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線蟲小熱休克蛋白sHSP12.2與sHSP12.3之物化性質鑑定 : 最小之熱休克蛋白的分子保護活性評估

小熱休克蛋白家族為一種在生物體內含量豐富且普遍存在的逆境壓力刺激蛋白。此家族的成員其單元體介於 12∼45 kDa，並可形成分子量 200∼800 kDa的聚合體。小熱休克蛋白（sHSPs）的序列同源性並不大，但它們在C端有一段保守性區域，稱為 α-水晶體蛋白保守區域，約為 80∼100 個胺基酸；而在N端及C末端延伸區，其胺基酸序列及長度則有很大的變異性。 線蟲的基因體計畫已於 1998 年完成，它是第一個基因體序列被完全定出來的多細胞生物。相較於原核生物，線蟲與多細胞真核生物之基因序列有較高的同源性。因此，我們以線蟲的小熱休克蛋白為在實驗材料，進行本論文之研究。 此論文研究之目的在於探討線蟲中小熱休克蛋白 sHSP12.2 與 sHSP12.3 的基本物化特性以及是否具有分子保護活性，並作分析比較。以分析級超高速離心及交叉連結實驗得知 sHSP12.2 與 12.3 皆為四聚體的蛋白；在熱穩定度上，sHSP12.3 (Tm＞90℃) 較 sHSP12.2 (Tm＝62℃) 穩定。在二級結構上主要以 β-摺板構成，並會隨著環境溫度的提高而使結構變成不規則構形，而此現象也伴隨著內在及外在螢光光譜訊號強度的減弱，其代表著色胺酸殘基在水溶液的暴露性增加。這些二、三級結構上的改變可能是 sHSP12.2 與 12.3 原本就很弱的分子保護者活性消失，及其受質蛋白質產生變性沈澱的主因。此現象與以前研究之小熱休克蛋白在預熱狀態下會增加分子保護者活性的特性不同。另外，進一步以二維電泳及 MALDI-TOF 質譜方法找到加熱逆境刺激下所產生的 sHSP12.2 和 12.3 兩種目標蛋白。這兩個特異的線蟲小熱休克蛋白之生理功能是未來的研究方向。

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人類I醣轉化酶基因轉錄調控區域研究

人類I基因有三種isoforms，分別命名為IGnTA、IGnTB和IGnTC。這三種isoforms有相同的exon 2與exon 3，但卻有不同的exon 1 (1A、1B和1C)。它們的表現量在不同的組織或細胞中不盡相同，例如IGnTC僅表現在紅血球細胞，而IGnTB僅表現在水晶體上皮細胞，且每一個不同exon 1上游由不同的promoters所主導。在這次研究中，我們發現I基因A型(IGnTA)上游有兩段可能的調控區，一段在-75/+151區域，另一段在-2148/-1917區域。在+75/-151區域中有一段可能的GATA-1結合序列TGATAG，而在-2148/-1917區域中則有一段可能的NF-E2 / AP-1結合序列CTGAGTCA，而且在-2148/-1917區域中調控轉錄的序列很可能是一enhancer。

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精胺酸定點突變對嗜熱短桿菌Lon蛋白水解酵素熱穩定度及功能之影響

維持蛋白質弁鉬P結構的恆定對生物細胞正常運作是相當重要的。在細胞內，透過蛋白酶分解可去除弁鄐庰硎c上不正常的蛋白並且控制一些調控性蛋白的運作。細胞內的蛋白質分解主要是藉由一種ATP依賴性寡聚蛋白水解酶(ATP-dependent oligomeric protease)所執行。在大腸桿菌中，目前已發現的ATP依賴性蛋白水解酶共有五種，分別為：Lon，FtsH，ClpAP，ClpXP，與HslUV。 在實驗室先前研究中，已從台灣烏來溫泉菌-嗜熱短桿菌(Brevibacillus thermoruber WR-249)中選殖出Lon蛋白酶(Bt-Lon)，並對其作生化鑑定。在先前研究中，我們發現到Bt-Lon的鹼性氨基酸組成中含有較高比例的精胺酸 (arginine)。我們認為此現象可能與Bt-Lon的DNA結合活性及熱穩定相關。因此在本論文中，我們從Bt-Lon選出七個分佈於不同弁鈰洈犖邆i酸，並利用單點突變來探討它們所扮演的弁鄔囧丹漶A它們分別為Arg98，Arg370，Arg518，Arg557，Arg566，Arg590，與Arg697。 由圓二色偏光儀及螢光儀光譜顯示，Bt-Lon的二級及三級結構並未受到上述七個精胺酸單點突變的影響而改變。由熱變性實驗的變性曲線可知，所有的突變型Bt-Lon的Tm值與野生型相近，均約為71.5 °C。換言之，由丙胺酸取代上述精胺酸的單點突變並不影響Bt-Lon的熱穩定度。 在酵素活性方面，所有突變型Bt-Lon均具有與野生型類似的蛋白水解酶及ATP水解酶活性。在DNA結合活性方面，R518A，R557A，與R566A這三個突變型蛋白的DNA結合力則顯著降低。更進一步，我們發現到DNA無法活化R518A與R566A兩個突變型蛋白的酵素活性。由Bt-Lon的一級結構得知，Arg518與Arg566皆位於受質偵測識別弁鈰?sensor- and substrate- discrimination domain, SSD domain)。而Bt-Lon的SSD弁鈰洃w被證實具有DNA結合弁遄C在Bt-SSD弁鈰洈犒q腦模擬結構中，含有一個高密度正電凹面區，而Arg518與Arg566正好位在此區內。以上結果顯示，這個高密度正電凹面區可能就是Bt-Lon的DNA結合區，而位於此區的Arg518與Arg566可能直接參與Bt-Lon與DNA的結合。

