臺灣大學植物科學研究所學位論文
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台灣地熱區的嗜熱菌種類極為豐富，不同菌種其生活形態及適應環境的能力亦有所區別。從演化的角度來看，最早發現的嗜熱菌 Thermus 與目前研究最多的抗輻射菌種 Deinococcus radiodurans 具高度親緣關係，故在嗜熱菌中是否有抗輻射菌株的存在是一個具潛力且值得探討的課題。先前的研究，在溫泉環境中已發現具有輻射抗性嗜熱菌的存在；本研究是利用台灣各地的溫泉樣本，經初步輻射處理後篩選當中具輻射抗性之嗜熱菌，並利用生理生化形態及遺傳學之分析法，將台灣地熱區所分離出之具輻射抗性的菌種加以鑑定，分別屬於七屬：包括Deioncoccus spp.、Rubrobacter spp.、Meiothermus spp.、Bacillus spp.、Aneurinibacillus spp.、Anoxybacillus spp. 及Paenibacillus spp.。再由七屬共挑選 20 株菌株，分別測試各屬菌株在不同逆境下 ( 迦瑪射線處理、紫外線處理、金屬逆境及過氧化氫逆境 ) 的抗性。結果發現，本研究所分離出的 20 株菌株對迦瑪射線及紫外線均有極高的抗性，且對過氧化氫的抗性也極高；但是在金屬逆境下，對金屬的抗性與可抗輻射的特性並無明顯相關。此外，本實驗所分離出的抗輻射嗜熱菌中，其中四屬包括 Meiothermus spp.、Aneurinibacillus spp.、Anoxybacillus spp. 及 Paenibacillus spp.，在以前的研究中並未發現具輻射抗性的菌株；證明在台灣地熱溫泉區的嗜熱性細菌具有豐富的多樣性，且抗輻射嗜熱菌亦廣泛的存在台灣地熱溫泉區中。
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綠竹超氧歧化酶的同功酶活性，主要由銅/鋅超氧歧化酶及錳超氧歧化酶所構成。在原態膠體上進行活性染色，可分出七個銅/鋅超氧歧化酶活性條帶及一個錳超氧歧化酶活性條帶，相較於其他植物，綠竹具有更多的銅/鋅超氧歧化酶活性條帶。在綠竹的粗萃取液中加入濃度為0.05至0.2 mM的銅離子或是以8 M尿素將之變性再還原，皆未造成該七個銅/鋅超氧歧化酶活性條帶分布位置的改變。表示這些銅/鋅超氧歧化酶活性條帶並非因攜帶的銅離子數目不同，或是由不同數目的次單位體聚合而成。經由南方氏轉印分析發現：綠竹銅/鋅超氧歧化酶及錳超氧歧化酶的基因數目約有四至五個。這些結果顯示綠竹具有許多超氧歧化酶基因，並且具有許多銅/鋅超氧歧化酶的同功酶活性。推測綠竹可能具有更複雜的抗氧化系統以及調控機制，來參與其在氧化逆境下所表現出的一些特性，例如:生長快速。 經由比對其他單子葉植物的錳超氧歧化酶及銅/鋅超氧歧化酶cDNA序列，設計保守引子對進行3’-RACE 及 5’-RACE，得到兩條錳超氧歧化酶coding region序列，經軟體分析，發現其轉譯之蛋白質序列之N端，皆具有可能之粒線體transit peptide，故推測此錳超氧歧化酶可能會進入粒線體並清除超氧。將得到之錳超氧歧化酶與其他單子葉植物的錳超氧歧化酶進行比對，其相似度在75~89%之間。另外，銅/鋅超氧歧化酶部分，也得到四條coding region序列，經軟體分析，推測此四條cDNA皆為細胞質型銅/鋅超氧歧化酶。此四條銅/鋅超氧歧化酶和其他單子葉植物銅/鋅超氧歧化酶的相似度，在81~95%之間。 進一步將銅/鋅超氧歧化酶及錳超氧歧化酶的coding region序列，接入pGEX-6P-1表現載體中，使之在大腸桿菌中大量表現銅/鋅超氧歧化酶及錳超氧歧化酶的重組蛋白質，並利用親合性層析法進行GST-BoCuZnSOD及GST-BoMnSOD重組蛋白純化。純化之GST-BoMnSOD及GST-BoCuZnSOD皆具有超氧歧化酶活性，同時在鹼性pH值下或是在低於60℃下呈現穩定的活性，並在室溫下放置三天仍保有良好的酵素活性。 本論文所得到的結果:在大腸桿菌裡表現的綠竹超氧歧化酶重組蛋白，可在鹼性的環境、高溫，以及長時間在室溫下，保有良好的活性，這些特性，將來或許可開發利用於日常生活用品中，例如皮膚表面自由基的清除劑。
