臺灣大學畜產學研究所學位論文
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泌乳素基因家族諸多成員之中，proliferin (PLF)為其一員，主要功能為幫助小鼠懷孕時期胎盤與子宮的正常發育。PLF屬醣基化蛋白質，其表現受生長因子之調控。PLF擁有不止一種接受體，cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-MPR)為已知之接受體，其餘PLF接受體基因尚未被發現。PLF本身為基因家族，有4個家族成員。PLFs相關研究多將焦點放在胎盤與表皮組織，然而，尚有許多其他組織表現PLFs。至目前為止，尚無文獻討論到PLF與腦部的關係。本研究的目的在於探討小鼠腦部之PLF表現與其可能之功能。我們首先發現PLF mRNA表現在成年ICR小鼠之全腦組織中。接著分析發育過程小鼠全腦組織之PLF mRNA表現量，試驗結果顯示小鼠胎兒時期與成年時期腦組織有較高之PLF mRNA表現量，而新生兒時期的表現量相對地較低。分析小鼠繁殖過程全腦組織PLF mRNA表現量的變化，發現分娩當天有較低的表現量。利用診斷式PCR分析小鼠全腦組織所表現的PLF基因家族，發現PLF1和PLF3 mRNA為主要的PLF基因家族成員，無PLF2和PLF4 mRNA表現。小鼠全腦組織的基因選殖試驗中，我們獲得了PLF1、PLF3以及PLF1(-exon3)的cDNA序列，DNA定序結果顯示全腦組織確實有PLF mRNA表現。Neuro-2a是一個來自於成年小鼠腦部的神經母細胞瘤細胞株，以RT-PCR分析其mRNA發現有PLF與CI-MPR基因表現，而PLF基因家族以PLF1、PLF3和PLF4為主。在短暫轉形感染與細胞免疫染色試驗中，發現外源性PLF1蛋白質能表現在Neuro-2a細胞之內質網。觀察細胞外形，表現外源性PLF1之Neuro-2a其細胞表面具有明顯之微絨毛構造。依據本研究結果，我們推測腦部PLF表現可能受到bFGF與糖皮素的調控，於不同腦部發育時期參與神經母細胞之分化。
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本研究旨在將分別由本土水牛瘤胃真菌及牛糞便中分離出之纖維素分解酶（cellulase）、植酸分解酶（phytase）基因與由豬胰臟選殖出之具組織特異性的胰澱粉酶基因啟動子（pancreatic amylase promoter）構築而成的轉殖基因（pAMY-CEL、pAMY-PHY），藉由基因顯微注射及胚移置的技術，產製攜帶有該基因之轉基因小鼠與轉基因豬，冀望達到改進家畜對飼料中纖維素與有機磷的消化與利用，並增加生長效率、減少排泄物，進而達到環保與提升農民收益的最終目標。 在轉基因小鼠產製之試驗中，合計完成267個小鼠原核胚之基因顯微注射，其中245個經基因注射後外表完整且初步判定存活之小鼠胚，分別移置於10隻受胚母鼠，待懷孕期滿後陸續產下合計63隻仔小鼠。離乳後僅存活57隻，分別剪取尾巴組織抽取基因組DNA（genomic DNA）進行聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction）及南方吸漬法（Southern blot）分析，證實其中4隻小鼠確係帶有pAMY-CEL基因者；有6隻小鼠確係帶有pAMY-PHY基因。待此等轉基因小鼠發育達性成熟後，除與具生育力之ICR雄性或雌性小鼠進行配種，以瞭解轉殖基因小鼠的性腺傳承外，並同時收集其排泄物，進一步分析其對纖維素與有機磷的消化利用情形。 在轉基因豬產製之試驗中，合計完成145個豬原核胚之基因注入，其中138個業經完成基因注射後外表完整且存活之豬胚，並移置於6頭發情同期化之受胚豬後，合計獲得13頭仔豬出生；經分別抽取其基因組DNA進行PCR反應及Southern blot分析結果，證實其中5頭(3♀ /2♂)仔豬確係帶有pAMY-CEL基因者；2頭(1♀ /1♂)仔豬確係帶有pAMY-PHY基因。其中除編號Tg 13-2雌性仔豬不幸於出生後第10日即告夭折外，目前均已發育迄保育階段，刻正期待達性成熟，並分別與生育力正常之非轉基因豬完成配種，俾進一步分析確認轉殖基因在性腺之傳承效率，及其對纖維素與有機磷的消化利用情形。
