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阿拉伯芥中光敏素A對於FIN219/JAR1蛋白質 磷酸化修飾在遠紅光與茉莉酸訊息傳遞的功能性研究

植物是屬於光合自營生物，能夠藉由感知光源來調控植物的發育與生理反應。在植物中，具有許多不同種類的光受體來共同調控植物幼苗發育。其中，光敏素A能專一地感知遠紅光，並且藉由與COP1蛋白質的交互作用，來調控植物幼苗的光型態發生。FAR-RED INSENSITIVE 219 (FIN219)/JAR1除了作為催化茉莉酸(JA)與胺基酸Isoleucine(Ile)結合成JA-Ile的合成酵素外，同時也扮演調節遠紅光與茉莉酸訊息傳遞的重要角色。在先前研究中，已知phyA具有磷酸激酶(kinase)的活性，並已確認參與反應的受質。在過去的研究成果中，phyA被認為可能會參與調控FIN219的磷酸化，並發現FIN219磷酸化與否會影響其自身酵素活性。然而，FIN219的磷酸化參與在遠紅光與茉莉酸訊息傳遞的調控機制尚未明瞭。為了更加了解FIN219受phyA磷酸化的調控機制，本研究進行試管外的磷酸化實驗。結果顯示FIN219的N端區域可能受到phyA的磷酸化。進一步藉由建立磷酸化位點改變的轉殖株，來了解磷酸化與否對於植物體的影響；結果發現，僅有去磷酸化FIN219的轉殖株才能互補fin219-2的外表型，而磷酸化FIN219的轉殖株則否。另外，去磷酸化FIN219轉殖株也會造成遠紅光與茉莉酸訊息傳遞相關基因增加表現，而磷酸化FIN219轉殖株則無法。綜合上述，去磷酸化FIN219可以增強茉莉酸與遠紅光訊息傳遞，而磷酸化FIN219則不具有此功能。因此，推測FIN219磷酸化可作為一個調控遠紅光和茉莉酸訊息傳遞的開關。

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ACS7磷酸化在阿拉伯芥根向地性與鹽耐受性之功能性研究

乙烯是調節植物發育過程的重要植物荷爾蒙之一。1-氨基環丙烷-1-羧化合成酶（ACS）蛋白質在乙烯生合成途徑扮演關鍵角色。第三型ACS7具有非常短的C端延伸，缺乏鈣離子依賴性蛋白質激酶（CDPK）和絲裂原活化蛋白質激酶6 （MPK6）可被磷酸化之位點，但之前研究發現ACS7可以被CDPK16磷酸化，並鑑定出三個磷酸化位點。然而目前仍未知ACS7的三個磷酸化位點在蛋白穩定度及活性的功能。另一方面，先前的研究發現阿拉伯芥acs7-1突變體有較高的耐鹽性，且在我們先前的研究顯示acs7-1突變體在根向地性對鈣離子通道阻斷劑氯化鋰不敏感。為了探討ACS7的三個磷酸化位點在根向地性及耐鹽性的功能，本研究以油菜內酯、離層酸、鹽及氯化鋰或鈣離子螯合劑BAPTA進行處理。acs7-1突變體幼苗在向地性顯示對氯化鋰、離層酸及BAPTA較不敏感，但對油菜內酯較敏感。此外，ACS7的三個磷酸化位點之點突變轉殖株對鹽分之耐受性及氯化鋰處理下之根向地性抑制程度與未突變之轉殖株有別。另外，似乎在Ser216, Thr296, 和Ser299點突變之ACS7-GUS轉殖株中ACS7蛋白質穩定性較未突變之轉殖株差，且ACS7的三個磷酸化位點突變之ACS7重組蛋白質比未突變者酵素活性來得低，因此，本研究發現ACS7的三個磷酸化位點會影響ACS7蛋白質的活性且似乎也會影響蛋白穩定性。

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阿拉伯芥中透過去磷酸酶調節FIN219/JAR1活性並影響藍光及茉莉酸訊息傳遞之功能性研究