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共表現與純化酵母菌monopolin蛋白複合體及分析Csm1/Lrs4蛋白複合體分子組成

Monopolin 蛋白質複合體為酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在第一次減數分裂時期所形成的蛋白質複合體。Csm1與Lrs4此時會從核仁位置移動至姊妹染色體著絲點附近與只在減數分裂時才表現的Mam1結合，形成由Mam1/Csm1/Lrs4 所組成的monoplin蛋白複合體，功能在於促使姊妹染色體的著絲粒結合於同方向性的紡綞絲，幫助同源染色體的異向分離及促使姊妹染色體的同向移動，使得第一次減數分裂得以順利進行，並確保染色體的正確分離。 在此我們利用高效能選殖的方式，得到能產生大量溶解蛋白的Mam1、Csm1與Lrs4融合蛋白殖株，利用單獨表現方式與Ni-NTA親合管柱，大量純化His6-Csm1蛋白。此外，我們成功在BL21-CodonPlus(DE3)大腸桿菌中同時轉型兩個帶有不同融合蛋白的基因質體以共同誘導表現的方式表達Csm1/Lrs4及Mam1/Csm1/Lrs4蛋白複合體並利用接於目標蛋白上的融合蛋白共同純化Csm1/Lrs4及Mam1/Csm1/Lrs4 蛋白複合體。本實驗證實Csm1與Lrs4及Mam1、Csm1與Lrs4分別可在in vitro的狀態下形成蛋白質複合體。另一方面，利用分子篩管柱層析以及蔗糖梯度溶液高速離心沉降實驗，我們測定Csm1單獨以三聚體的形式存在，而其與Lrs4則可能會利用超捲曲螺旋的區塊交互作用而結合，形成Csm1與Lrs4為三對三結合的異六聚體蛋白複合體。

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順式─十一異戊二烯焦磷酸及反式─八異戊二烯焦磷酸合成酶催化的重要胺基酸及其反應機制

類異戊二烯族化合物廣泛分布於自然界是由異戊二烯焦磷酸構成的聚合物。此類化合物的生合成是由一類異戊二烯轉移酵素所催化。這類酵素催化多個含5個碳異戊二烯焦磷酸和含15個碳法呢基焦磷酸結合生成長鏈產物。這些酵素扮演著重要的生理弁遄A例如十一異戊二烯焦磷酸合成酵素產生的55個碳的產物可攜帶醣質以合成細菌胞壁，此酵素的活性抑制劑可作為抗生素藥物；八異戊二烯焦磷酸合成酵素(Octaprenyl pyrophosphate synthase)催化五個異戊二烯焦磷酸和法呢基焦磷酸反應產生含40個碳的產物可作為ubiquinone支鏈。我們先前已研究此二酵素的反應動力學及三度空間結構，根據結構、一些位於活性區域的氨基酸可能參與基質結合或催化反應，尤其是反應中扮演general acid and base的氨基酸仍不清楚，本篇論文我企圖針對酵素活性對於酸鹼值的變化配合定點突變來找出這些重要的氨基酸，也發展一些新穎的研究方法。

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利用耐熱蛋白Sso7d融合至植酸脢N端設計具耐熱性之植酸脢: Sso7d-Phytase熱穩定性之分析

