國立臺灣大學食品科技研究所學位論文/Institute of Food Science and Technology
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大腸直腸癌 (colorectal cancer, CRC)的發生率與致死率皆為台灣癌症前三高，富含蔬果且未經加工的飲食模式與高纖維攝取為大腸直腸癌的預防因子，其可能原因為蔬果中的植化素。中國橄欖 (Canarium album L.)過去被用作傳統中藥材，本實驗室先前研究顯示中國橄欖果實水萃物殘渣甲醇萃取乙酸乙酯區分層 (Chinese olive extract, COE)對大腸直腸癌細胞具有抗增生與促進細胞凋亡的功效。然而，詳細作用機制與上游作用標的並不清楚。 本研究指出，相較於正常腸上皮細胞IEC-6 cell line，COE對腸癌細胞株HCT116與CaCO-2有較低的半致死劑量。差異蛋白質體學的結果也顯示COE處理後，除了影響HCT116細胞週期與細胞凋亡途徑外，代謝相關途徑 (如glycolysis process)也有顯著差異。進一步利用細胞熱轉變分析 (cellular thermal shift assay, CETSA)結合蛋白質體學分析配體結合作用標的時所引發的熱穩定性變化，結果發現6-phosphofructokinase (PFK1)熱穩定性受COE影響，並以intact cell與cell lysate的條件下進行CETSA證明溶解曲線改變，推論COE含有PFK1的配體。酵素活性分析發現在in vitro與cell lysate實驗中PFK1的活性受到COE抑制。美國癌症基因體圖譜計畫中的大腸癌資料庫也發現PFKM表現量較高的患者有較低的三年存活率。經實驗結果得知，PFK1的活性下降導致ATP濃度降低與ADP/ATP比例上升，進而活化AMPK促進p53相關細胞凋亡基因 (BAX與BID)表現量提高。最後，我們以分子模擬 (molecular Docking)尋找COE中可能抑制PFK1的功效性成分，發現COE內的amentoflavone相較於PFK1的受質有更高的親和力，最後在細胞存活試驗中也發現對HCT116細胞具有毒殺性。綜合上述，本研究分析蛋白熱穩定性變化證實COE與PFK1的直接交互作用，導致細胞產生能量壓力，進而促進AMPK與p53路徑活化，最終導致細胞凋亡。
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流行病學報告指出，大腸直腸癌為全世界發生率及死亡率前三名的癌症，如何預防或治療大腸直腸癌成為現今關注的議題。天然物中富含多種具有抗發炎、抗氧化活性之植化素，如:白藜蘆醇 (resveratrol)。薑黃素 (curcumin, CUR) 為薑黃中主要的活性成分，研究證實其具抗氧化、抗發炎與抗癌作用。然而，CUR 屬於親脂性且結構不穩定物質，在生物體中生物利用度偏低。為了增進 CUR 生物利用率，許多 CUR 衍生物因而被開發與研究。Aminated-curcumin (AC) 是從天然薑黃素結構合成的胺化衍生物。本研究第一部分透過體外實驗，以小鼠巨噬細胞 RAW264.7 與 HT-29 腸癌細胞，初步探討 AC 於抗發炎及抑制腸癌細胞增生之表現；第二部分實驗以 azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) 誘導 BALB/c 小鼠腸癌模式，觀察與分析小鼠腸道外觀、組織及蛋白表現之變化，探討 AC 對於潰瘍性腸癌之影響。細胞實驗結果顯示，相較於 CUR，AC 可顯著降低 RAW264.7 細胞一氧化氮生成量與發炎相關蛋白表現，並且能抑制腸癌細胞存活。在動物實驗結果中，餵食 0.005% AC 明顯減少 AOM/DSS 誘導腸道腫瘤生成數量、改善潰瘍造成的腸道縮短現象、降低血清與腸道組織蛋白中促發炎細胞激素 TNF-α 和 IL-6 之含量，並透過 PI3K/AKT/NFκB 傳訊路徑與誘發 HO-1 活化，降低 iNOS 與 COX-2 表現；此外，餵食 0.005% AC 可透過抑制 NF-κB/IL-6/STAT3 路徑，調節上皮間質轉化蛋白 E-cadherin 和 N-cadherin 表現並抑制腫瘤轉移。此外，由腸道菌相分析結果得知，AC 可調節腸道中產生短鏈脂肪酸與抑制腸炎之益菌與癌症相關壞菌之比例，改善 AOM/DSS 誘導造成的菌相失衡。綜合上述，本研究為首篇在動物模式中探討 AC 於化學預防方面之功效，對於有罹患大腸直腸癌較高風險的潰瘍性腸炎患者可能具有益處，唯需特別注意劑量的使用。
