國立臺灣大學食品科技研究所學位論文/Institute of Food Science and Technology
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憂鬱症為全球最嚴重的精神疾病之一，其中重鬱症（Major depressive disorder, MDD）更會造成人類的失能，世界衛生組織（World Health Organization, WHO）預測MDD將於2030年成為全球失能疾病第一名。然而，現行治療憂鬱症的藥物經常帶來許多副作用，因此，發展預防憂鬱症或其替代療法則為一重要課題。天麻（Gastodia elata blume, GE）為用於安神寧腦的傳統中藥材，過去研究證實天麻具有神經保護、抗癲癇與抗憂鬱的功效。本研究以強迫游泳試驗（forced swimming test, FST）誘發大鼠類憂鬱症後，利用糖水攝取試驗（sucrose consumption test, SCT）了解經FST誘發後大鼠是否具有快樂感降低的症狀（anhedonia），並利用二維膠體電泳與膠片分析軟體探討經天麻水萃物（water extract of Gastrodia elata blume, WGE）給予後，大鼠大腦組織（額葉皮質、海馬迴與紋狀體）中蛋白質層面的變化，搭配質譜儀與蛋白質身份資料庫（Uniprot）鑑定蛋白質身份，再以系統生物資訊軟體（Metacore™）與資料庫配對探討天麻水萃物抗憂鬱的可能機制路徑，最後利用西方墨點法（Western blotting）驗證系統生物資訊軟體的結果。結果顯示，經過FST的大鼠，其糖水攝取量顯著較正常組與其前兩週低，顯示FST確實會引起快樂感降低的症狀。蛋白質體學結果發現，於額葉皮質（frontal cortex）、海馬迴（hippocampus）與紋狀體（striatum）分別有43、68與23個蛋白質具有顯著差異，進一步以質譜儀鑑定與資料庫比對，額葉皮質與海馬迴各有30與43個蛋白質身份被鑑定。在系統資訊軟體配對結果顯示，天麻水萃物抗憂鬱的機制可能與Slit-Robo pathway、neuronal cytoskeleton remodeling相關。西方墨點法的結果顯示，給予天麻水萃物後，額葉皮質的Slit-1、Slit-2、RhoA有顯著下降，CRMP-2、profilin-1有顯著增加，在海馬迴中Slit-1、RhoA有顯著下降，CRMP-2與 profilin-1有顯著增加，此與二維膠體電泳、系統生物資訊軟體的結果相符。綜合以上結果，天麻水萃物可能是透過Slit-Robo pathway機制或neuronal cytoskeleton remodeling 並增加神經可塑性而達抗憂鬱的效果。
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芋頭為主要糧食作物之一，富有良好的營養素，其相關製品有許多，但以益生菌發酵者卻相當少見，而益生菌發酵製品，長久以來提供人類許多良好的機能性，故本研究以Lactococcus lactis Lab5、Lactobacillus plantarum BCRC 11697、Bifidobacterium bifidum BCRC 14615、Bifidobacterium longum BCRC 14634與添加不同濃度的紅糖分別發酵芋頭，以期擴展芋頭的食用效益與功能性。實驗第一部分於芋頭中不添加或添加1.5%、3 % 紅糖發酵，探討 24小時發酵期間乳酸菌數、pH值、可滴定酸度變化，實驗結果顯示芋頭基質中添加1.5% 紅糖發酵的菌數可達8.95 ± 0.06 log CFU/mL，發酵過程中pH值也隨時間而下降，顯示芋頭中添加1.5% 紅糖發酵者，對於益生菌的生長有良好之影響，發酵期間的可溶性固形物、總糖、還原糖含量、黏度、顏色特性，亦因發酵後具有顯著差異 (p<0.05)。第二部分則以不同溶液萃取益生菌最適發酵芋頭產物中的有效成分，無論是何種萃取方式，總酚與類黃酮含量因發酵後而提高，其中分別以50%的甲醇萃取液、水萃取液含有較高的成分濃度，抗氧化活性分析方面，DPPH自由基清除能力、亞鐵螯合能力、抗維生素C的自氧化能力、總還原力及總抗氧化能力也皆因發酵後有所提升，並顯著高於未添加菌株發酵的芋頭基質 (p<0.05)，但是在不同的萃取溶劑種類中，對於抗氧化能力的最佳效益亦有影響。另外，結腸癌細胞株HT-29與Lb. plantarum BCRC 11697、B. bifidum BCRC 14615發酵芋頭產物共培養48小時後，細胞存活率顯著性地下降，顯示益生菌發酵芋頭產物具有抑制癌細胞生長。在喜好性品評中，以Lb. plantarum BCRC 11697發酵的芋頭製品，調整糖酸比後具有最佳的整體接受度。