阿拉伯芥幼苗透由光受體接收光訊號後,會活化多種具酵素活性的蛋白質並協同賀爾蒙調控光型態發生，並透過轉錄因子或關鍵蛋白質的後轉譯修飾像磷酸化改變狀態，來針對周圍環境做出反應。先前的研究中，藍光環境下， 酪蛋白激酶2(CK2) 會磷酸化FIN219/JAR1。 FIN219/JAR1催化茉莉酸(jasmonate)和異白胺酸(isoleucine)結合，以活化茉莉酸訊息傳遞， 並同時促進植物的光型態發生。 利用LC-MS/MS及microarray分析得到可能參與在藍光中FIN219/JAR1去磷酸化功能之去磷酸酶: 蛋白質去磷酸酶2C型E支的EGR2和H支的PP2CR， 以及蛋白質去磷酸酶2A次單位A 的RCN1蛋白質。目前為止，FIN219不同磷酸化形式的功能仍是未知。在此研究中，使用上述得到之去磷酸酶突變的植株去闡述FIN219/JAR以何種形式來應對藍光及茉莉酸訊息傳遞。利用雙分子螢光互補實驗(BiFC)及in vitro pull-down分析得知FIN219與這些去磷酸酶有直接的交互作用關係。萃取去磷酸酶突變株植物(egr2，pp2cr，rcn1) 蛋白質，並使用磷酸標籤蛋白質電泳，確認egr2，pp2cr照射藍光及外加MeJA處理下，FIN219蛋白質穩定度與磷酸化的形式增加，而rcn1中FIN219磷酸化是不受光調控的。另外植物外加MeJA時，造成egr2，pp2cr和rcn1下胚軸生長抑制，發芽率受到影響, 花青素累積下降以及側根優勢生長，都顯示外加MeJA會使EGR2， PP2CR和PP2ARCN1持續去磷酸化FIN219，以抑制過度的茉莉酸誘導活化。相較於專一性藍光調控的EGR2和 PP2CR，PP2ARCN1則是獨立於光的調控。總體而言，阿拉伯芥的幼苗發育中，FIN219不同的磷酸化形式在串聯藍光及茉莉酸訊息傳遞路徑當中扮演重要的角色。

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改良楊樹木質部原生質體轉殖系統以探討被子植物木材形成之轉錄調控機制

木材對植物的生長發育扮演重要角色，同時也是人類生活中不可或缺的生物資源。而木材形成是相當複雜的生長發育過程，至今其調控機制所知甚少，且多為單一物種中與少數轉錄因子之研究。因此為系統性地探討木材形成的轉錄調控機制，實驗室先前的研究以木本模式植物毛果楊(Populus trichocarpa)為對象，利用轉錄組測序分析(RNA-sequencing)篩選出182個木質部專一表達之轉錄因子，再加上4個以酵母菌單雜合系統(yeast one-hybrid assay)分析得知會結合木質素生合成基因啟動子的轉錄因子，欲透過DNA親合純化測序分析(DNA affinity purification sequencing)建立木材形成之基因調控網絡(gene regulatory network)。然而該網絡僅能探討轉錄因子能否結合下游基因，無法得知轉錄因子如何進行調控。因此本研究將轉錄因子對毛果楊木質部原生質體進行轉殖以過量表達，並抽取total RNA進行轉錄組測序、篩選差異表達基因，該實驗方法稱為原生質體轉錄體活性分析(protoplast transactivation assay-RNA sequencing)。本研究建立毛果楊木質部原生質體轉錄體活性分析系統，得以大規模對基因調控網絡進行功能性驗證，與DNA親合純化測序分析之結果進行合併便可建構出更加完整的木材形成基因調控網絡。本研究進而對玫瑰桉(Eucalyptus grandis)與中國鵝掌楸(Liriodendron chinense)利用相似策略進行探討，以研究木材形成的調控機制在不同物種中是否存在保守性。透過建立毛果楊、玫瑰桉與中國鵝掌楸轉錄因子家族的親緣關係樹，可得知有若干木質部專一表達的轉錄因子有群聚之現象，顯示這些轉錄因子可能具有相似的調控功能。最後，本研究篩選玫瑰桉中13個木質部專一表達的轉錄因子，以進行往後DNA親合純化測序分析的實驗。未來期望透過比較多個物種之木材形成基因調控網絡，能夠較全面且系統性地探究木材形成的保守轉錄調控機制，以進一步了解木本植物的生長發育過程，並協助木材的育種以及品質改良。

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阿拉伯芥富亮胺酸重複類受體激酶 SRF6 參與熱反應之功能性研究

富亮胺酸重複類受體激酶 (LRR-RLKs) 是植物細胞膜上最大的一群RLKs，但大部分成員之功能尚未知。為了探討RLKs基因在熱逆境反應 (HSR) 的角色，本研究檢測九個阿拉伯芥之RLK的突變株在熱逆境 (HS) 下之性狀，並且進一步分析一個受熱誘導表現的RLK基因STRUBBELIG-RECEPTOR-FAMILY 6 (SRF6) 的功能。SRF6 (At1g53730) 編碼一個LRR-RLK，經由先前的分析發現SRF6可能參與在HSR當中。SRF6為一個座落在細胞膜上的蛋白質，利用β-glucuronidase (GUS) 染色分析，發現SRF6廣泛分佈在植物體各時期的組織中。本篇利用細菌表現SRF6的激酶區段並進行活性分析，結果未顯示出其磷酸化活性。兩個不同程度減低SRF6表現量的T-DNA突變株在後天耐熱性 (SAT) 的檢測結果顯示，其存活率高於阿拉伯芥野生型，而大量表現SRF6的轉殖株之存活率則較低。另外，本篇在熱反應的表型觀察中發現，SRF6可能在植物熱逆境下的根生長恢復扮演重要的功能，且srf6植物之內質網 (ER) 逆境反應基因bZIP28和bZIP60的表現量顯著增加。本研究指出一個在植物根組織中非典型熱反應路徑的存在，且與SRF6以及ER逆境反應相關。