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世界衛生組織統計全球約有3億人罹患憂鬱症，此疾病嚴重將造成患者自殺及帶來社會經濟上的重擔，現今研究已知壓力引起腦部中的發炎體蛋白3號 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3, NLRP3) 之活化，使得下游促發炎細胞激素 IL-1β 的累積，將導致慢性神經發炎；另外壓力造成腸道菌相組成及腸道屏障功能的改變使腸道菌產生之毒素如脂多醣可能得以進入血液循環系統中，造成周邊慢性發炎，此現象與部分憂鬱症患者血液檢測中，發現有較高發炎指標的濃度有相似性。目前臨床之抗憂鬱劑藥物常因副作用、作用發揮期過長和高復發率受到討論，故尋找其它具有類抗憂鬱之素材有其必要性。大蒜 (Allium sativum L.) 為多年生草本植物之地下鱗莖，除作為日常使用之辛香料外，草本綱目和文獻研究皆指出其具有解毒、消炎等功用，另外本實驗室先前於大鼠類憂鬱動物模式中，已發現大蒜精油介入後具有促進神經增生和調控單胺類物質代謝速率而具類抗憂鬱的效果。故本研究目的欲探討介入大蒜精油 (Garlic essential oil, GEO) 及其活性成分二烯丙基二硫化物 (Diallyl disulfide, DADS) 於大鼠不可預期慢性溫和壓力模式下是否透過上述途徑而能發揮類抗憂鬱功效，因而對其機制有更多面的了解。後續分析大鼠腦部神經傳導物質的代謝情形，探討腦部發炎體蛋白及腸通透道蛋白之表現量，並測定血清發炎指標之濃度及腸道菌相之變化情形。實驗以DADS 10 mg/kg bw及GEO 5、15、25 mg/kg bw分別介入，結果顯示大蒜精油能有效改善大鼠因壓力而減少對糖水偏好之程度 (p < 0.05)，且顯著降低腦部單胺類神經傳導物質升高的代謝速率 (p < 0.05)。分析腦部發炎體蛋白中NLRP3、ASC、Caspase-1與其下游IL-1β及腸道結構蛋白表現情形，結果發現在大蒜精油25 mg/kg bw介入後，可以顯著降低NLRP3發炎體蛋白及下游IL-1β之表現，在腸道通透蛋白則能回復其表現量及腸屏障功能，在血清中接受壓力之組別IL-1β及TNF-α濃度顯著增加，而在大蒜精油25 mg/kg bw介入的組別中能顯著減少其濃度 (p < 0.05)，顯示大蒜精油具有降低周邊系統發炎之效果，在腸道菌結果大蒜精油具有增加Ruminococcaceae的相對豐富度，此類菌群具有維持腸屏障的功能，此外也發現在壓力組別中Marvinbryantia菌屬數量的減少，與先前研究具有相似結果，綜合上述，大蒜精油藉由減緩大鼠腦部單胺類神經傳導物質的代謝速率、減少腦部NLRP3發炎體蛋白和下游IL-1β之表現，另外透過降低血清中發炎指標之濃度，增加腸道菌Ruminococcaceae豐富度回復腸屏障功能，達到類抗憂鬱之效果。
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根據世界衛生組織2018年統計資料顯示，全球結腸直腸癌 (colorectal cancer) 發生率排名第三，死亡率更高居第二位，由此可見預防或改善結腸直腸癌成為當前重要的研究議題。而患病率的提高與飲食習慣的改變密切相關，其中，由於食品加工過程會造成飲食中暴露於致癌物苯芘 (benzo[a]pyrene, B[a]P) 的機率增加。因此，本實驗利用benzo[a]pyrene/dextran sulfate sodium (B[a]P/DSS) 誘導腸癌模式作為模擬平台。而致癌過程 (carcinogenesis) 共可區分為三個階段，依序為起始期 (initiation stage)、促進期 (promotion stage) 及進展期 (progression stage)，若能抑制前兩階段的發展，便能防止腸癌的進程。近年來，許多研究證實柑橘類果皮含有特殊的類黃酮成分為多甲氧基黃酮 (polymethoxyflavones, PMFs)，具有抗氧化、抗發炎與抗癌等作用。