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糖尿病是一種體內葡萄糖恆定失調的代謝性疾病，主要由於胰島素分泌或胰島素作用有缺陷，而影響血中葡萄糖進入肝臟、肌肉及脂肪等組織所引起的高血糖。脂肪與肌肉細胞皆為受胰島素調控來維持血糖恆定的主要組織。文獻指出，週邊組織攝入葡萄糖，對於血糖的恆定及清除餐後血糖是很重要的步驟。因此，評估細胞的葡萄糖攝取能力，在糖尿病相關研究中，扮演一個很基礎的角色。羅漢果的食用、藥用價值已有很悠長的歷史。除了甜味的特性之外，研究也發現羅漢果在體內與體外試驗中，均具有降血糖之活性。因此本次實驗目的為利用3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取試驗為篩選模式，找出羅漢果中可能具有降血糖活性之成分。結果顯示，羅漢果粗萃物能夠顯著提升脂肪細胞的葡萄糖攝取量，且具濃度效應。將粗萃物依極性區分後，發現以乙酸乙酯層的效果最佳。更進一步將乙酸乙酯層利用管柱層析分離後，在其次區分層中分離出S1、S2與S3；此三個樣品皆能顯著增加脂肪細胞的葡萄糖攝取能力。當單純以樣品處理時，S1具有最好的效果，然而與胰島素共同處理下，S1則降低了胰島素的活性。經由西方點墨法分析，發現S1本身可增加Akt磷酸化；S2的促進效果同時存在於單獨處理與有10 nM胰島素刺激的狀況。綜合以上結果，推測S1具有類似胰島素之作用，S2應有協同胰島素作用之活性。
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蕎麥 (Fagopyrum esculentum Moench) 含有豐富的營養成分。研究指出蕎麥含有多種抗氧化成分，如芸香苷 (rutin)、槲皮素 (quercetin)等酚類化合物與類黃酮物質，具有抗氧化、抗腫瘤等作用。益生菌 (probiotics) 已被證實，具有加強免疫調節，降低腸道中有毒物質、致突變物的反應及降低腸癌發生率等有益人體健康之功效。因此，本實驗以不同乳酸菌發酵蕎麥種子與發芽蕎麥，評估其甲醇萃取物是否能抑制大腸癌細胞株增生及抑制4NQO誘導人類腸道細胞株Int-407細胞毒性之能力。本實驗以L. acidophilus BCRC 14079、L. casei 01、L. plantarum BCRC11697、L. rhamnosus GG BCRC 16000、B. infantis BCRC14602、B. longum BCRC14634做為發酵菌酛，結果顯示，六株乳酸菌發酵不同發芽天數之蕎麥芽，在乳酸菌菌數、pH值和可滴定酸含量方面，發芽五天之蕎麥芽為其最適利用之發酵基質。以發芽五天之蕎麥與未發芽蕎麥種實作發酵基質，結果顯示發酵蕎麥芽萃取物在總酚、總類黃酮含量及抗氧化能力均顯著高於未發芽之發酵蕎麥，並且在抑制大腸癌細胞株HT-29增生方面，以L. casei 01發酵蕎麥芽萃取物 (600 μg/mL) 在24及48小時處理下，最低可顯著使HT-29 之存活率分別65.8% 及 48.6% 。之後，利用抗致突變劑4NQO誘導人類腸道細胞株Int-407產生細胞損傷，結果發現L. casei 01發酵蕎麥與蕎麥芽萃取物可顯著提升細胞株之存活率，其中以200 μg/mL之發酵蕎麥芽萃取物效果最佳。利用彗星電泳法評估L. casei 01發酵蕎麥與蕎麥芽萃取物降低4NQO誘導Int-407產生細胞損傷及基因毒性之效果。進一步以分段式預反應，探討萃取物抗細胞毒性機制。以L. casei 01發酵蕎麥與蕎麥芽之萃取物可降低4NQO誘導Int-407細胞之基因毒性。發現L. casei 01發酵蕎麥與蕎麥芽萃取物之抗細胞毒性機制主要為阻斷作用 (Blocking effects) 與生物抗細胞毒性作用 (Bioanticytotoxic effect)。
