國立臺灣大學生化科學研究所學位論文/Institute of Biochemical Sciences
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
已選擇0筆
- 學位論文
第一部分： 已知TTP藉由與多AU序列的結合導致成熟訊息核醣核酸的不穩定，本實驗室先前利用phage-display尋找與TTP交互作用的蛋白質來進一步瞭解TTP的作用機制。phage-display數據顯示PABPN1與TTP有交互作用。PABPN1可以幫助訊息核醣核酸的聚腺苷酸化 (polyadenylation)並增加聚腺苷酸化酶 [Poly(A) polymerase]對聚腺苷酸的親和性。聚腺苷酸化在訊息核醣核酸由細胞核到細胞質的運輸、本身穩定度以及轉譯效率的維持都扮演重要角色。本論文使用共同免疫沉澱法確認TTP與PABPN1的交互作用，雖然TTP與PABPN1都存在於細胞質與細胞核，但兩者的交互作用只在細胞核內。若在細胞內表現侷限在細胞核內的突變TTP，可以觀察到此突變TTP具有降低帶有腫瘤壞死因子的多AU序列的報導基因的表現蛋白酵素效力降低。有趣的是，在試管中TTP被發現藉由與PABPN1交互作用造成帶有多AU序列的訊息核醣核酸的聚腺苷酸化程度降低。當在小鼠巨噬細胞RAW264.7中以脂多醣誘導腫瘤壞死因子的表現，可以觀察到在細胞核內被誘導出腫瘤壞死因子的訊息核醣核酸的聚腺苷酸化程度的降低與被誘導表現增加的TTP具有關連性。結論是，TTP除了已知在細胞質內造成帶有多AU序列的訊息核醣核酸的降解功能，TTP在細胞核內藉由與PABPN1的交互作用來調節帶有多AU序列的訊息核醣核酸的表現。 第二部分： 免疫反應仰賴於MAPK訊息傳遞，特別是p38與Jnk。這些激酶會經由原發炎促進劑刺激細胞而受到活化，並誘發許多免疫調節基因的表現進而引起發炎或免疫反應。p38與Jnk會經由DUSP的其中一員, Mkp-1, 將其去磷酸化而喪失活性。近年報導提出Mkp-1的確在免疫反應中的有重要的調節功能。本論文中發現在以脂多醣刺激的小鼠巨噬細胞RAW264.7中Mkp-1的訊息核醣核酸的表現在三十至六十分鐘被快速活化，接著在刺激兩小時後又降低不到誘發最多量的一半。在此Mkp-1的訊息核醣核酸的增多與減少是受到何種轉綠因子與訊息傳遞路徑調控將在本論文中被探討。發現屬於Atf/Creb家族蛋白的Creb1與Atf3會與Mkp-1基因的啟動子 (promoter)結合並會增加帶有Mkp-1啟動子的報導基因的產物酵素的活性。若在RAW264.7中造成Atf3的基因靜默，可以觀察到Mkp-1訊息核醣核酸表現降低。因此，Creb1與Atf3會正向調節Mkp-1的表現。另外，在脂多醣刺激兩小時後的RAW264.7中可以觀察到PI3K訊息傳遞路徑的活化，已知該訊息途徑會負向調節TLR4的訊息途徑。當細胞內存在PI3K訊息途徑的抑制子，Wortmannin時，Mkp-1的訊息核醣核酸量會提升。藉由微陣列矩陣分析與即時聚合酶反應，Id3被鑑定為PI3K下游的轉錄因子來負向調節Mkp-1核醣核酸的表現。未來將需要更多實驗證明在脂多醣刺激的RAW264.7中Id3調節Mkp-1核醣核酸表現的分子機制。
- 學位論文
雙酚 A（BPA）據之前研究指出，對生物具有雌激素活性和毒性。本篇論文中,篩選出具有降解雙酚 A的降解菌株Rhodococcus pyridinivorans (PDB9)。生物降解菌株生長在具基本鹽類的培養液中,內含有雙酚 A（50毫克/升）作為唯一碳源的培養基，菌株48小時內降解90％的雙酚 A。藉由高壓液相層析儀(High-performance liquid chromatography)及液相層析串聯質譜儀(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)，鑑定降解後的中間產物，其中鑑定出四個中間產物。藉由二維電泳（Two Dimensional Electrophoresis），膠體內水解(In-gel digestion)，質譜分析，並利用2D-ImagesMaster分析軟體，鑑定出與對造組有差異的蛋白質與酵素，其中包括五個差異蛋白質，分別為N-二甲基亞硝胺甲醇去氫酶(NDMA-dependent methanol dehydrogenase)，延長因子Tu (Elongation factor Tu)，半胱氨酸合酶(Cysteine synthase)，電子轉移黃素蛋白β/α亞基(Electron transfer flavoprotein beta/alpha subunit)，ATP依賴蛋白降解酶(ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit)。我們已經分離了一株雙酚A降解菌Rhodococcus pyridinivorans，這幾乎可以在48小時內完全降解50mg/L BPA。此外，使用液相質譜，我們發現了一種新的降解途徑。藉由以上實驗技術，可以運用在之後生物催化與生物降解等探討。