其中含量最為豐富的PMF即為川陳皮素 (nobiletin)，而研究顯示，經酸水解後所形成的5-去甲基川陳皮素 (5-demethylnobiletin, DMNB)，更能有效發揮多種生物活性進而減少腸癌生成。然而，目前DMNB對於結腸直腸癌化過程中不同階段的影響尚未被探討。故本研究欲利用B[a]P/DSS誘導腸癌模式，探討DMNB在腸癌進程中所扮演的角色及其相關分子機制。由結果顯示，DMNB在40 mg/kg/day該劑量下於促進期介入能明顯減少腸道腫瘤生成及血漿中細胞激素interleukin 10 (IL-10) 及tumor necrosis factor alpha (TNF-α) 的含量。此外，於腸道組織分析結果也顯示，DMNB於促進期介入能夠抑制磷酸化extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) 及其下游調控細胞週期蛋白Cyclin D1和抗凋亡蛋白B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 的表現。相反地，DMNB在相同劑量下於起始期介入無法減少腸道腫瘤生成及血漿中細胞激素interleukin 6 (IL-6)、IL-10和TNF-α的含量，而其腸道組織中磷酸化ERK1/2及下游調控之Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表現量皆明顯提升，顯示DMNB於起始期介入無法藉由抑制細胞增生相關蛋白而減緩腸癌進程。另外，利用細胞試驗則發現，DMNB亦無法調節B[a]P代謝轉化路徑 aryl hydrocarbon receptor/cytochrome P450 (AhR/CYP450) 之相關蛋白表現，推測其不具抑制B[a]P經代謝活化生成高反應性致癌物之效用。綜合以上結果認為，DMNB在40 mg/kg/day該劑量下雖然不具阻止B[a]P生物轉化而產生致突變或致癌特性的能力，但可藉由抑制發炎反應及腫瘤增生而達到減緩腸癌進程，具有作為天然的癌症化學預防試劑之潛力。
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根據世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 最新的統計，心血管疾病 (Cardiovascular disease, CVD) 是全球人口死亡的主要原因。而根據台灣衛生福利部所公佈的 108 年國人十大死亡原因中，心血管相關疾病所造成的死亡總人數已超過位於榜首的癌症，可見預防 CVD 之必要性。隨著近年來腸道菌相相關研究的興起，腸道菌及其代謝產物如氧化三甲胺 (Trimethylamine-N-oxide) 、短鏈脂肪酸 (Short chain fatty acids, SCFA) 等被證實與 CVD 的發生有關。其中，腸道菌透過生成 TMAO 導致人類 CVD 的發現是目前科學理論架構完整且最具臨床應用價值之一的研究方向。許多研究指出動脈粥狀硬化 (Atherosclerosis) 是造成 CVD 的主要原因，並證實 TMAO 具有致動脈粥狀硬化 (Pro-atherogenic) 及血栓形成的能力，因此人體血液中 TMAO 的濃度是促使動脈粥狀硬化的重要且獨立的危險因子。TMAO 的產生主要來自於飲食中的肉類及蛋類所含的肉鹼 (Carnitine) 和膽鹼 (Choline)，在腸道中被腸道菌代謝利用並透過肝臟酵素氧化而形成 TMAO。動脈粥狀硬化是一種慢性發炎性疾病，低密度脂蛋白 (Low-density lipoprotein, LDL) 氧化後具有細胞毒性，會引起血管內皮發生發炎反應，最終導致動脈粥狀硬化斑塊的生成而逐漸阻塞動脈。因此，減輕發炎反應可以有效降低主動脈斑塊的生成。黃豆經過發酵會產生黃酮類 (Flavones)、異黃酮 (Isoflavones)、黃頑酮類 (Flavanones) 等，這些化合物具有許多生理活性如抗發炎、抗氧化、抗過敏等活性。此外，根據本實驗室初步 in vitro study 結果發現，黃豆發酵萃取物可以有效抑制特定菌株的生長，進而抑制 carnitine 及 choline 轉換成 TMA子路徑。