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近年來，許多學者探討乳酸菌產生之胞外多醣(exopolysaccharide, EPS)，對於健康有益。發炎性腸道疾病 (inflammatory bowel disease, IBD) ，可分為潰瘍性結腸 (ulcerative, UC) 和克隆氏症 (Crohn’s diease, CD)，為一種慢性腸道疾病，但其致病機制尚未明了。本研究使用 Lactobacillus plantarum BCRC 11697產生之胞外多醣來探討其對三硝基苯磺酸 (trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS ) 誘導成類似克隆氏症 (Crohn’s disease) 的動物模式中降低發炎之功效。結果顯示，餵食 EPS 或 L. plantarum BCRC 11697 菌株，再經過 TNBS 誘導成結腸炎，可明顯降低經 TNBS 誘導大鼠結腸炎後腸道出血現象和水樣便的發生，結腸短縮現象和脾臟腫脹現象也有所改善，而發炎指標骨髓過氧化酵素 (myeloperoxidase, MPO)、TNF-α 和 iNOS 表現量在經 TNBS 誘導後大量產生，代表有發炎的情況，而有餵食 EPS 或L. plantarum BCRC 11697 菌株，再經過 TNBS 誘導的組別，產量和表現量下降了，顯示發炎現象下降。而抗發炎細胞激素IL-10 可降低發炎的情況，檢測結果顯示，餵食 L. plantarum BCRC 11697 菌株再經 TNBS 誘導的組別其產生量較高。腸道氧化壓力有關的酵素 glutathione (GSH)，經 TNBS 誘導大鼠結腸炎後，其還原態的 GSH 氧化成 GSSH，代表腸道氧化壓力提高，而餵食 EPS 或 L. plantarum BCRC 11697 菌株，再經誘導的組別，其還原態 GSH 的量提高。由以上結果的得知 L. plantarum BCRC 11697 益生菌和其萃取出的胞外多醣，對於大鼠結腸有保護作用，可降低TNBS對於結腸的傷害，進而降低發炎的情形和腸道氧化壓力，故對於發炎性腸道疾病中的克隆氏症有改善現象，其中又以餵食 L. plantarum BCRC 11697 益生菌的效果較佳。
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本研究使用五味子 (Schizandra chinensis Baill.)、黃連 (Coptis chinensis)、番石榴葉 (Psidium guajava L. leaves) 與桑葉 (Morus alba L. leaves) 做為全新的調節血糖中藥複方，首先根據其抑制α-glucosidase能力、抑制DPP-4能力與抑制AGE形成能力 (in vitro) 並配合反應區面法 (response surface methodology, RSM) 尋找其較適配方，接著以動物實驗進一步確認該較適化中藥複方之調節血糖效果。反應曲面法結果顯示較適的調節血糖中藥複方之配方為五味子 (3000 μg/mL)、黃連(80 μg/mL)、番石榴葉 (374.56 μg/mL) 與桑葉 (480 μg/mL)。動物實驗結果則顯示以高熱量飼料餵食小鼠六週可成功誘導成為胰島素阻抗小鼠，而給予調節血糖中藥複方後，可顯著降低其任食血糖值，且在胰島素阻抗性試驗中，調節血糖中藥複方也可顯著降低血糖，以上結果指出此中藥複方調節血糖機制可能是因為其可改善胰島素阻抗性。高劑量中藥複方組的血清中果糖胺含量顯著低於高熱量對照組與正常對照組，也顯示出調節血糖中藥複方可改善中長期血糖值與降低糖尿病併發症發生的風險。此外在動物實驗中我們也發現此中藥複方並不會對於小鼠肝臟與胰臟造成傷害，也不會對於小鼠血漿中的脂質與脂蛋白含量有所影響。Berberine與1-deoxynojirimycin為可能的活性成分，其在中藥複方中的含量分別為4.7 ± 0.4與77.1 ± 1.1 μg/mL，此兩化合物的含量在未來可以當作大量生產時的品管指標。
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文獻指出葡萄柚精油（檸檬油烯）及薰衣草精油（沈香醛），以調控交感及副交感神經方式，達到抑制或增加大鼠食慾，此部分與NPY所引起的生理反應相似，故推測香氣成分能刺激或抑制嗅覺神經細胞分泌NPY，進而影響攝食行為。另一方面，由脂肪細胞所表現及分泌的瘦體素，則是調控攝食以及能量代謝的主要荷爾蒙，瘦體素與NPY為相互拮抗的關係。 本研究主要利用嗅覺神經細胞受到香氣刺激後，其NPY mRNA的表現，建立具有減少/增加食慾潛力的香氣篩選平台。培養2天的嗅覺神經細胞Rolf B1.T，以檸檬油烯及沈香酫處理之，發現刺激10分鐘的沈香酫，顯著增加嗅覺神經細胞NPY mRNA表現量，而刺激10分鐘的檸檬油烯，則具有相反的結果；此部分實驗結果與大鼠的初代嗅覺神經細胞，受到香氣刺激後的NPY mRNA表現量趨勢相同，故Rolf B1.T細胞株可以作為香氣篩選平台的試驗細胞株，藉此篩選具有潛力的香氣成分。 