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本試驗旨在研究小鼠鋅指蛋白-1基因 (mouse zinc finger gene-1, mZFG-1) 在雄性可能扮演之生理功能。鑑於前人的研究證明短暫阻斷 mZFG-1S 之表現，即可嚴重影響小鼠胚之埋殖前發育，因而增加該基因調控機制相關研究之困難度；本研究乃先針對 mZFG-1L cDNA 全長設計一長度為 926bp 之反義去氧核醣核酸序列 (antisensesequence)，並將之構築於接受蛻皮素 (ecdysone) 誘導調控基因表現之載體中，進一步將此表現載體及調節載體 (regulator vector) 截切後，經純化隨即進行小鼠原核顯微注射 (pronuclear microinjection)，從而產製出可經由蛻皮素誘導該轉殖基因表現之雙轉基因小鼠，試驗結果證明共出生 66 隻仔小鼠，經應用聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 及南方吸漬法 (Southern blot analysis) 皆證實有四隻係帶有雙轉基因者；此等雙轉基因小鼠經篩選及繁殖後，對施打誘導劑 ponasterone A 之成年雄小鼠進行 RNA、蛋白質萃取及冷凍切片，結果顯示經誘導表現反義核苷酸者之睪丸中，mZFG-1L 基因表現量的降低會造成生精細管中精子數目減少，此結果顯示 mZFG-1 鋅指蛋白在成年雄小鼠的生精 (spermatogenesis) 過程中可能扮演一重要的角色。 進一步試驗經由RNA干擾 (RNA interference, RNAi)、二維膠體電泳 (two-dimensional polyacryamide gel electrophoresis, 2D-PAGE) 及質譜分析策略，探討 mZFG-1 表現量遭受 siRNA 干擾後，對於睪丸賽透力氏細胞 (Sertoli cell) 及萊迪吉氏細胞 (Leydig cell) 中下游基因表現之影響；試驗結果發現在賽透力氏細胞株中，兩個和生殖內分泌及生精作用有關之蛋白 Crisp-1 (Cysteine-rich secretory protein-1) 及 NPY (Neuropeptide Y) 會受 mZFG-1 的正向調控，即 mZFG-1 的表現量降低時兩者的表現量亦隨之下降，由於已知 Crisp-1及 NPY 為維持雄性正常生殖作用所不可或缺者；故初步試驗結果顯示，mZFG-1在睪丸中可能透過直接或間接的調控 Crisp-1 及 NPY 的表現而維持雄性小鼠正常的生精作用；此蛋白質體分析得到的結果與轉基因鼠發生的現象頗相契合，惟詳細的機制仍待進一步的探討。
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泌乳素瘤（prolactinoma）為一常見的腦垂體腺瘤，主要症狀為腦垂體分泌過量泌乳素（prolactin，PRL）。在治療上常使用的藥物為bromocriptine，一種多巴胺D2接受體（dopamine D2 receptor）的促進劑，在研究報告中指出bromocriptine可以引起大鼠腦垂腺瘤細胞株（GH3）的計畫性凋亡，但其機制尚未明瞭。 泌乳素可以調控乳腺發育，而乳腺是哺乳動物一生中少數能經歷數次細胞增殖及退化的組織，若其發育的調控機制不正常，會導致上皮細胞增生及癌化。