於短期 C57BL/6J 小鼠實驗中也發現黃豆發酵萃取物的介入可顯著降低小鼠血液中 TMA 及 TMAO 的濃度，減緩血小板凝集的發生。然而，前述 C57BL/6J 小鼠模式無法提供動脈粥狀硬化的主要表徵，如主動脈斑塊的生成。因此，本實驗將該用 Apoe-/- 小鼠動物模式探討黃豆發酵萃取物是否能透過調節小鼠腸道菌相，降低 TMAO 的產生，進而減少小鼠主動脈斑塊的生成，達到心血管保護的效果。實驗結果顯示， 黃豆發酵萃取物可顯著降低 carnitine 介入後小鼠血液中 TMAO 的濃度，進而減少血管斑塊之生成，同時降低了小鼠血液中 TG 的濃度。此外，黃豆發酵萃取物也改善了 choline 介入下小鼠的肝功能指數並提升了小鼠血液中高密度脂蛋白 (HDL-C) 的濃度。根據小鼠菌相分析的結果顯示，黃豆發酵萃取物顯著改變 carnitine 組別小鼠整體腸道菌相的組成，且提高腸道菌之多樣性及豐富度。而主座標分析 (PCoA) 結果顯示黃豆發酵萃取物不會改變給予 choline 的小鼠整體腸道菌相之組成，但對於特定菌群的相對豐富度仍造成顯著的改變。綜上所述，黃豆發酵萃取物可透過改善血脂及肝功能，調節腸道菌相，降低 TMAO 的產生，進而減少主動脈斑塊的生成，達到心血管保護之功效。
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葉酸代謝異常患者體內5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)活性降低，故較易有葉酸缺乏的情形。過去文獻以化學法分析酵母菌中的葉酸型式與含量，發現Saccharomyces cerevisiae富含5-甲基四氫葉酸5-methyltetrahydrofolate (5-MTHF)，然而不同型式之葉酸在萃取與分析過程中可能會互相轉換，因此酵母菌是否為良好5-MTHF來源仍需進一步確認。本研究希望建立以葉酸需求菌株Lactobacillus rhamnosus分析S. cerevisiae總葉酸含量之平台，並分析葉酸與S-腺苷甲硫胺酸S-adenosylmethionine (SAM) / S-腺苷高半胱胺酸S-adenosylhomocysteine (SAH)比率之關聯性，藉此瞭解酵母菌中所含之葉酸是否具甲基轉移之生物活性。除此之外，藉由去除合成5-MTHF之基因MET13，比較基因去除前後總葉酸含量的差異，推測S. cerevisiae培養於YPD培養基產生的5-MTHF含量。實驗結果顯示野生型S. cerevisiae總葉酸含量顯著高於met13△突變株，且野生型菌株培養於YPD培養液在指數期產生之5-MTHF約為1098 µg / 100 g乾重、生長遲滯期產生之5-MTHF則約為715 µg / 100 g乾重，分別占總葉酸含量的1/4與1/3，故有潛力成為良好之5-MTHF補充品；此外S. cerevisiae在不同生長時期會產生不同之葉酸總量，指數期產生的總葉酸量顯著高於生長遲滯期；在葉酸與SAM / SAH比率關聯中，得知野生型S. cerevisiae葉酸產量雖較met13△突變株高，但SAM / SAH比率無顯著差異，然而不論是野生型或met13△突變株酵母菌，SAM / SAH比率在指數期皆顯著小於生長遲滯期。雖然實驗中無法明確獲得5-MTHF含量，但可透過met13△突變株葉酸測定的結果間接推測酵母菌中5-MTHF含量，未來也許可利用代謝體學等方法進一步瞭解分析酵母菌中5-MTHF含量測定方式。
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自人類微生物組計畫開展後，越來越多研究發現皮膚共生微生物對於維持皮膚的健康狀態扮演著相當重要的角色。頭皮作為一個毛囊密度最高的皮膚區域，其獨特的生理狀態使得定殖在頭皮上的微生物與其他皮膚部位有相當的差異，目前對於頭皮與微生物的相關研究相對較少，而與特定疾病的關聯性，如雄性禿，更是鮮少被討論。然而皮膚微生物研究時常受限於其低微生物量，取得穩定且具再現性的微生物樣本是研究皮膚微生物最基礎也最重要的步驟，佈滿毛髮的頭皮更是增加取樣的困難度，如何取得足量微生物檢體的採樣方法也是研究微生物相當重要的一環。 