些病毒之間的交互作用。熱休克蛋白70家族(Hsp70s)和葉綠體磷酸甘油酸激酶被已被報導為其他potexvirus的相關的寄主基因，以這些植物蛋白為對象，分析被CVX和PiVX感染的植物。半定量反轉錄聚合酶連鎖反應的結果顯示，Hsp70c-4的表現量在PiVX感染的圓葉菸草中被向下調控。至於初步的轉錄體分析，分別以對照組、感染CVX和PiVX的紅龍果(H. undatus)總RNA進行次世代定序，利用de-novo 組裝法，總共獲得60,510個片段重疊組(contig)；之後使用阿拉伯芥(TAIR)和歐洲分子生物學實驗室(EMBL)的編碼序列(cds)資料庫，進行註解和開放閱讀框(ORF)預測。透過轉錄體表現量與文獻搜索，自差異表現基因中挑出11個主要研究目標。為驗證轉錄體資料的可信度，從中找出HSPRO2與BMY3作為參考基因，並以定量RT-PCR分析幾個差異表現基因的表現量，但結果與轉錄體資料不符。為了取得更有說服力的結果與資料，對另外兩批紅龍果RNA樣品進行定序，並結合之前的定序資料重新建構轉錄體。根據不同處理之間的基因表現量的變化和皮爾森相關係數，建構出基因網絡圖。PiVX感染網路圖的初步分析揭露數個與離層酸相關的基因被負調控，而參與在吉貝素訊息傳導路徑的基因也發現被調控；暗示PiVX感染可能會影響吉貝素訊息傳導路徑，並抑制離層酸訊息傳導路徑。CVX感染網路圖所包含的基因數量遠高於PiVX，其中幾個已被報導的potexvirus寄主因子與主要目標基因也在其中，但他們在CVX感染中扮演的角色仍待探討。CVX和PiVX感染的紅龍果網絡共享38個基因，其中heat shock transcription factor A2 (HSFA2.2)、outer membrane tryptophan-rich sensory protein-related gene (TSPO)和phytochrome interacting factor 3 (PIF3)的基因表現量皆顯著低於對照組，但這些基因對CVX與PiVX感染的貢獻仍屬未知。總而言之，本研究為我們解析CVX和PiVX感染如何影響其寄主紅龍果，提供了基礎資料與未來研究方向。
- 學位論文
蟲草屬類群(Cordyceps-like)真菌廣泛地作為藥用用途或食品添加劑，在中華歷史及西藏中草藥文化中，作為珍貴藥材享譽盛名。一般而言，蟲草屬類群真菌可透過以下特點與其他真菌進行區分:柄狀子囊座、子囊殼排列方式、子囊的形態特徵及寄主。臺灣有關蟲草屬(Cordyceps)真菌之相關研究屈指可數並零星散佈於歷史文獻中。蟲草屬真菌能產生各式生物活性物質，例如: 蟲草素(Cordycepin)、腺苷(Adenosine)和各種酵素，也因此蟲草屬真菌常作為增能劑與民俗藥物，在傳統中醫學中更被認為有利於癌症與糖尿病的治療。本研究目的有三: (一)依據形態與親緣演化評估台灣地區之蟲草屬真菌之自然分類地位。(二)透過高效液相層析儀探討台灣蟲草屬真菌之菌絲溫水萃取液之蟲草素與腺苷含量。(三)比較台灣地區新採集之蟲草屬真菌與市面商用菌株之蟲草素與腺苷含量。研究期間，於臺灣各處採集共獲59株蟲草屬菌株，並於採後進行形態構造紀錄。利用單對與合併的基因序列片段(nrLSU、ITS、tef1-α、rpb1、rpb2)進行親源演化分析並評估自然分類地位。結合親源演化分析與形態鑑定，共發現七種蟲草屬新種(Cordyceps sp. nov. 1–7)與四隻蟲草屬新紀錄種(C. blackwelliae、C. lepidopterorum、C. jakajanicola與C. rosea)。同時，我們還描述了C. rosea完整世代的型態。高效液相層析結果表示所有新採集之蟲草屬菌株皆會產生腺苷。然而，只有三種蟲草屬真菌具有產生蟲草素的能力，分別為C. militaris、Cordyceps sp. nov. 4 (NTUCC 18-144)與Cordyceps sp. nov. 7 (NTUCC 18-145)。此外，我們的結果指出新採集之C. militaris (NTUCC 18-120) 比市售菌株具有更強的蟲草素生合成能力。
- 學位論文
蟲草素(cordyepin)屬腺苷異構物，於1950年初次自北蟲草分離，並被視為北蟲草中可抑制癌細胞生長之主要化合物。蟲草素之生合成雖已被報導與抑制腺苷脫氨酶之化合物噴司它丁有關，然而其上游代謝路徑仍有待進一步探討。此外，蛇形蟲草屬(Ophiocordycipitaceae)，包含西藏蟲草及臺灣蟲草之蟲草素生合成路徑，因基因差異性，目前依然未知。本研究選出五種不同生長階段之北蟲草，包含固態菌絲體、菌液、與米基上初步轉色之菌絲體、發育中及老化之子實體，結合轉錄體及代謝體學探討蟲草素生合成在生長過程中之分子機制，並發現精氨酸(arginine)在其中扮演重要角色。我們也發現北蟲草菌絲體在經過近紅外光處理後能顯著提升蟲草素產量，並同樣進行了轉錄體分析，更再次驗證精氨酸對於蟲草素生成之重要性。同時，本研究將先前利用次世代定序完成的臺灣蟲草全基因序列針對北蟲草中存在已知的蟲草素生合成相關基因進行比對，發現僅存在一段與北蟲草中cns4相似之片段。另一方面同步進行長片段定序技術(結合次世代定序及三代定序)，將臺灣蟲草再次進行長片段定序，提供更完善的全基因序列。本研究結合包含基因體學、轉錄體學及代謝體學之研究應用於探討蟲生真菌中蟲草素生合成路徑，為未來藥理功能開發及應用上建立完善基礎。