國立臺灣大學分子與細胞生物學研究所學位論文/Institute of Molecular and Cellular Biology
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
已選擇0筆
- 學位論文
Synaptotagmin (Syt) 是一個至少擁有17種成員的蛋白家族，他們被視為一種感應鈣離子的蛋白。在神經細胞中，Syt可以藉由他們的C2A與C2B和鈣離子結合，進而影響神經傳導物質的釋放。先前已經有研究指出，Syt I能夠藉由與鈣離子結合來調控由鈣離子調控胞吐作用(Ca2+-dependent exocytosis)的動態變化。在本論文中我們將探討Syt III在鈣離子調控胞吐作用的動態變化中所扮演的角色。因為我們先前發現，Syt III蛋白在囓齒動物視網膜發育過程中的關鍵時期(P4-P6)的視網膜節細胞與視神經中大量表現，而此時期視網膜會經由自發性的放電反應來調控視野分離，由此推測Syt III在發育過程中可能會藉由調控胞吐作用來影響神經傳導素的釋放並影響發育中雙眼動物的視野分離；然而，目前Syt III如何調控作用的詳細機制仍然尚未明瞭。本論文中，我們將Syt III第386和520個胺基酸利用點突變的方式以降低Syt III其C2A與C2B和鈣離子結合的能力，為了進一步的了解對胞吐作用產生的影響，我們利用單一囊泡安培測定法(Amperometry)直接偵測在神經內分泌細胞(neuroendocrine cell)中神經傳導素的釋放，並且結合了免疫螢光染色及免疫沉澱法來探討Syt III在緻密核心囊泡胞吐作用中的分子機制。 我們的研究結果顯示，Syt III蛋白的主要表現於細胞膜上而非緻密核心囊泡，並且Syt III有增加總胞吐作用的趨勢，而在刺激發生後的中、後期紀錄中，我們發現胞吐作用的釋放頻率明顯高於控制組及突變組(Syt III-C2AB*)，並且，Syt III可增加full fusion在刺激發生的中、後期紀錄中發生的頻率，而在突變的組別則有著和Syt III相反的結果。除此之外，Syt III明顯減少融合孔(fusion pore)的開啟時間，而突變組則會增加融合孔(fusion pore)的開啟時間。在我們提出的胞吐作用動態的模型中，我們發現Syt III會同時增加速率常速kc與kd，表示Syt III會藉由促進緻密核心囊泡離開fusion pore state (O)往dilation state (D)及close state (C)來降低融合孔(fusion pore)的開啟時間，而Syt III-C2AB*則藉由抑制緻密核心囊泡離開fusion pore state (O)往dilation state (D)及close state (C)來增加融合孔(fusion pore)的開啟時間。利用免疫沉澱的方式，我們發現Syt III 在沒有與鈣離子結合的情況下能夠與SN25交互作用，但在有鈣離子的情況下，Syt III與鈣離子結合後會加強和SN25的交互作用。 綜合上述，我們可以得知Syt III能夠藉由其C2A與C2B和鈣離子結合來影響胞吐作用的動態變化，除此之外，Syt III可能會藉由和鈣離子結合來促進緻密核心囊泡往細胞膜的方向移動，藉此來增加刺激發生後的中、後期胞吐作用的發生，並且我們推測Syt III 會藉由與鈣離子結合來增加與SN25的交互作用去減少融合孔(fusion pore)的開啟時間。因此，Syt III可能作為一個細胞膜上的感應蛋白，來調控密核心囊泡胞吐作用的動態變化。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