大豆為營養價值豐富的食物，根據不同的發酵方式可以增加大豆內機能性成分，強化其抗氧化及抗發炎等生物活性，有調查發現經常飲用大豆飲料可以防止中度到重度的落髮問題，現今市面上亦有許多大豆發酵成分的保養品，也有含大豆機能性成分的髮類養護產品。 本研究欲探討大豆發酵液是否能夠改善雄性禿，以及其頭皮中微生物的變化。首先對於大豆發酵液進行抗氧化活性實驗，發現樣品對於DPPH自由基清除能力約在60%左右。接著開發一個適用於頭皮微生物檢體的採樣流程，將其應用在雄性禿的受試者上，並使用real-time PCR定量常見的頭皮微生物。結果發現在受試者患部區域中的Malassezia globosa數量要明顯低於健康區域(p < 0.01)，而在使用大豆發酵液樣品兩個月後，受試者頭皮的健康區域中Propionibacterium acnes數量有增加的現象(p < 0.05)，並觀察到在患部區域毛髮密度、髮幹直徑都有改善的情形。除此之外亦發現頭皮中Staphylococcus epidermidis及Malassezia restricta與頭髮密度和頭皮敏感度具有關聯性。綜合以上所述，我們推論雄性禿以及頭皮的一些不適反應很可能與其頭皮中的共生微生物失衡有關，而本實驗大豆發酵液樣品作為改善雄性禿的頭皮養護品具有一定的潛力。
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2018年台灣國民健康署公告指出，每3位19歲以上國民就有1人為代謝症候群。而美國糖尿病協會亦將代謝症候群視為預測糖尿病與心血管疾病的重要指標。但臨床使用的降血糖藥物仍伴隨各種副作用，因此使用天然食材也成為用藥前的替代療法。 薏苡學名為Coix lacryma-jobi，屬禾本科。本實驗室選用台中4號薏仁，透過擠壓加工製造之即食產品，相較於市售薏仁產品有較高比例的慢性消化澱粉 (Slow digestive starch)，具有平穩飯後血糖的潛力。本研究透過人體試驗，將受試者分為實驗組或控制組，以前述糙薏仁產品或安慰劑取代早餐的澱粉類，觀察三個月中受試者空腹血糖與醣化血色素之變化。因薏苡組成中，以其固醇類的β-谷固醇 (β-sitosterol)、豆固醇 (Stigmasterol)為主要成分。本研究擬利用Cho-K1細胞，探討薏仁產品中的固醇類可能調節血糖的分子機制。 人體試驗結果顯示，比較全部的受試者，與控制組相比，薏仁組無顯著調降血糖功效。但對於血糖值較高的受試者在第4週及第8週有較明顯調節的效果，此與過去曾有研究指出糙薏仁對第二型糖尿病患者有顯著調節血糖效果的結果相符。此外，細胞實驗結果顯示，薏仁產品中的固醇類含量可增加pAKT的表現量，可增加胰島素的感性。因此推測薏仁產品可至少可部分透過其中的植物固醇來調節血糖。
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根據衛生福利部106年十大死因統計指出心臟疾病死因位居第二，僅次於癌症，綜觀前十大死因和心血管相關的疾病總死亡人數與癌症不相上下。此外，世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 早在2015年即公告CVD (cardiovascular disease) 為全球死因第一位，可見預防心血管疾病之重要性。心血管疾病的發生多與動脈粥狀硬化有關，其為一種慢性疾病，是血管內皮脂肪沉積形成斑塊進而造成血管失去彈性、管腔阻塞甚至引發血栓導致心肌梗塞、腦中風等急症發生。然而致病的進程是可以預防的，其中飲食因子與其息息相關。近年來研究發現，紅肉、蛋類等富含choline和carnitine之飲食來源，會透過腸道菌轉換生成TMA (Trimethylamine)，再經宿主肝臟酵素FMO3 (Flavin-containing monooxygenases) 代謝生成TMAO (Trimethylamine N-oxide) 進而促進動脈粥狀硬化 (Atherosclerosis) 形成。大蒜於中醫典籍當中記載其有解滯氣、暖脾胃、解毒殺蟲等作用，在許多研究亦證實具有殺菌、抗氧化、降低膽固醇等功能，其中大蒜素 (Allicin) 為其重要生物活性分子亦是香味來源。本研究欲透過大蒜素來抑制需經腸道菌作用生成TMAO的路徑，觀察長期以carnitine誘導促進ApoE(-/-) 小鼠斑塊生成模式下，大蒜素延緩動脈粥狀硬化之功效。實驗分組如下：(1) 控制組 (2) 1.3% 肉鹼組 (3) 大蒜素組 (10 mg/kg BW) (4) 1.3% 肉鹼搭配大蒜素組。結果顯示相較於單純給予carnitine組，在搭配大蒜素處理下主動脈斑塊生成減少。於短期試驗發現大蒜素搭配carnitine組別與carnitine組相比，血中TMAO濃度明顯下降。另外，利用主坐標分析 (Principal coordinates analysis, PCoA) 作圖觀察各組之間糞便菌相分佈具有顯著差異。由本實驗結果進一步了解大蒜素於調節腸道菌代謝生成TMAO以延緩動脈粥狀硬化之效用，更進一步說明了心¬-腸軸線之關聯性。