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番茄與印度梨形孢菌之共生與誘導番茄系統性抗病之研究

印度梨形孢菌 (Piriformospora indica) 為宿主範圍極廣且具高農業應用價值之植物共生真菌。我們先前研究發現 P. indica 感染番茄與菸草根部後會誘導系統性防禦 (induced systemic resistance，簡稱ISR) 以抗多種根部與葉部病菌，而 RNA-seq 分析結果顯示番茄根部接種 P. indica 後之感染初期會調控植物代謝、賀爾蒙及逆境訊息傳導以利進行共生，且 P. indica 之數個效應蛋白質會影響番茄病害防禦，然而其中具體分子機制仍需進一步釐清。本研究以錐藍染色法觀察番茄感染 P. indica 後不同天數之根部，以解析此菌與番茄之共生階段。轉錄分析結果顯示 P. indica 感染初期會誘導番茄根部之乙烯 (ethylene, ET)、水楊酸 (salicylic acid, SA) 及茉莉酸 (jasmonic acid, JA) 訊息路徑，共生晚期則持續促進番茄根部 ET 訊息路徑以利維持共生，且促進葉部 JA 訊息路徑產生。在共生早期 RLP6、ETR4、ETR6 及 NPL93 在番茄根部之轉錄表現會被誘導，且番茄全株性短暫靜默試驗所得結果指出，這些基因可能是藉由正調控 JA 與 SA 訊息路徑而參與對抗葉部病原菌 Botrytic cinerea (Bc) 與 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) 之防禦反應，且 RLP6 為 P. indica 之共生正向調控者。此外，針對六個 P. indica 之效應蛋白質基因的分析結果顯示，這些基因在共生不同時期具特異性表現，且依病害防禦反應與訊息路徑分析結果推論 PIIN_04363 、PIIN_07152 及 PIIN_09643 可能參與削減植物免疫反應之效應。本研究所得研究結果闡明P. indica 與番茄共生以及誘導 ISR 之關鍵訊息路徑與重要調控因子，預期應有助於未來進一步之基礎科研與農技應用發展。

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阿拉伯芥錳超氧岐化酶基因 (At3g56350) 的功能分析

超氧岐化酶(SOD)可調節過量產生的活性氧(ROS)，以緩解其在植物中的毒性。到目前為止，已在阿拉伯芥發現七個SOD的基因。這些基因分別是錳超氧岐化酶1 (MSD1) ，鐵超氧岐化酶1, 2, 3 (FeSOD1, FeSOD2, FeSOD3)，銅鋅超氧岐化酶1. 2, 3 (Cu/ZnSOD1, Cu/ZnSOD2, Cu/ZnSOD3)。這些SOD同功異構酶坐落在細胞的不同位置中。MnSOD1在粒線體基質，Cu/ZnSOD1在細胞質，Cu/ZnSOD3在過氧化體，而Cu/ZnSOD2，FeSOD1，FeSOD2，FeSOD3皆在葉綠體。現在根據SOD活性膠的結果指出MnSOD2是阿拉伯芥新發現的SOD。MnSOD2坐落於粒線體，其大小為26.89 kDa。相較於MnSOD1 (25.44 kDa)，MnSOD2有更高的分子量。MnSOD2的表現量不受非生物性逆境或是生物性逆境影響。值得注意的是，相較於MnSOD1，其在種子的表現量特別高。根據原態膠體電泳SOD活性試驗，顯示出msd2種子的胚失去了MnSOD的活性。這結果表明，MnSOD1和MnSOD2在種子發育階段的表達具有組織差異。