在漫長的生命進化歷史中，由單細胞生命向多細胞生命進化是一段具有里程碑意義的歷程。毫無疑問，這個過程裡最關鍵的要素即為細胞不對稱性和細胞分化行為的出現。細胞的不對稱性賦予了生命在單細胞水準上將生理功能區域化的能力，並且促使細胞發展出分化行為。時至今日，當我們嘗試揭示上述自然哲學真理的本質，適逢合成生物學迅猛發展。合成生物學是一門日益精密的新興學科，致力於通過設計和構建人工基因線路來研究生命科學。一方面，合成生物學嘗試利用合成的基因元件、線路、裝置和系統以研究生命的自然本質。另一方面，研究者們亦在求索的過程中將天然的生物學系統拆分為可替代的標準化基因元件，且利用它們構建出進化所不曾創造生物學系統和生物學功能。從合成生物學的角度出發，在相對簡單的對稱性細胞中構建人工不對稱裝置，對於未來從頭建立人工多細胞生命、探討細胞分化的分子機制起源以及進一步細化工程細胞的生理功能，都有著重要意義。在我們的研究裡，我們在最簡單、應用最廣泛的基因工程學平臺大腸桿菌（Escherichia coli）中，設計並建立了具有不對稱分佈性質的蛋白質支架工具。同時，揭示了這個支架系統的魯棒性和實用性。我們從新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）中分離並標準化了自組織蛋白PopZ和膜支架蛋白SpmX的基因，通過實驗證明它們之間存在直接相互作用，還發現了這兩種蛋白在不同基因表達比例下特殊的極性分佈規律。在這些發現的基礎上，我們提出“粘性假說”以闡釋這些獨特現象背後的機制，並由此設計並建立了可誘導的單極-雙極分佈轉換蛋白質支架。為了體現這一支架工具的可用性，我們通過雙分子螢光互補實驗（BiFC）實驗證明PopZ/SpmX支架系統可以有效調控第三方蛋白質的活性。還發現與PopZ的聚合能力可以顯著影響與之融合的抑制子蛋白CI功能域之活性。最後，我們證明了SpmX蛋白質的N末端結構域作為一種蛋白質支架適配子（adapter），具有良好的通用性。我們利用這一支架工具，成功在大腸桿菌（E.coli）細胞基礎上構建了一種微米級細胞光電單元（MCPU）。
- 學位論文
對於末期癌症的治療中，化學治療和標靶治療扮演很重要的角色。雖然只針對癌症細胞中特定訊息傳遞路徑中的特定調控因子或是酵素的標靶治療已證實所帶來的副作用較少；但在另一方面，這種攻擊特定目標的專一性卻也會使得原本存在，讓細胞本身對藥物具有抗性的突變更容易被選擇出來，而後反而讓腫瘤細胞得以繼續大量繁衍，導致癌症快速的復發，對於整體存活率的提升有限。至於以抑制細胞分裂為對抗方式的化學治療，則會讓體內其他所有能夠不斷生長分裂的細胞都受到影響，像是骨髓的造血幹細胞，進而造成較多較大的副作用，例如白血球數量的低落，使病人的免疫力下降。因此，我們的研究就是希望在以抑制腫瘤細胞週期進行的治療方式為基礎，但於此同時又能讓骨髓幹細胞存活下來，繼續正常地分裂。我們使用合成生物學的方法，希望建構一個可以在人類細胞中表現的分子迴路，能夠具備此種分辨細胞種類及週期狀態的能力，可以更專一且更有效地殺死癌細胞。當中，我們設計了一個正向自我調節回饋迴路(positive auto-regulatory loop)，藉由四環素 (Tetracycline)調控轉錄活化的系統，以螢光蛋白作為播報因子，希望能在人類細胞內，產生一個雙峰分佈(bimodal distribution)。意即讓所有癌細胞在進入細胞分裂時，都能有效開啟基因迴圈，確保其大量表現引起細胞凋亡的蛋白質，而讓癌細胞無法逃過死劫；而反之，則正常細胞的蛋白表現量幾乎為零，因而都可存活下來。最終，希望這樣一個分子迴路的設計，對於未來的癌症基因治療上，能夠加以應用，有所 助益。
- 學位論文