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P56是從Salmonella choleraesuis CH12440培養上清液纯化出來，分子量為56kDa的蛋白質，以此蛋白質處理小鼠巨噬細胞(mouse marcophage)，會導致細胞變性及壞死，故P56可視為一種細胞毒素(cytotoxin)。經由胺基酸序列比對發現P56為構成細菌鞭毛的次單位-flagellin，且將P56基因命名為sal15，但現今仍未有文獻報導flagellin具有細胞毒性。與其他S. choleraesuis菌株之flagellin DNA序列 (Genbank number X03394 )做比較，發現S. choleraesuis CH12440之flagellin基因多了36 bp的序列，而初步研究發現如將此段序列刪除則其毒性消失。本論文的主題是對這一區域做更進一步的探討。首先，將可能毒性區域的36 bp DNA序列插入不具毒性的E. coli之 fliC基因之中，測驗是否能賦予E. coli的FliC毒性，結果發現無論DNA序列是否多出了36個bp，FliC都具有毒殺小鼠巨噬細胞株RAW264.7及P388D1的能力。另外，將Sal15此區域中的胺基酸序列K 247、A 252、D 253利用PCR進行定點突變改變為T 247、T 252、G 253，但是此三個重組蛋白質的毒性均無顯著的下降，故此三個胺基酸與Sal15的毒性無明顯的關係。另一方面，探討Sal15是否是導致巨噬細胞的凋亡(apoptosis)，目前已知當細胞凋亡時PARP-1 [poly(ADP-ribose) polymerase-1]會被分解、抑制，故利用PARP-1作為細胞凋亡標記，進行西方墨點法，但結果得知PARP-1並沒有被分解、抑制，故推測Sal15導致巨噬細胞的死亡並非經由凋亡的途徑。
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芋頭為一傳統食用作物，主要食用部位為球莖及葉部；一般而言，球莖在發育過程中所含有之貯存性蛋白質除了扮演基因之表現與調控外，亦含有抗病及抗菌功能的蛋白酶抑制劑。本實驗在檢測不同芋頭品種後發現高雄1號品種含有一種硫醇型的蛋白質酶抑制劑， 利用5’-RACE及3’-RACE進行PCR反應，得到全長的tarocystain 基因，命名為CeCPI， CeCPI全長共有1,008 bp，其open reading frame (ORF)為618 bp，可轉譯成205 胺基酸，分子量約29 kDa，其序列特徵為: Gly5 (G)位在N-端序列之第5個胺基酸; 第一個binding loop(L1)區域起始於第49個胺基酸位置,含有一個五胜肽(pentapeptide)序列 Gln49-Val50-Val51-Ser52-Gly53 (Q-V-V-S-G); 第二個binding loop(L2) 則在Trp 80 (W80)之後; 在靠近C-端序列處尚有一個不含cysteine 的contact point -(W114); 此外, 在鄰近N-端第22個胺基酸起含有一個保守性的胺基酸序列ARFAVDEHNKK，因此，認為CeCPI屬於phytocystatin之一種。進行胺基酸演譯序列相似度之比較，就芋頭而言，芋頭為網狀脈葉但屬於單子葉植物，而其CeCPI基因序列之胺基酸演譯及分子量大小，與雙子葉植物之相似度高於單子葉植物。 重組CeCPI 蛋白質當濃度在80 mg/ml時，即可抑制白絹菌(Sclerotium rolfsii)菌核之生長，當重組CeCPI蛋白質濃度達150 ~ 200 mg/ml以上，白絹病菌菌核之菌絲的生長完全的受到抑制。以不同濃度重組CeCPI蛋白質檢測其他真菌性病害，發現重組CeCPI蛋白質對某些真菌性病害，如芸苔鏈格孢菌(Alternaria brassica)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)及 立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)具有明顯抑制其菌絲生長之毒性。 以水稻OC-I為模組，使用SWISS-Model程式分析CeCPI蛋白質結構模式，由3D構造分析，得到重組CeCPI蛋白質由6個α-helix （α1、α2、α3、α4、α5、α6）及7個antiparallelβ-sheet（β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7）組成。檢測定點突變後的數種CeCPI蛋白質(site-directed mutant protein)對木瓜酶的抑制活性是否受影響，結果當保守區(L1) Q49位置一旦突變, 抑制木瓜酶的活性則完全喪失，而且對抑制白絹病菌菌核生長之抗性也消失，但在C-端保守區（W80、W114）的突變體雖然對木瓜酶抑制活性部份減弱，但對白絹病菌菌絲仍顯著抑制其生長; 顯然CeCPI 蛋白質對木瓜酶的抑制活性與抑菌活性是二個不同的分子機制。