以雜合扣除法（subtractive hybridization）自正常乳腺上皮細胞扣除癌化乳腺上皮細胞，可以發現caveolin-1基因。Caveolin-1在乳腺細胞中可以抑制經由泌乳素所引起的乳腺發育及泌乳，但在相同會受到泌乳素刺激的腦神經細胞所扮演的角色則尚不清楚。本試驗利用大鼠腦垂腺瘤細胞株GH3進行caveolin-1在腦中的弁酮膍s。以RT-PCR技術檢測GH3及小鼠大腦組織caveolin-1 mRNA，發現二者皆有表現caveolin-1，而前者caveolin-1 mRNA表現量較後者少。自小鼠大腦組織選殖caveolin-1基因序列，並將caveolin-1及EGFP序列分別架構在含有CMV promoter載體上，再將其轉型到GH3細胞株。在轉型48小時後，GH3細胞表現外源性caveolin-1，其細胞呈現萎縮形態且其細胞核呈現計畫性死亡的核體分解現象；但表現EGFP的細胞仍維持正常形態。以治療泌乳素瘤使用的藥物bromocriptine處理GH3細胞，在處理24小時後，GH3細胞會進行計畫性死亡，且細胞內caveolin-1的mRNA表現量增加。綜合以上研究證明大量表現caveolin-1可導致GH3細胞計畫性凋亡，並推測caveolin-1的弁鉬P腦垂體腺瘤生成及抑制其生長有關。
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血管緊縮素轉化酶 ( angiotensin converting enzyme；ACE ) 為人 體調控血壓之重要酵素，在臨床治療上，抑制ACE的活性可治療高血壓。本試驗之目的有二：其一，試驗酒精發酵乳克弗爾抑制ACE之體外試驗；其二，將源於牛β-酪蛋白之ACE抑制肽以基因工程表現於大腸桿菌。 試驗一：將克弗爾粒分別接種於牛乳及羊乳中，試驗其於發酵期間、4℃貯藏期間、熟成條件及固形物添加對ACE抑制能力之影響。試驗結果顯示，牛及羊乳克弗爾於發酵期間之ACE抑制能力皆不佳，但是在貯藏期間兩者之ACE抑制能力皆有提升。發酵完畢後保留克弗爾菌元做不同時間的熟成，再貯藏於4℃，發現兩者之ACE抑制能力較未熟成者強效，且羊乳克弗爾於發酵3天後再貯藏3天時具最強效之ACE抑制能力。 試驗二：將源於牛β-酪蛋白之ACE抑制肽FFVAP以合成基因之方式表現於大腸桿菌。所合成之基因以轉譯為兩個FFVAP為目標設計，且以自行接合之方式將合成之基因單體串成多倍體。將多倍體基因構築於質體pQE31中後轉形至大腸桿菌DH5ㄐA並以聚合酶連鎖反應做轉形株之篩選及倍數之判斷。結果顯示，本試驗成朮c築可轉譯兩及三個ACE抑制肽FFVAP之重組質體，並轉形至表現宿主大腸桿菌M15[pREP4]中。
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菜鴨（Anas platyrhynchos var. domestica）為台灣主要產蛋鴨之品種，產蛋率非常高。欲維持高產蛋率則需要有極高的脂質新生合成作用以提供蛋黃堆積所需。固醇調節因子結合蛋白(sterol regulatory element binding pretins, SREBPs)可能參與調控肝臟脂質生成相關基因的表現，而脂質生成的能力則直接影響蛋黃脂質的堆積。在哺乳動物中，SREBP1與2能調控脂肪酸與膽固醇合成相關基因，但在家禽方面，SREBP1與2基因的表現以及其與脂質代謝的相關性則未見研究。在產蛋家禽脂質利用扮演重要角色的極低密度衍脂蛋白-II（very low density apolipoprotein-II, apoVLDL-II）在菜鴨也未被研究。