在合成生物學當中有一種新的基因線路可以在對稱分裂的大腸桿菌中使之表現PopZ蛋白，並產生蛋白極化和細胞不對稱分裂的現象。但是在這個合成生物系統當中，確切的細胞行為以及產生蛋白質極化的原理仍有許多尚未被理解的部分。在合成生物學的研究當中，常常會透過數學模型來分析系統當中關鍵的參數以及最佳化實驗設計。在這篇論文裡，我提出一個多個體的計算模型：這種模型可以用來模擬非同源表現PopZ蛋白的大腸桿菌。模型主要的目的是去描述PopZ透過與同類分子交互作用聚合的現象，以及PopZ是否會形成更高級的結構，並在細胞中產生極化的狀態。論文中會討論模型裡，哪些分子交互作用的規則能夠促使產生穩定而不易崩潰的單極化細胞。模型首先再現了實驗中隨著PopZ表現量差異因而造成細胞極化狀況不同的現象，接著我們在模型裡加入另一個已知會與PopZ交互作用的非同源膜蛋白SpmX，來探討相關的行為。模型再一次重現了實驗中SpmX促進PopZ在細胞當中極化的趨勢。除此之外將模型從二維延展至三維展示了模型的規則同樣適用於更貼近真實細胞生理的狀態。最後，模型導入細胞分裂的現象，相關的模擬結果提供了關於PopZ聚集的焦點是如何被細胞繼承下去，並產生不對稱分裂的現象。這個多個體計算模型提供了一個可以透過電腦模擬來研究PopZ於大腸桿菌中極化的平台。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
許多mRNA在一般情況下會形成二級結構，然而，當轉譯作用進行時，其二級結構必須被解開使得密碼子能夠被呈現出來。先前研究指出核醣體自己本身在轉譯作用進行時即具有解旋酶(helicase)的活性，可以解開mRNA所形成的二級結構。大腸桿菌中rpsO基因轉錄本的5’未轉譯區(5’UTR)能夠藉由形成假結或雙髮夾結構來調控其本身的轉譯作用，但因為雙髮夾結構的SD(Shine-Dalgarno)序列無法被呈現，所以核醣體只能與假結結構結合並開始轉譯作用的進行。除此之外，在假結結構中只有SD序列是暴露出來的，而起始密碼子下游卻緊鄰二級結構，所以核醣體必須解開下游的二級結構才能完成轉譯起始作用。然而，目前對於假結結構在起始作用中哪個階段被核醣體解開的仍然不清楚。 本篇研究透過單分子螢光共振能量轉移技術來探討當核醣體小次單元及起始tRNA存在時，rpsO基因轉錄本之5’未轉錄區的結構會有何變化。研究結果發現，當核醣體小次單元存在並與mRNA結合時，mRNA形成假結結構的比例會增加，與先前研究核醣體小次單元只能和假結結構結合的結果相符。不只如此，當30S結合到假結結構的SD序列上時，核醣體小次單元能夠藉由解開部分mRNA的二級結構來找到起始密碼子AUG。而當同時有30S及起始tRNA出現時，起始tRNA能夠幫助核醣體小次單元將下游的二級結構全部解開，使得前轉譯起始複合體可以完成。以上研究結果顯示，在轉譯起始階段，核醣體小次單元自己本身即可表現解旋酶活性，將具有二級結構的mRNA解開，讓轉譯作用可以順利進行。
- 學位論文
Rotini（Rti）是果蠅的人類GOLPH3蛋白同源物，已知Rti是一個在高基氏體負責調控EXT蛋白群回送運輸的蛋白質。EXT蛋白群是生合成HSPG支鏈所需要的酵素群，當Rti增量或缺失時皆會導致HSPG表現量減少以及Hh訊息傳遞路徑的失常。 果蠅中Wnt/Wingless（Wg）調控翅脈和翅膀周圍剛毛的形成，與Hh同樣都是會受Rti影響表現的morphogen。我們先前的研究中發現在果蠅翅碟上，Rti增量表現時會導致Wg累積於其表現細胞內而無法送至細胞膜，造成Wg訊息傳導的下游目標基因誘發表現量下降，而Rti缺失時Wg染色則沒有明顯改變。因此我們認為Rti增量表現時會影響Wg的分泌。 由文獻得知Wntless（Wls）是負責將Wg由高基氏體送往細胞膜的穿膜蛋白，在Wg表現細胞中會特別聚集在高基氏體而造成較強的染色訊號。當Wg移至細胞膜後，Wls會被內吞回細胞內並由retromer回收至高基氏體以利進行下一循環。Wls缺失會導致Wg蛋白累積在分泌細胞內，這樣的突變性狀類似於Rti增量表現時觀察到的情形。因此本研究目的為探討Rti增量表現是否影響Wls功能而造成Wg堆積在其表現細胞內。 