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綠豆(Vigna radiata L. v.2937)屬於不耐寒植物，本實驗室要了解寒溫逆境(chilling stress)對於不耐寒植物的影響，利用差異式篩選法(differential screening)篩選出十三個會受到10℃明顯抑制的基因。本實驗室針對十三個基因中的Rubisco activase及cytochrome P450做更進一步研究，其中對於Rubisco activase基因表現特性有概日韻律，當受到寒溫逆境10℃處理時，概日韻律會受到改變，基因表現受到抑制，並且寒溫逆境會抑制Rubisco activase基因的轉錄作用。 本實驗室更進一步找出Rubisco activase基因的啟動子，長1,161bp。本論文就是針對此啟動子做進一步研究，利用啟動子刪除分析(promoter deletion assay)及阿拉伯芥轉殖系統，找出-521到-431的啟動子區域和低溫調節有關。並且經由凝膠延滯實驗(gel retardation)，證明低溫會使綠豆產生特殊的細胞核蛋白質和-521到-431的啟動子區域做結合。 除了找出-521到-431的啟動子區域和低溫調節有關以外，也經由阿拉伯芥轉殖系統、凝膠延滯實驗及網路資料庫查詢的結果，推論出Rubisco activase基因的啟動子區域-160到-58也和低溫相關。另外也推論出啟動子區域-251到-151在正常生長下會促進Rubisco activase基因表現，但這種促進的作用在低溫下會被抑制。
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FIN219是cop1-6的一個基因外抑制體(extragenic suppressor)，參與遠紅光接受體光敏素A的訊息傳遞；它產生一個575胺基酸的蛋白質，屬於GH3-like基因家族的成員。BLAST search的結果顯示，在阿拉伯芥中存在至少20個GH3-like的基因，但他們的功能尚未清楚；為了進一步瞭解它們是否參與訊息傳遞及在阿拉伯芥生長發育過程中所扮演的角色，決定利用光訊息突變體及T-DNA插入的突變株，研究他們基因的表現。 從這20個基因當中選取九個做為研究的對象，分別為GH3-1、GH3-2、GH3-3、GH3-4、GH3-5、GH3-6、GH3-9、GH3-18及GH3-20。我們發現這九個基因的蛋白質有1-2個可以與其他蛋白質作用的coiled-coil domain，並且在promoter含有許多與光調控相關的cis-elements，如GATA box、IBOX等。利用T-DNA插入的四個GH3-like基因突變株(GH3-2、GH3-4、GH3-5、及GH3-17)，檢測在白光、藍光、紅光、遠紅光及黑暗中阿拉伯芥幼苗的外表型，發現這些GH3-like基因的T-DNA插入突變株具有在遠紅光及藍光中較不敏感的外表型。進一步利用RT-PCR方法檢測他們在不同光訊息突變體中，在不同光源處理下的基因表現情況，結果顯示這些基因可能分別參與不同的光訊息傳遞中。 另外針對GH3-20的研究發現，大量表現和抑制 GH3-20基因在Col.、phyA、phyB、fin219及cry1xcry2的轉殖株中，只有大量表現在野生型阿拉伯芥的轉殖株，其幼苗在遠紅光中會有較長的下胚軸，而其他則無明顯的外表型，暗示GH3-20可能與其他家族成員有基因功能的重複性(gene redundancy)，並且需要PHYA、PHYB、FIN219、CRY1及CRY2均正常的情況下才能發揮負調控下胚軸受遠紅光抑制的角色。 利用RT-PCR的方法檢測GH3-20的組織專一性表現，結果顯示GH3-20主要表現在根部的器官，其他組織部位則無法偵測到它的mRNA，因此暗示GH3-20可能參與根的生長發育。另外，為了觀察GH3-20在細胞中表現的位置，利用基因槍的技術將GH3-20與GFP及GUS兩者的融合體送到洋蔥表皮細胞，結果顯示此基因的蛋白質不論是在黑暗或光照下，均存在細胞質與細胞核內，並不會因為光照而有蛋白質轉移的現象。