本實驗之目的在選殖菜鴨SREBP 1、SREBP2、脂肪酸合成酶（FAS）、3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）及apoVLDL-II五個與脂質新生合成及利用相關基因，並探討其在菜鴨體內組織及產蛋前後表現，以期增進對產蛋菜鴨脂質代謝相關基因表現的了解。 試驗以30隻菜鴨為材料，15隻在產蛋前（18週齡）犧牲，另外15隻則在產蛋高峰時（整群產蛋率達80%）犧牲。菜鴨在犧牲後立即採取腹部脂肪、心臟、肝臟、骨骼肌及卵巢組織，並儘速以液態氮冷凍隨後貯存於-80℃。萃取組織RNA後進行反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR），選殖出菜鴨SREBP 1、SREBP2、FAS、HMG-CoA reductase基因片段，此外並在菜鴨肝臟全長cDNA基因庫中篩選出菜鴨apoVLDL-II之全長cDNA。經序列分析後發現菜鴨SREBP1、SREBP2、FAS及HMG-CoA reductase基因與蛋雞有高度之同源性，顯示兩物種間有高度的演化遺傳關聯性。而菜鴨之apoVLDL-II基因全長與蛋雞和鵪鶉的相似度分別為87%與82%。以北方吸漬分析法分析各基因在菜鴨的組織中表現結果顯示SREBP1 mRNA可以在脂肪組織、心肌、骨骼肌、肝臟及卵巢中表現。SREBP2 mRNA濃度在肝臟與卵巢中較其他組織都為高。FAS與HMG-CoA reductase mRNA在肝臟中大量表現而其他組織則較少。apoVLDL-II mRNA則只在肝臟中測得，其他組織檢測不到。試驗中亦發現，產蛋高峰與產蛋前菜鴨肝臟中SREBP1、SREBP2及FAS mRNA表現量並無明顯差異。然而，產蛋高峰菜鴨肝臟中HMG-CoA reductase 與apoVLDL-II mRNA的表現量顯著高於產蛋前菜鴨。試驗結果顯示產蛋可能會對特定脂質代謝的途徑造成影響，尤其會影響與蛋黃組成分堆積相關的apoVLDL-II及HMG-CoA reductase。而在基因表現差異實驗中發現，菜鴨在開始產蛋後肝臟內部分與卵黃形成及脂質代謝利用相關基因會大量表現，尤其是vitellogenin與apoVLDL-II等與卵黃脂質堆積有密切關係的基因。這些選殖到的基因仍需經進一步的確認其在產蛋前後表現上的差異，而試驗中另亦選殖到釵h新穎的基因，其參與產蛋機能的角色亦待進一步的探討。
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本研究主要在了解台灣休閒牧場的投入背景與經營現況，以明瞭在台灣畜牧型休閒農場的經營可行性，及分析不同種類間休閒牧場的重要關鍵成它]素；並以個案研究方法探討某農場的遊客至該農場遊憩體驗的因素、動機及滿意度與認知落差之相關性，並評估個案農場的經營成效。 結果顯示，以四家調查農民的動機類型中皆為多重投入動機類型，最初投入 動機明顯受到畜牧業養殖背景所影響，而與教育程度是否與農業無關。農戶投入畜牧型休閒農場的決策過程具有個別性差異，調查每家休閒牧場皆無因開放休閒經營後改變消毒防疫措施。大部分為自己摸索技術或知識，並仰賴顧客的口碑宣傳。本研究將調查農場分成「綜合體驗型」和「生活體驗型」兩類，分析所面臨的產業環境大致有產品線廣度、土地規模、區位條件、產品主題特色、農場整體規劃設計、活動企劃執行、服務人員態度及衛生防疫維護，共八項基本要素。 以生產力調查分析金雞蛋休閒牧場，休閒化經營後雖使生產率受到影響，略低於一般的產蛋率，但以設計體驗活動導入遊客遊憩，反增加10倍以上收入。此外遊客的問卷分析顯示，在遊客的動機需求方面最主要為「遠離人群，接近大自然」及「促進與同伴相處機會」二項，遊客的人口統計變數中的「教育程度」與「年齡」對遊憩動機的影響有顯著差異。遊客獲得的體驗內容主要為「增進朋有與親子感情」、「鬆弛精神」二項。 在研究之假設驗證中顯示：遊客在認知體驗上的期望與實際知覺有顯著正相關存在，遊客體驗與遊客的遊憩動機間亦有顯著性的相關性，且對遊客滿意度的影響亦有顯著的直接效果；但遊憩體驗對遊客重遊意願間的預測力並不顯著，但因為遊客滿意度與重遊意願有顯著性的直接效果之影響，所以遊客體驗會透過滿意度而對重遊意願產生出間接性的影響效果。最終遊憩動機與遊客滿意度均會對遊客重遊意願有直接的顯著影響，且遊憩動機與遊憩體驗兩項均會透過遊客滿意度而對遊客重遊意願產生顯著的影響效果。