在Rti增量表現的Wg表現細胞中，Wls染色訊號下降，而且Wls與高基氏體的標示蛋白Galt-GFP重疊面積下降，顯示Rti影響Wg表現細胞中Wls蛋白的座落。 在運用hrsD28突變阻礙溶酶體的蛋白降解路徑的實驗條件下，觀察Wg表現細胞中不同Rti表現量時Wls的染色情形，發現在hrsD28突變的組織中Wls染色不變而Wg染色增加；當加上Rti增量表現時，Wls染色恢復成像wild type，另一方面，當Rti缺失時也是Wls染色不變而Wg分泌量增加。綜合以上我們推測Rti可能如同對於EXT蛋白群的影響，以其參與在回送運輸的功能改變Wg表現細胞中Wls位置。
- 學位論文
在脊椎動物發育中的視覺系統內，存在著一種模式化、規律性的放電現象被稱為「視網膜波」，它主要發生於視覺開始之前並且具有獨特的波動狀時空性質，使得正確的視覺網絡能夠形成。目前已經知道視網膜波的產生機制是由一群突觸前神經元－星狀無軸突細胞－週期性的釋放神經傳導物質例如：乙醯膽鹼和γ-氨基丁酸至突觸後神經元－視網膜節細胞，造成其膜電位、鈣離子濃度及下游PKA活性週期性的振盪，最終導致基因表現，造成雙眼連結網路的分離以及視野的區隔。倘若以藥物抑制了視網膜波的產生，則會使得視神經與大腦中樞的連結嚴重受損，因此，了解調控視網膜的產生將有助於研究視覺發育。 星狀無軸突細胞主要藉由鈣離子調控的胞吐作用釋放神經傳導物質，而參與該作用的蛋白質包含了SNARE蛋白以及Synaptotagmin (Syt)。目前在Syt家族裡面有17種亞型蛋白質，其中的Syt I被認為在鈣離子調控的胞吐作用中擔任鈣離子感應者的角色，而先前的研究已經證實Syt I在星狀無軸突細胞中利用其上的兩個C2鈣離子結合區域－C2A及C2B－調控視網膜波的時空特性，另一方面，在視網膜節細胞及視神經中也分別發現了Syt I的轉錄產物及蛋白質的存在，然而，是否視網膜節細胞中的Syt I也能利用鈣離子調控的胞吐作用影響視網膜波的時空性質仍需更進一步的研究。 在本研究中，我們利用大鼠出生一周內的視網膜作為研究材料，在這期間是視網膜波造成視覺發育的關鍵時期。藉由免疫螢光染色發現Syt I表現在內網狀層及視網膜節細胞層中，而在單顆的視網膜節細胞內更發現它位於突觸囊泡及緻密核心囊泡上，這說明了Syt I位於視網膜節細胞中可能可以調控神經傳導物質的釋放。為了瞭解Syt I在視網節細胞中所扮演的角色，我們使Syt I及其鈣離子感應能力降低的突變株(Syt I-C2A*及Syt I-C2B*)專一性的表現在視網膜節細胞中，再利用鈣離子顯像技術紀錄發生於視網膜節細胞層的視網膜波產生的鈣離子變化。結果發現，與控制組相比，當大量表現Syt I時，視網膜波產生的頻率顯著增加，而只有大量表現Syt I-C2A*時才會使得視網膜波產生的頻率顯著下降。此外，就視網膜波在細胞之間傳遞的同步性而言，與Syt I-C2A*相比，大量表現Syt I時大幅降低了同步性質。因此這些結果說明了視網膜節細胞內的Syt I具有調控視網膜波的時空性質的功能，意謂著其可能具有調控分泌反向訊息的功能，進而影響星狀無軸突細胞改變釋放神經傳導物質的機制以及視網膜波的時空模式，而利用藥物實驗，我們發現這個反向的調控訊號是視網膜節細胞釋放的麩胺酸。綜合以上的結果，我們的研究首度指出視網膜節細胞不僅身為視網膜中的唯一的輸出神經元，也同時扮演著藉由其內的Syt I釋放麩胺酸來調控視網膜波產生的角色。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