- 學位論文
理論上，T細胞於胸腺發育時，隨機將不同 T細胞接受器基因片段組裝，經此 V(D)J 重組步驟，最後產生出 T細胞接受器 (TCR)。而 T細胞接受器中的互補決定區 3 (CDR3) 已知是屬於高變異區域。利用三份來源不同的胸腺檢體，互補決定區 3 的研究使我們從中獲取了許多寶貴資訊。本研究著重於兩個主題，首先，我們調查了人類胸腺中，T 細胞 α 鏈接收器在變異區域(Variable region)及接合區域 (Joining region)的重組情形，亦解構出這三份檢體中的核苷酸組成、胺基酸組成、一種新型態的混合型 Jα T細胞接受器 (hybrid Jα TCR)及公有 T細胞接受器(Public TCR) 。第二，利用實驗方法與電腦程式 (MATLAB)，進行人類胸腺 T 細胞 α 鏈接收器庫的估計。本研究的貢獻在於發現互補決定區 3 的特色、提供支持 Vα-Jα 重組基因座收縮理論的證據以及探索公有 T 細胞接受器之形成機制。除此之外，我們估計出胸腺 T細胞 α鏈接收器庫(thymic TCRα repertoire)大小約略在10^8到10^9。
- 學位論文
P1醣抗原是屬於紅血球抗原系統中的一員，在族群中可區分為P1表現型與P1非表現型兩種型別。P1醣抗原由Galα1-4Galβ1-4GlcNAc的結構所決定，由過去的研究已推斷紅血球表面P1醣抗原的表現極有可能是由α1,4-galactosyltransferase (A4GALT)所負責；而個體間P1抗原表現型與非表現型可能是由A4GALT基因表現量的差異所造成，因此我們推測A4GALT是受到了不同的轉錄調控，造成了P1抗原表現或缺失。 為了要證明這個推測，首先必須要證明A4GALT在紅血球中的轉錄調控機制，找出表現A4GALT所需的轉錄因子。在實驗室之前的研究中，已證明P1抗原表現型與非表現型和A4GALT基因intron 1區域的8個single-nucleotide polymorphism (SNP)有強烈的關聯。我們由這些SNP位點推測出8個可能結合的轉錄因子。我們利用表現載體將這些轉錄因子大量表現於K562細胞中，而後進行qPCR，偵測這些轉錄因子對A4GALT基因表現的影響。 大量表現轉錄因子Ikaros或Aiolos後，利用qPCR測出A4GALT transcript約上升5倍。接著利用reporter assay測試Ikaros或Aiolos對P1抗原表現型與非表現型對偶基因(allele)作用後的差異，進一步確認轉錄因子Ikaros或Aiolos是否造成A4GALT基因表現差異，但實驗結果無法看出Ikaros和Aiolos對P1抗原表現型與非表現型對偶基因有明顯影響。我們推測可能需要多種轉錄因子的合作，使P1抗原表現型與非表現型對偶基因的轉錄活性有明顯差異，此研究還需要未來更多的實驗進一步探討，以了解A4GALT的轉錄調控和紅血球P1抗原表現型與非表現型的分子遺傳機制。
- 學位論文
蛋白質酪胺酸去磷酸酶 (protein tyrosine phosphatases；PTPs)與蛋白質酪胺酸磷酸酶 (Protein tyrosine kinases) 參與在細胞中許多發育生長的過程。在果蠅的研究中發現有許多的受器型蛋白質酪胺酸去磷酸酶有參與在神經肌肉接合處(neuromuscular junction ,NMJ)的發育，如 dLAR、dPTP69D 以及 dPTP99A。但有關於非受器型蛋白質酪胺酸去磷酸酶(non-transmembrane PTPs；NTPTPs)在神經肌肉接合處發育上扮演的角色仍然不清楚。近期研究報導指出，果蠅其中一個非受器型蛋白質酪胺酸去磷酸酶，dPTPMmeg，對於其腦部蕈狀體(mushroom body)軸突伸展(axon projection)的建立是必須的。在本論文中，我們主要研究dPTPmeg 在神經肌肉接合處所扮演的角色。我們發現，當 dPTPmeg 過度表現時會使得果蠅神經肌肉接合處的 type Ib bouton 數量減少，但是在 dPTPmeg 基因突變的果蠅中我們並沒有看在神經肌肉接合處發育上有的明顯地缺陷。我們進一步發現 Src 是 dPTPmeg 交互作用的蛋白質，先前報導已發現 Src 對於神經肌肉接合處的發育非常重要，基因遺傳分析的資料顯示，Src 表現下降能夠些微地恢復dPTPmeg 所造成的缺陷。因此，對於正常地神經肌肉交界處的發育來說， dPTPmeg與 Src 之間的交互作用是很重要的。