在蛋白質科學的研究中，蛋白質的耐熱性是個非常有趣的研究議題。耐熱的酵素特別在工業界有廣泛的應用。過去曾有無數研究嘗試去增加蛋白質的耐熱性。在本篇論文中，提出了一種嶄新的策略去設計製造具有耐熱性的酵素。 Sso7d是一種可能具有chaperone功能的耐熱性蛋白。 將Sso7d與一種在動物食品工業中具有重要價值的酵素植酸脢(phytase)接在一起，期望能製造出具有耐熱性之植酸脢。經過一連串的嘗試希望能得到可溶的Sso7d-phytase，終於純化出四種具有不同連接長度的的Sso7d-phytase融合蛋白。最後利用活性測試及圓二色光譜去研究Sso7d-phytase的耐熱性。 活性測試的結果顯示與Sso7d融合並不會影響其最佳催化溫度，但會些微增進植酸脢對熱處理的耐受度。另一方面，圓二色光譜的結果則顯示了與Sso7d融合會幫助植酸脢在熱變性後的回復摺疊。回復的程度會受到融合蛋白間連接長度縮短與ATP/Mg2+的存在而增加。 本研究暗示了Sso7d可能具有chaperone的功能，並且利用Sso7d融合蛋白去設計製造具耐熱性的蛋白質是種可行的方法。

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質譜分析有效應用於醣質定序與硫酸化鑑定

黏蛋白種類 (mucin-type) 的醣化現象 (O-glycosylation)，其醣類結構在眾多修飾蛋白質的醣類中最為複雜，因此在醣質體結構圖譜 (glycomic mapping) 及定序的領域中仍屬於複雜和難以解決的一環。O-glycans 的結構組成複雜的原因在於由不同種類的核心 (core) 結構、延伸的醣鏈骨架及末端結構有眾多不同的醣質及化學修飾 (岩藻醣 fucose、唾液酸 sialic acids、硫酸化 sulfation)。現今仍未有快速及有效的O-glycans 結構分析，因此希望藉著質譜儀的分析可以快速得到細胞內O-glycans醣質現象的輪廓，且藉著串聯式質譜快速地得到O-glycans 的核心及末端結構的修飾，其為與外界作用重要的因子。所以先用已廣泛被研究的牛頜下腺黏蛋白 (bovine submaxillary mucins) 當作標準品得O-glycans後，(1) 將醣經甲基化處理後，用串聯式質譜儀建立特殊斷片模式以快速分析O-glycans結構，(2) 藉由碘酸鈉 (periodate oxidation) 的化學處理，連結質譜儀分析得O-glycans，其 3 arm 和 6 arm 的醣類組成，(3) 用陰離子交換樹酯建立純化方法 (fractionation) 以偵測微量和帶負離子的醣。接著取罹患肺氣囊腫的病人唾液和來自於健康病人的呼吸道組織切片細胞培養的分泌物用已建立的純化方法分離出帶有硫酸根的醣，同樣的用串聯式質譜建立未經過處理和經過甲基化處理帶有硫酸根的O-glycans的特殊斷片模式。結合樣品前處理和質譜儀分析，我們可以進一步快速偵測不同樣品來源下，帶有硫酸根的醣其差異性表現。 接著，將已建立好快速分析O-glycans結構的方法應用在富含O-glycans的鼠舌下腺醣蛋白 (rat sublingual glycoproteins) 和人類子宮囊醣蛋白350 (human ovarian cyst glycoprotein350)，檢視是否能印證利用凝集素 (lectin) 得知的醣纇結構。利用質譜分析得知鼠舌下腺醣蛋白的O-glycan結構特徵為core 3 或 core 4 為主的核心結構，延伸出去的是type 2 LacNAc醣鏈骨架且其末端有唾液酸修飾、無硫酸根修飾。相反的，人類子宮囊醣蛋白350 的 O-glycan結構主要以core 1 或 core 2 為主的核心結構，延伸出的醣鏈為延展性 (extended) type 1 LacNAc醣鏈並從半乳醣殘基 (galactose residue) 6 arm分支出 type 2 LacNAc醣鏈，其末端半乳醣醣基有唾液酸的修飾。現今利用質譜儀的定序分析可以支持前人所預測人類子宮囊醣蛋白上的O-glycan結構；且利用已建立的特殊斷片模式只偵測到Lewisa/x 的斷片可以得知樣品來源是來自non-secretor 的提供者。此外，在負離子模式下的質譜儀分析發現人類子宮囊醣蛋白350 有硫酸根修飾的 O-glycans 存在。除了成功鑑定數個黏蛋白上的未知醣類結構外，主要想闡示可藉由質譜儀及串聯式質譜分析快速的分析醣質體內醣化現象的輪廓及其主要核心結構和末端結構修飾；配合凝集素 (lectin) 的研究可以進一步有意義的探討影響醣化作用的醣轉移酵素脢的作用機制。