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阿拉伯芥果膠甲基酯化酶12、53、及68的功能性研究

植物細胞壁是一種動態結構，隨著不同環境刺激而改變以維持植物生存。果膠是初級細胞壁中三個主要組成分之一，它會被果膠甲基酯酶作用，去除果膠中聚半乳醣醛酸上的甲基。而果膠被去除甲基的程度會影響到植物體組織之彈性、柔韌性、緊密程度以及酸鹼性與帶電性。本研究發現阿拉伯芥PME12、53及68受到離層酸抑制，而PME53與68則受到誘導並在熱逆境中反應。由組織化學分析指出，PME12、53及68皆會在根、莖、葉等多個部位表現；PME53及68在ABA處理後會在氣孔大量表現。分析pme12、53及68突變株特性發現，葉部型態較小，而氣孔對ABA之反應也較敏感，且密度更高。在阿拉伯芥原生質體中短暫抑制保衛細胞生合成相關轉錄因子SCRM或MUTE也發現PME53與68表現受到下降。另外，在熱逆境處理下，pme12、53及68突變株有較高的存活率。PME12、53及68酵素活性及分析結果顯示在各種酸鹼環境中此三個酵素之最適活性不同。pme12、53及68突變株在熱處理時，細胞壁果膠去甲基化的情形也比野生型低。因此，PME12、53及68在植物體中參與保衛細胞開合、植物形態以及熱逆境反應等多種功能。

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SUB1A-1在水稻淹水逆境中調控表觀遺傳及基因的轉錄

大部分的水稻都無法耐受長時間的淹水逆境。然而，部分秈稻品系如FR13A因帶有SUBMERGENCE 1A-1（SUB1A-1）基因，因此能耐受淹水逆境；帶有SUB1A-2的秈稻品系卻無法耐受淹水逆境。SUB1A屬於第七群乙烯轉錄因子（group VII ethylene-responsive factor, ERFVII）之一，含有兩個等位基因, SUB1A-1及SUB1A-2。SUB1A-1及SUB1A-2之間僅在第186的氨基酸序列不同，前者帶有Serine，而後者帶有Proline，卻因而造成只有SUB1A-1可被磷酸化。另外，SUB1A-1含有兩個下游基因，ERF66及ERF67，皆同屬於ERFVII,可共同調控淹水逆境。目前雖已找出SUB1A-1的下游基因，但SUB1A-1啟動ERF66及ERF67轉錄的分子機制仍不清楚。 本研究顯示SUB1A-1能與組蛋白乙酰化複合體ADA2b-GCN5相互結合。其中，GCN5是一個組蛋白乙酰基酶。有趣的是，SUB1A-1的磷酸化可增強其與組蛋白乙酰化複合體ADA2b-GCN5結合的能力；反之，SUB1A-2因無法被磷酸化而不能結合。此外yeast two-hybrid 顯示，ADA2b的RLR區域為ADA2b與SUB1A-1相互結合的主要區域。在淹水逆境下，ADA2b及GCN5的基因大量表現，且H3K9組蛋白的乙酰化修飾能力提高。另外，EMSA的結果顯示SUB1A-1的磷酸化能增強其結合上ERF66/ERF67啟動子的能力，且同時過量表達SUB1A-1及組蛋白乙酰化複合體ADA2b-GCN5可顯著提高ERF67的基因表現量。綜合以上所述，我們推測SUB1A-1的磷酸化能促使SUB1A-1與組蛋白乙酰化複合體ADA2b-GCN5結合，並透過改變ERF66/ERF67的染色體結構來促進基因的表達，從而增強水稻對淹水的耐受性。 淹水逆境不僅能促進H3K9的乙酰化修飾，更能提高H3K4的三甲基化修飾，表示不同的組蛋白表觀修飾之間會相互作用。此外，我們鑑定出了數個會與SUB1A-1結合的蛋白質。其中，屬於GT因子的HRA1-L1可能參與在淹水逆境的負向調控機制中。故，我們認為SUB1A-1可與多個轉錄活化因子或轉錄抑制因子作用，以便能快速應對淹水逆境。

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阿拉伯芥組蛋白去甲基化酶JMJ28藉由促進CONSTANS表達參與開花調控

組蛋白去甲基化酶藉由表觀遺傳修飾影響植物生長發育。組蛋白去甲基酶JMJ28屬於KDM3/JHDM2類並具有組蛋白H3賴胺酸9 (H3K9) 去甲基酶的功能。在本研究中發現，jmj28-1及jmj28-2突變體在長日照及短日照的條件下都有延遲開花的表現型。相較於野生型，參與光週期調控開花的基因CO及FT的基因表現在jmj28突變體中有顯著性下調。過量表達JMJ28的轉殖株則表現出提早開花的表現型，並且CO及FT的基因表現有顯著上升。另外，CO上的H3K9甲基化程度在jmj28突變體中有顯著性上升，而在JMJ28的過表達轉殖株則有顯著下降。此外JMJ28會與轉錄因子FBH及TCP有交互作用。JMJ28會直接結合在CO啟動子上，而JMJ28的這種結合作用至少部分依賴於FBH。這些結果說明JMJ28可能透過調控H3K9去甲基化的方式來影響CO基因表現，並參與阿拉伯芥開花調控。