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Sporamin是甘藷塊根中含量非常豐富的儲存性蛋白質，而且其啟動子活性是可以受到受傷誘導的。因此我們希望能找出sporamin啟動子上負責受傷誘導之順向作用的DNA片段（wound-induced cis-acting element），藉此了解sporamin基因啟動子在植物遭受機械性傷害下的調控機制。利用南方墨漬法得知該基因在甘藷中是為一個基因家族。之後以genomic walking的方式，成功地延長選殖出2條sporamin基因的啟動子。將這兩條新選殖出的啟動子和我們已知的sporamin啟動子：pSPOA以Vector NTI軟體來分析其上和逆境相關之順向作用的DNA片段，我們可以發現這3條啟動子雖然序列不相同，但這些啟動子上皆包含了如NOS-like element、W-box及GCC-like box等和植物防禦機制相關之順向作用的DNA片段。因此這些sporamin基因被調控的機制很有可能是相類似的。在本實驗室之前對於pSPOA這條啟動子缺失片段的研究中發現NOS-like element是為該條啟動子和受傷誘導最為相關的DNA片段，另外SP8a及G-box這2個DNA片段可能具有加強NOS-like element的功能。因此利用合成啟動子的方式（synthetic promoter）來單純化研究NOS-like element及SP8a這兩個順向作用的DNA片段之功能，我們分別構築了含有1、2及4個同一個DNA片段及混合2種DNA片段之合成啟動子，利用轉殖阿拉伯芥的系統來檢測受傷誘導下GUS報導基因的表現模式。在GUS組織染色的結果中顯示NOS-like element及SP8a皆與受傷誘導相關，雖然於受傷誘導下所能誘導的GUS活性仍有差異，但皆可表現於受傷葉片、根、莖與未進行受傷誘導的葉片中，因此此一受傷誘導之傳遞路徑應為系統性的反應（systemic response）；另外如果進行受傷誘導之植株已開始抽花絮，該部分組織中的GUS表現量也會增加。 另一方面利用構築甘藷塊根之cDNA library來選殖出更多的sporamin 基因，以期能分析該基因家族成員間之變異性。我們成功的從甘藷塊根之cDNA library中選殖到19條sporamin A以及1條sporamin B。以Vector NTI軟體分析後發現同一群之基因成員間相似度高達90％，兩群基因之相似度也高達80％。而根據現有的序列可再將A群基因細分為兩個sub-family，其相似度則高達95％。而這些sporamin序列上的差異多是來自於5’及３’-UTR之變異，此結果與Hattori於1989年所提出之理論相類似。另一方面如果將sporamin基因以軟體預測轉譯成氨基酸序列後，發現其活性區域組成之氨基酸序列並無改變，因此這些蛋白質的活性強度可能是相類似的。而以電腦軟體分析我們sporamin基因於序列上可能發生同義與非同義之取代位置，可得到該基因家族KA/KS＜1.0，因此在演化上應是屬於purifying evolution。
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植物從營養時期進入開花的階段在其生活史上是一個很重要的發育轉變，而文心蘭假球莖在此階段的轉變機制仍然不明。於是我們建構文心蘭subtractive EST library[假球莖EST扣減葉子EST]來找尋文心蘭開花相關基因。在EST library中peroxidase, mannose binding lectin，sodium/dicarboxylate cotransporter,及stress-resistant gene有較高的表現量，其中以peroxidase的表現頻率佔了EST library 12.1% 最令人感到興趣。我們在文心蘭cDNA library中得到9個全長class III peroxidase[POX]基因，並從比對生物資訊的資料庫中發現到這群POX是第一次在單子葉植物中被找到，而且具有與auxin結合的胺基酸片段(binding domain)。 