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以化學修飾法與定點突變法研究無乳鏈球菌之 唾液酸合成酶內必需的半胱胺酸與精胺酸

B型無乳鏈球菌（Group B Streptococcus agalactiae）含唾液酸的莢膜，能避免補體C3b的沉澱或巨噬細胞的吞噬，使菌體可經由垂直感染造成新生兒敗血症或腦膜炎。莢膜多醣的產生及其結構的完整性，已被報導為該菌的致病毒性因子。而唾液酸位於莢膜上寡醣單元（NeuAc-

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蠍毒中鉀離子通道抑制蛋白,Tc32之結構探討

中文摘要 Tc32是從Tityus cambridgei 蠍子的毒液中所純化而來的鉀離子通道抑制胜肽，其本身由35個氨基酸所組成 (TGPQTTCQAAMCEAGCKGLGKSMESCQG DTCKCKA)，含有三對雙硫鍵，並可辨識Shaker B和Kv1.3兩種鉀離子通道。過往對於鉀離子通道抑制胜肽的研究，認為在這些蠍毒胜肽中,有一共同的三級空間結構特徵,做為抑制鉀離子通道的機制,此一特徵為在27號位置的氨基酸均為Lys，並有一個空間上與其鄰近的芳香族氨基酸，並以一個NH3+和一個芳香族的支鍊,做為插入鉀離子通道與提供疏水性親合力的來源。但是在Tc32的氨基酸序列中，不但沒有任何的芳香族氨基酸存在,而且27號氨基酸是Ser。而Tc32也因其獨特的氨基酸序列，而被歸類為第18個a-KTx 的subfamily的第一個成員。在我們的研究中，先藉著胜肽固相合成法得到Tc32胜肽，並摺疊成具活性的構形，接著以逆相高效能管柱層析法純化後，進一步以旋光光譜儀與核磁共振光譜解出Tc32的三級立體結構。在利用X-PLOR分析軟體，計算所得Tc32的20個最小能量結構後，我們發現Tc32與其它的a-KTx family類似,在N端形成一段a螺旋(Ala9-Gly18), 在C端形成一對反平行b摺疊(Ser22 -Gln27, Thr30 -Cys34)，並由三對雙硫鍵所連結(Cys7-Cys26, Cys12- Cys31 和Cys16 -Cys33 )。而不同的地方在於，Tc32 的N端為非固定構形區域，而可能與鉀離子通道結合的Lys，則集中於第二段的b摺疊(Lys32,Lys34)。根據與其它已知結構的a-KTx family蠍毒比較。我們認為Tc32是可能是藉由極性和帶正電的鹼性氨基酸,與鉀離子通道的表面形成親水性親合力或是鹽橋,而讓Tc32不需藉由芳香族支鍊所提供的疏水性親合力,便能與鉀離子通道結合,進而阻礙鉀離子的通過。因此藉由Tc32的三級結構研究，可進一步解釋蠍毒胜肽與鉀離子通道的作用機制，並提供對於離子通道相關研究的資訊。而近年來也有針對於免疫系統上的鉀離子通道Kv1.3做藥物的設計，所以也希望我們的成果對這方面的發展能有所幫助。

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運用限制酶進行基因表現分析之生物資訊解決方案

在以限制酶分析基因家族表現的實驗中，研究者必須先設計引子去放大目標基因家族。而之前我們實驗室的研究目標是人類的酪胺酸磷酸激活酶(tyrosine kinase)，當時設計引子的方法是：已知在酪胺酸磷酸激活酶的催化功能區塊中，DFG與DVW是這個家族中絕大部分基因都具有的兩個區域，於是便可以把它們轉回相對應的基因密碼，再與當時已知的所有人類的酪胺酸磷酸激活酶作比對並延伸至適合的長度，而這兩段序列就可以拿來作為放大酪胺酸磷酸激活酶基因家族的引子。 現在由於有了功能區塊資料庫﹝Conserved domain database﹞以及其他生物資訊方面的工具及資料，我們可把這種設計引子的程序自動化，使研究者只需執行程式，就可得到適合其目標基因家族的引子。除此之外，在以限制酶切聚合酶鏈反應產物後，要做片段大小的比對工作，也可由這個程式來進行，程式提供的這兩個功能，摒除了人工設計引子及比對片段大小時可能發生的錯誤，因而增進了基因表現分析實驗的精確性與可信度。