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本試驗目的，在於探討不同濃度的鋅與色胺酸飼糧，對雞隻表現之影響，以及鋅和色胺酸在雞隻體內交互作用的關係，用以改善家禽對鋅的利用，提升童子雞的飼料利用效率及生產效率。試驗採3×3複因子設計，飼糧中鋅與色胺酸含量，各分別為低、中、高三個變級，共九種飼糧，中等含量者符合NRC(1994)之需要。試驗1基礎飼糧組成以酪蛋白、玉米與明膠為主，試驗2、3與4則以脫殼大豆粕取代酪蛋白。試驗1的低鋅與色胺酸含量分別為19.3 ppm及0.15%，而試驗2至4則為20.1 ppm及0.13%。中、高等級鋅與色胺酸之飼糧，分別於基礎飼糧中添加40、80 ppm的鋅及0.15及0.30 %的色胺酸，使符合試驗設計。試驗期間，飼糧與飲水均任食，試驗至三週齡結束。試驗的第15天起，連續3天，進行全糞收集，以測定鋅的表面代謝率。試驗結束時，進行心臟採血，以便分析血清中之鋅與色胺酸含量。試驗期間並觀察羽毛的生長狀況。雞隻採血後行頸椎脫臼犧牲，取其左腿脛骨，以備分析骨骼生長性狀。 結果顯示，餵飼低色胺酸的雞隻，其三週齡增重及攝食量，均明顯較餵飼含適量及高色胺酸含量為低。低鋅組之生長雞，其增重表現並不一致，飼糧鋅與色胺酸沒有交感效應。童子雞的飼料利用效率，不受飼糧的鋅與色胺酸含量影響。鋅的表面代謝率與血清鋅含量，顯著受到飼糧的鋅含量影響，餵飼高鋅飼糧的雞隻，其鋅的表面代謝率顯著的較低，而血清鋅含量，則較餵飼含適量及低量鋅者為高。血清色胺酸含量以餵飼低色胺酸飼糧者較低。雞隻的脛骨重量及脛骨鋅濃度，受飼糧的鋅含量影響。童子雞三週齡時的羽毛發育，受到飼糧的鋅與色胺酸含量的影響，當飼糧的鋅或色胺酸含量低，羽毛的生長較含適量及高量者為差。飼糧的色胺酸含量，並不影響童子雞的鋅表面代謝率。
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本研究藉由解剖十隻（三雌七雄）死亡之台灣穿山甲（M. pentadactyla pentadactyla），測量其體長、舌長及腸道長度，並記錄其體重、胃重及頷下腺重量，計算上述臟器之長度比例與重量比例，以瞭解其消化道之特色。 另利用三氧化二鉻（Cr2O3）作為飼糧在消化道中停留時間之標記，來進行基礎飼糧在穿山甲消化道中之表面消化率試驗，以瞭解基礎飼糧中乾基、粗脂肪、粗蛋白、灰分與總能之表面消化率，並研究添加幾丁質與幾丁聚醣對飼糧營養成分消化率之影響，藉以調整飼糧之組成，改善圈養之效果。 將四頭健康且體重相當之台灣穿山甲，由混養欄舍移入個別飼養籠中，並給予7天適應期。每日下午5點給飼，給飼量為40公克飼糧/公斤體重，飲水任食。試驗一：為期四個月記錄四隻穿山甲之每日採食量與每週體重變化，收集飼糧並分析其乾基含量，以瞭解其乾基採食與體重變化之關係。試驗二：於第7天添加1％三氧化二鉻於飼糧中，記錄糞便中出現綠色三氧化二鉻之日期，推算飼糧在消化道中之停留時間。此外，消化試驗為期30天，每天記錄個別穿山甲之採食量，並採集飼糧樣品與全糞樣品，進行表面消化率之計算。試驗三：利用六隻穿山甲，以拉丁方設計測試三種不同飼糧之表面消化率：（1）基礎飼糧（2）基礎飼糧添加5％幾丁質（3）基礎飼糧添加5％幾丁聚醣，藉以瞭解添加幾丁質與幾丁聚醣對表面消化率之影響。 結果顯示：（1）穿山甲成體之腸道約為體長9倍，就腸道消化特性而言，相近於雜食性動物。