食物的營養素，像蛋白質、脂肪、碳水化合物、維他命、礦物質等，能夠提供生物體生存所需的能量及維持生物體內的恆定，同時也已經被證實能夠影響生物體的生活史如生長、生殖、壽命等。一般飲食的組成是由不同物質以不同比例加以混和，因此各個物質如何對於生物體產生影響目前仍未完全了解。先前研究發現餵食線蟲Comamonas sp. DA1877比餵食Escherichia coli OP50會使線蟲有更快的生長速度。利用Escherichia coli OP50和Comamonas sp. DA1877這兩種食物，我們研究不同食物對生長速度及脂肪含量的影響與其背後的分子機制。首先我們先比較線蟲在餵食這兩種食物後生長速度的差異，觀察到不只正在食用DA1877的親代會生長加速，子代即使換回食用OP50也還是有生長加速的現象，此現象同時也出現在可以受食物DA1877影響，而抑制螢光表現的轉錄報導線蟲(Pacdh-1::gfp transgenic worms)子代當中。同時我們也透過實驗，確認了影響子代生長速度的因子需要透過卵子傳送，而非透過食物的分泌物或濾液等因素導致。有其他研究指出DA1877中的vitamin B12 是造成生長加速的關鍵因子，因此我們也在食物中補充vitamin B12來觀察子代生長情況，結果發現vitamin B12果然和DA1877食物一般，使線蟲生長加速，並抑制轉錄報導線蟲的螢光表現，其影響也確實能夠傳遞到子代，因此可推論出影響到子代生長的因子很可能就是B12。Vitamin B12是細胞中甲基轉移作用(Trans-methylation)的重要調控因子，酵母菌的研究中發現，酵母菌的生長速度可經由蛋白質protein phosphatase 2(PP2A)的甲基化修飾來調控，因此我們進一步推測DA1877食物中的B12可能藉由調控蛋白質PP2A的甲基化修飾，來影響線蟲生長。實驗結果顯示加入甲基移轉作用的反應物methionine和SAM (S-adenolsylmethionine)於食物中，皆造成線蟲生長加速，而加入methionine造成的生長速度改變，則在甲基移轉作用反應酶(S-adenolsylmethionine synthetase)的突變株和PP2A的突變株中受到抑制。此外，在PP2A的突變株中也觀察到vitamin B12造成的生長速度影響受到抑制。另一方面由於甲基移轉作用也被發現調控脂肪代謝，我們發現食用DA1877的線蟲表現顯著的脂肪儲存量下降，同樣的現象也發生在食物補充 vitamin B12， SAM，或methionine的線蟲中。我們的研究顯示: 食物中的微量營養素(micronutrient) Vitamin B12 會透過促進甲基移轉作用，來降低脂肪儲存量，並經由調控PP2A的甲基化修飾來增進生長速度。接下來我們將針對PP2A甲基化，脂肪儲存量和生長速度間的相互關聯進行深入研究，並探討甲基移轉作用是否仍調控其他反應，而造成生長速度的改變。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
在大腸桿菌裡，dnaX基因的初級轉錄本(transcript)可以藉由-1核醣體框架位移(-1 ribosomal frameshifting)的方式，轉譯成兩種去氧核醣核酸聚合酶III(DNA polymerase III)所需之次單元：gamma (γ) 和tau (τ)。要能夠造成-1核醣體框架位移，mRNA上就必需要有三個重要的因素，分別為內部SD序列(internal Shine- Dalgarno sequence，後稱iSD序列)、滑動序列(slippery sequence)以及一個二級結構。當一個核醣體的轉譯作用進行到滑動序列的時候，核醣體的小次單元(30S)中的16S核醣體RNA會和iSD序列產生交互作用；於此同時，位於下游的二級結構也會給予核醣體一個阻力。當這兩種因素產生的物理效應一起作用，就可能會使該核醣體暫時停滯而發生框架位移(frameshifting)，這種停滯稱為核醣體暫停(ribosome pausing)。因此為了探討這兩種因素與核醣體暫停彼此之間的關係，我們同時使用了大腸桿菌細胞內(in vivo)以及細胞外(in vitro)實驗來進行。 