為了進一步了解這群POX的生理功能，完成POXs在不同生長階段及不同組織之Northern blot分析，發現到這些POXs在未抽花梗的假球莖中會大量表現，在抽3cm花梗時表現量又降低，所以這些POXs可能會參與開花起始時期的生理代謝過程。藉由兩種POX fusion protein(GFP及GST)的轉殖分析，發現這群POX protein主要是表現在細胞間隙中。與IAA進行in vitro assay時也發現這群POX protein會將IAA降解。將其中七個POXs轉殖到阿拉伯芥中進行生理分析，發現到阿拉伯芥提早開花的功能。利用GC-MS檢測轉殖株中auxin的含量，發現這些轉植株中auxin的含量比野生型低。基於上述實驗結果，推測出這群POX可能在文心蘭抽出花芽前大量表現，使文心蘭假球莖內的IAA被降解，因此造成假球莖內auxin/cytokinin的荷爾蒙比例失去平衡，進而誘導花芽的產生。
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Ipomoelin (IPO) 是一個甘藷(Ipomoea batatas cv. Tainung 57)中的傷害誘導的防禦蛋白，IPO可以被機械性傷害、茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate)以及乙烯等多種植物逆境與訊息分子所誘導表現，所以是一個可以研究植物如何開啟防禦機制的良好材料，我們用iPCR 以及tail PCR的方法找出自IPO 基因轉譯起點之前的1482個鹽基對的啟動子序列，為了要找出能感受茉莉酸甲酯、乙烯的專一序列，我們將IPO啟動子裁剪成五種長短不同的片段，在這五種片段後接上 β-glucuronidase (GUS)報導基因後構築到表現載體pBI221SI100中，並將這五種不同載體送入煙草原生質體中作暫時性表現，結果顯示在IPO 基因轉譯起始點算起-552 到 -921間的序列會受到茉莉酸甲酯的誘導，而在-1176到 -1438間的序列會受到乙烯誘導，而後針對-552 到 -921間會被茉莉酸甲酯誘導的序列進行缺失片段實驗，以三個新的缺失片段載體進行試驗，結果找到一段CACACGTC片段能專一感受茉莉酸甲酯的誘導，此結果與之後進行的Gel Mobility Shift Assay相同，除此之外Gel Mobility Shift Assay還找到一段能被茉莉酸甲酯誘導核蛋白附著的序列TCTAATTTTA，這個序列與阿拉伯芥中茉莉酸甲酯的誘導序列相似。
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昆欄樹(昆欄樹科)是一種相當獨特的植物，僅分佈於台灣、日本、琉球群島以及南韓；它的花沒有花被構造，木質部沒有導管組織，因此曾經被認為是很原始的被子植物。但近年來從其他形態細部構造及分子譜系分析得到的證據，發現昆欄樹並非被子植物基群(basal angiosperms)，而是屬於真雙子葉植物(Eudicots)基群。1986年Peter Endress利用掃描式電子顯微鏡觀察昆欄樹花部構造，發現在靠近雄蕊的基部有疑似花被退化的器官。我們的觀察發現花托上退化的鱗片狀構造數目比Endress所觀察到的多，而且數目可能和雌先熟或雄先熟的個體差異有關。此外，藉由掃描式電子顯微鏡觀察花部的表皮細胞形態，發現在所有的花部表皮細胞都呈現不同程度的乳突狀(papillate)突起。這種表皮細胞形態多發現於一般花瓣，而這種細胞形態有助於反射光線，使得組織看起來比較明亮。因此由觀察的結果推測，昆欄樹的花被構造可能在演化的過程中遺失，而花被吸引傳粉者的功能可能由整朵花序所取代。為了了解昆欄樹花部器官可能的調控機制，本論文進行昆欄樹之花部器官決定性同源基因的選殖。除了先前研究所選殖出三個B class同源基因之外，本實驗結果共選殖出二個A class同源基因，二個C class同源基因，四個E class同源基因。利用這些花部器官決定基因所建立之譜系關係都支持昆欄樹的演化位置的確在真雙子葉基群。然而從RT-PCR的結果發現，這些選殖出來的花部器官決定性同源基因表現位置並不符合目前所認知的ABCDE model。此差異有可能是昆欄樹的花部器官決定性基因調控模式的確和模式植物的調控機制不同，亦有可能是實驗技術上的限制所造成的差異。昆欄樹的花部器官發育機制尚待更進一步的研究。