（2）穿山甲每日之乾基採食量為39∼71公克，每日採食能量為282.54∼353.18 Kcal。（3）基礎飼糧在穿山甲之消化道中停留時間約為24∼48小時，最遲60小時會被排出。（4）基礎飼糧乾基、粗脂肪、粗蛋白、灰分與總能之表面消化率（％），分別為88.8 ± 1.0、95.9 ± 0.9、86.4 ± 1.6、68.0 ± 5.6與91.0 ± 1.1。（5）幾丁聚醣之添加會造成穿山甲拒食，故不適宜添加於穿山甲飼糧中。（6）幾丁質會顯著降低乾基、粗蛋白、灰分及總能之表面消化率（p＜.05），縮短飼糧於消化道之停留時間及改善糞便性狀。
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本試驗擬以褐藻酸鈉作為微膠囊之囊壁材質，包覆原生菌元(Lactobacillus acidophilus、Lb. casei、Bifidobacterium longum及B. bifidum)，並添加益菌質 (肽類、果寡糖、異麥芽寡糖) 於囊壁中，期望藉由反應曲面法 (Response Surface Methodology, RSM) 及最佳化方法探討褐藻酸鈉及益菌質之濃度對微膠囊原生菌之包覆菌數及耐酸性的影響，並尋求最佳囊壁材質之組合。試驗中以褐藻酸鈉、肽類、果寡糖及異麥芽寡糖之添加濃度為變因 (factor)，而微膠囊之包覆原生菌數及經模擬胃液處理後存活菌數則為反應性狀 (response)，以反應曲面法中Box Behnken Design之四因子三階次試驗設計，共得30個實驗組，因組數太多而分為3個區集 (block) 進行，實驗結果以Design-Expert軟體建立最適方程式，再經由遺傳演算法 (Genetic algorithm, GA)、序列二次規劃法(Sequential quadratic programming, SQP) 與反應曲面法中之陡升法 (Steepest ascent method) 尋求褐藻酸鈉及益菌質之最佳添加比例。 結果顯示，在貯存0週時褐藻酸鈉及異麥芽寡醣之最佳添加量隨肽類及果寡醣用量增加而減少，推測肽類及果寡醣有助微膠囊成形而降低褐藻酸鈉之需要量，而在貯存1、2週方面，褐藻酸鈉及異麥芽寡醣之推薦添加量則逐漸增加。以遺傳演算法及序列二次規劃法獲得之褐藻酸鈉及益菌質推薦添加量，於貯存第0、1、2週均相同，肽類及果寡醣均推薦添加3%，褐藻酸鈉及異麥芽寡醣之推薦添加量在貯存0週時分別為1%及0%、貯存1週時為3%及0%、貯存2週時為3%及3%；而陡升法之搜尋結果則與SQP及GA不同。將上述三種最適化方法之最適化推薦組以實驗進行驗證，結果顯示在未經過模擬胃液測試的菌數預測值，與實際實驗值間均無顯著差異 (P＞0.05)，表示三種最適化方法在此部分均達到最適化的效果。若經過模擬胃液測試，則只有遺傳演算法與序列二次規劃法對貯存0週之雙叉乳桿菌部分及陡升法對貯存1週之乳酸桿菌、雙叉乳桿菌部分的預測值，與實際實驗值之間沒有顯著差異，其餘均有顯著差異；但即使經過模擬胃液處理，各驗證組之存活菌數仍能維持7~8 log CFU/ml，其中貯存2週並經模擬胃液處理之雙叉乳桿菌存活菌數，甚至出現實際實驗值高於預測值之現象。 將最適化推薦組經12週貯存試驗後發現，原生菌微膠囊以蒸餾水貯存時，最適化推薦組之存活菌數下降程度顯著低於無添加益菌質之對照組，而經過模擬胃液及膽鹽測試後，亦顯示益菌質可能對微膠囊化原生菌受模擬胃液及膽鹽傷害的情形有所改善，且以冷凍乾燥貯存之微膠囊也具有相同情形。觀察顯微構造則發現，褐藻酸鈉濃度較高時，微膠囊顆粒較大而圓，表面構造較細緻，內部孔洞較小而少，整體結構較緻密。 綜觀上述結果，隨著貯存時間增加，增加褐藻酸鈉及益菌質的濃度有助於提升微膠囊結構之穩定、所包覆原生菌之存活菌數，以及原生菌對模擬腸胃道環境之耐受性。