本實驗著重在大腸桿菌細胞外實驗，並以細胞內實驗來作為輔助實驗。我們使用dnaX序列來當作實驗的模型並修改了滑動序列，讓核醣體沒辦法進行-1框架位移；這麼一來，我們就可以直接觀察iSD序列和二級結構對核醣體暫停的影響。再者，為了避免聚核醣體(polyribosome)的形成，我們縮短了起始密碼子(start codon)和二級結構之間的距離，當核醣體因二級結構而暫停時，下一個核醣體不會結合於起始密碼子，因此整體的轉譯速率會下降。透過觀察蛋白的表現量，我們發現iSD序列和二級結構都會造成核醣體暫停；而我們更進一步發現，二級結構是造成核醣體暫停的主因。除此之外，我們也發現30S會結合在iSD序列，但是並不會表現蛋白，卡住的30S也會阻礙下一個核醣體進行正常的起始作用，使得蛋白的表現量降低。而卡住的30S有可能會自動與mRNA分開，或是被另一個即將進行起始作用的核醣體給置換掉。另外，若我們讓兩個核醣體可以同時結合在起始密碼子和二級結構之間，則會讓核醣體暫停的效果大大地降低。
- 學位論文
細胞遷移對於生物的生長和發育相當重要。在雌雄同體的線蟲中，生殖腺(gonad)的發育型態決定於位於生殖腺兩端遠頂細胞(distal tip cell)的遷移路徑，而開啟遠頂細胞進行向背遷移的訊息則是經由Netrin的受器(receptor) UNC-5所決定，另外unc-5的表現則是由上游的轉錄因子(transcription factor) DAF-12、LIN-29以及BLMP-1所調控，先前的研究指出LIN-29和DAF-12會促進unc-5的表現，而BLMP-1則會抑制unc-5表現。我們發現調控生理時間的基因lin-42能夠促進blmp-1及抑制lin-29在發育早期的表現(L2~early L3)，來避免DTC提早進行轉彎。然而我們意外在blmp-1; daf-12的雙突變中觀察到包含正常、提早轉彎以及不轉彎的多樣(heterogeneous)突變性狀。為了探討多樣性狀的產生原因，我們利用轉錄報導基因(transcription reporter)以及單一分子螢光同位雜交法(smFISH)來觀察blmp-1是否會對lin-29及unc-5有未知的調控，結果得知blmp-1會在早期抑制lin-29的表現但是在晚期(mid L3~early L4)則是促進，此結果證實BLMP-1會經由促進lin-29進而調控unc-5的表現，而多樣性狀的產生可能是由於lin-29的不正常表現造成。我們同時建立了一個數學模擬程式來驗證lin-29及unc-5的表現形態對於性狀的影響，理論模擬的結果也顯示blmp-1;daf-12雙突變中多樣性的性狀是因為UNC-5蛋白的提早表現，以及表現較低很接近向背遷移時的閾值(threshold)所造成。我們也在特定時期調控上游lin-42的表現觀察到能提高lin-29及unc-5的轉錄，進而使UNC-5遠離閾值並降低不轉彎的性狀比例。然而我們發現在unc-5完全失去功能的突變中(null allele)，後端(posterior)的生殖線仍然有大約30%的遠頂細胞是能正常進行向背遷移，但是當daf-12和lin-29同時突變時，全部的遠頂細胞都不會進行向背遷移。由這個結果我們推測除了UNC-5以外或許還有其他調控向背遷移的引導系統(guidance system)，並且此引導系統的表現是受到DAF-12和LIN-29調控。我們利用DAF-12和LIN-29的DNA結合序列和基因功能性測試發現INA-1和MIG-6會與UNC-5共同調控遠頂細胞進行向背遷移。這項研究使遠頂細胞遷移的空間及時間調控機制更加完善，並且我們也利用基因調控機制解釋了在blmp-1; daf-12雙突變中多樣性狀產生的原因。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。