最後，以人體試驗的模式，探討具有調節食慾潛力的香氣成分，在不同試驗時間（5、10及15分鐘）對相關食慾因子（NPY、胰島素、瘦體素、食慾素A及食慾素B）的影響。實驗分別予以水、蘑菇醇、蒎烯、檸檬油烯以及沈香醛。結果發現，受試者在沈香醛10分鐘刺激後，顯著增加周邊血中血清NPY的濃度，而檸檬油烯，則能顯著減少血清NPY的濃度，因此，嗅覺神經細胞Rolf B1.T的NPY mRNA表現平台，能作為篩選具有潛力影響食慾的香氣成分，另外，比較香氣成分對其他食慾因子，如胰島素、瘦體素、食慾素A及食慾素B的影響。結果發現：1.蒎烯比蘑菇醇更具有調節食慾潛力，無論在5、10及15分鐘，蒎烯都能增加NPY的變化量，2.受試者在蒎烯刺激10分鐘下，胰島素、瘦體素、食慾素A及食慾素B的變化量為正，顯示蒎烯為具有促進食慾潛力的香氣成分。而生理指標部分，受試者的血壓及耳溫，無顯著改變。最後，10 min試驗組別的問卷結果，顯示食慾因子食慾素B、NPY可作為評估10分鐘香味刺激影響食慾因子的指標。
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2002年瑞典國家食品管理局 (The Swedish National Food Administration, SNFA)證實食品經高溫加熱後，含有高量的丙烯醯胺，引起各界關注。於1994年世界衛組織癌症研究署 (International Agency for Research on Cancer, IARC)將丙烯醯胺歸類為「2A-可能會造成人類癌症」的致癌物，顯示已有證據，證明實驗動物之致癌性，於人類則尚未有直接證據。已有其他研究指出丙烯醯胺具有神經毒、基因毒、生長發育等毒性。因此各國便開始調查食品中丙烯醯胺的含量，估算各年齡層經由飲食的暴露量，評估風險。另一方面，有許多學者投入研究丙烯醯胺的生成途徑、毒性、分析定量方法以及降低其生成之策略。生成丙烯醯胺的反應途徑主要為梅納反應，前驅物為天門冬醯胺與還原醣。本研究團隊發現市售黑糖丙烯醯胺含量為347-1107microg/kg，製作黑糖的原料為甘蔗汁，糖含量高，又含有天門冬醯胺等胺基酸，加上長時間熬煮，容易生成丙烯醯胺。本研究目的為尋求降低黑糖中丙烯醯胺之方法。本實驗以液相層析串聯質譜法 (liquid chromatography/ tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析黑糖中丙烯醯胺含量，利用m/z 72>55及同位素內標13C3-丙烯醯胺m/z 75>58定量，標準曲線R2可達0.99以上，回收率為101~104%。添加氯化鈣、氯化鎂、甘胺酸、半胱胺酸以及天門冬醯胺酶於甘蔗汁後製成的黑糖，可降低85%以上AA的生成，且具有濃度效應。就經濟成本評估，氯化鎂是較佳的選擇，期能給予工業生產製造參考。
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流行病學調查指出，過去二十年間，「異位性皮膚炎」的發生率及普及率在已開發國家大幅提升。已知此疾病的成因除了受基因調控外與西化的生活型態有密切關係，環境因子更是誘發此疾病的關鍵。研究顯示，體內正常的微生物菌叢在免疫調控與平衡上扮演重要的角色。由於衛生環境的改善、飲食習慣的改變以及抗生素廣泛使用等因素，大幅降低接觸外在微生物菌叢的機會，因此也提高了罹患免疫失衡疾病的機率。益生菌的免疫調節能力在動物與人體實驗上已被證實，但其調控的機轉仍待研究。本次報告內容是探討納豆菌（Bacillus subtilis var. natto）如何透過調控體內的免疫反應進而達到抑制臨床上犬異位性皮膚炎的症狀。本實驗室透過蛋白質體學的分析，發現犬隻在攝入108cfu/ml納豆菌（Bacillus subtilis var. natto），可誘發免疫細胞活化，進而抑制體內載脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I)的表現。藉由較低濃度的載脂蛋白A-I，可進一步維持或放大納豆菌所引發的促發炎現象，而達到抗過敏的效果。研究結果顯示納豆菌（Bacillus subtilis var. natto）可刺激免疫細胞活化進而影響載脂蛋白A-I的表現，並且分泌相關免疫調控蛋白來維持適當之免疫發炎反應以達到對急性期異位性皮膚炎之治療效果。