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牛樟芝（Antrodia cinnamomea BCRC 35716）子實體生長於台灣高山的牛樟樹腐木上，為台灣特有的藥用真菌，許多文獻證實其次級代謝物具有多種生理功效，其中又以保肝功效最為著名。然而，樟芝子實體之商業化大量生產不易，因此近年產學界研究轉向生長快速的菌絲體。研究顯示，樟芝菌絲體萃取物抑制肝癌活性不亞於子實體，又以泛醌類衍生物：4-acetylantroquinonol B （4-AAQB）及Antroquinonol（AQ）最具功效，而4-AAQB 對於肝癌細胞的IC50 僅0.1 μg/mL，比AQ 更低，因此，確立4-AAQB生合成途徑為本次實驗目的。 牛樟芝產4-AAQB 的生合成途徑包含結構中與benzoquinone 相關的Polyketide 路徑和與isoprenoid chain 相關的Mevalonate 路徑。Polyketide路徑所產生的benzoquinone 為AQ 與4-AAQB 的共同前驅物。目前已知，farnesyl di-phosphate（FPP）以及farnesyl diphosphate B（FPPB）會競爭benzoquinone 上相同的結合位，最後生合成AQ以及4-AAQB。然而FPPB 之生合成方式尚未明確。本研究提出假說：FPPB 並不是由十五碳的FPP 在末端經γ-lactone 修飾而成，而是藉由十碳的geranyl diphosphate（GPP） 接上一五碳的 isopentenyl diphosphate B （IPPB） 所形成。因此，以兩種手段間接證實此假說，一為添加不同碳鏈長度的isoprenoid chain，一為刺激Mevalonate路徑中生成FPP 的farnesyl diphosphate synthase（FPPS）之酵素活性。透過添加geraniol 及farnesol 作為GPP 及FPP 前驅物，發現在第零天添加geraniol可增加4-AAQB 產量而不增加菌絲體乾重。然而，添加farnesol 只增加菌絲體乾重，說明GPP為FPPB前驅物，而FPP在初期會先被用於生成初級代謝產物。在第六天添加等量的geraniol 及farnesol，發現4-AAQB及AQ皆提升，而添加geraniol又可以更顯著提升4-AAQB 產量。接著以UPLC-MS/MS分析 4-AAQB 及 AQ 生合成途徑之中間產物，發現在添加前驅物的情況下，Polyketide路徑上的中間產物產量皆會提升並累積在上游。其中，又以添加geraniol 會明顯促進4-AAQB 及其上游產物產量，添加farnesol 則是明顯的提升AQ 及其上游產物產量，說明GPP確實為4-AAQB的前驅物，而FPP 是AQ 的前驅物。另一實驗則以加鎂離子刺激FPPS 的酵素活性時，結果發現4-AAQB 產量下降，推測FPPS活性上升時，刺激了isopentenyl diphosphate（IPP）及GPP轉為FPP，減少GPP轉化成FPPB。上述研究證實4-AAQB 上之FPPB 與FPP 為競爭關係非上下游關係，證實假說成立。 Mevalonate 路徑為生物體合成異戊二烯結構的重要途徑，會利用acetyl-CoA 代謝成五碳的雙磷酸結構IPP，並以IPP 為單元結構，透過頭尾相接的方式來增長碳鏈結構。基於上述所推測之FPPB 的生成途徑，形成雙磷酸結構為其必要步驟。因此，本實驗探討刺激磷酸化作用對代謝活性的影響。結果顯示，添加磷酸根確實可提高4-AAQB 生成量，與預期相符。本研究結果使我們進一步了解4-AAQB 的生合成途徑，同時也能夠應用於4-AAQB之產量的增加。