- 學位論文
丙酮酸(Pyruvate)為糖解(Glycolysis)作用的終產物，並可以再繼續進行發酵反應產生乳酸或乙醇，或進入粒線體進行檸檬酸循環產生更大的能量。如同其他的α酮酸(α-keto acids)，丙酮酸具有抗氧化的性質，例如以非酵素作用方式與過氧化氫作用產生乙酸、二氧化碳及水。過去認為丙酮酸是醣類代謝的重要調控分子，藉由異位調節(Allosteric regulation)來調控糖解作用及檸檬酸循環的速率。隨著近年的代謝體學發展，許多代謝小分子被發現除了在本身代謝途徑中的調控，同時也具有其他生理上的意義。我們藉由串連疏水性層析及質譜儀分析，發現丙酮酸和PLC-β1可能具有極佳之結合力，當HEK(Human embryonic kidney)細胞經過glucose starvation並以丙酮酸處理後，會造成PLC-β1活化，並由細胞質轉移至細胞核中，在核內活化下游的PKC pathway。此一現象與HEK細胞經不同濃度之葡萄糖處理後之表現相符，也佐證了葡萄糖代謝會引發特定訊息傳導的想法，而且丙酮酸可能是媒介為醣類代謝訊息傳導的關鍵物。同時外加入的丙酮酸，也會活化ERK-MAPK pathway，並可能在核內活化PLC-β1，利用抑制劑，我們確認丙酮酸是同時活化PLC-β1及ERK-MAPK pathway，而非單一的藉由ERK 1/2來活化核內的PLC-β1。當外加丙酮酸時，不論是在正常細胞或過度表現PLC-β1的細胞，都擁有較佳的存活率，而過度表現PLC-β1的細胞又稍高於正常細胞，因此由丙酮酸所誘發的PLC-β1活化路徑，可能對於細胞生存上有著正面意義。
- 學位論文
硫基亞硝基化是藉由一氧化氮專一鍵結於半胱胺酸硫基上的一種可逆性後轉譯修飾，其可調節人類疾病中之許多相關訊息傳遞。相較於其它後轉譯修飾，因硫基亞硝基化含量極低與其不穩定性，使得於蛋白體中亞硝基化位置的鑑定與含量變化的定量極為困難，且方法仍受限制。在此研究中，我們發展一以質譜技術為核心的亞硝基化蛋白體策略，可以鑑定細胞或組織中蛋白質被亞硝基化的修飾位點及其定量分析。 於論文第一部分，我們發展一不可逆烷化生物素標定策略結合質譜技術，可直接鑑定蛋白質上之硫基亞硝基化半胱胺酸位置。利用無內生性一氧化氮合成酶的COS-7細胞株，藉由不可逆烷化生物素標定策略，我們成功改善自由硫基包覆效率，以降低因雙硫鍵置換所造成的偽陽性訊號，及增加蛋白質酵素水解與亞硝基化胜肽的純化效率，提升以質譜技術對胜肽鑑定的專一性及靈敏度。 於論文第二部分，我們開發一資訊輔助免標定定量蛋白體技術結合不可逆烷化生物素標定策略，針對人類癌症組織中的蛋白質被硫基亞硝基化修飾的特定位點進行定量分析。於三次獨立的純化亞硝基化胜肽實驗結果得知，此策略針對CC-M1人類大腸直腸癌細胞株提供了準確性(4%錯誤率)與定量再現性(33%相對標準偏差)。於人類大腸直腸癌組織中，我們分析了11位不同期別的大腸直腸癌腫瘤與鄰近正常組織之個人化亞硝基化蛋白體，並構築了亞硝基化與蛋白體之間的網絡藍圖，利用資訊輔助胜肽比對策略，我們可於11位不同時期的大腸直腸癌病人組織中成功定量到94個亞硝基化蛋白(含199條胜肽與174個亞硝基化特定位置)，相較於腫瘤附近之正常組織，在6位以上的病人腫瘤組織中分別有20與80條亞硝基化胜肽具2倍與0.5倍程度變化，其中包含已知的thioredoxin (Cys73)與peroxiredoxin (Cys148)，以及潛在性新穎標定癌症蛋白Annexin A4 (Cys108)皆在6位以上的病人腫瘤組織中大量表現，並以西方墨點法進一步驗證之。這些潛在標的蛋白皆與癌症與發炎反應有關，且可能透過蛋白質間的交互作用而受誘導型一氧化氮合成酶或thioredoxin調控而被亞硝基化，透過硫基亞硝基化的定量分析和其所造成的生理病理現象之關聯，可幫助我們進一步了解大腸直腸癌之癌症發生，並找尋潛在性治療標的以提升臨床標的用藥的可能性。 於論文第三部分，我們進一步由生物資訊分析角度探討硫基亞硝基化之特性。利用Motif-X及SNOsite軟體比對一氧化氮刺激與癌症內生性亞硝基化胜肽，預測硫基亞硝基化在一級序列和二級結構上具高頻率分佈的結構偏好，結果顯示，硫基亞硝基化半胱胺酸可能位在酸鹼廣泛分佈之序列與α-螺旋上，且疏水性CxV/I/L motif則位在β-褶疊片段上。此外，於大腸直腸癌組織的分析結果中，有18個潛在內生性蛋白具有AxC motif，此結果與先前研究一致，推測其可能為thioredoxin經由trans-nitrosylation作用的標的蛋白。綜合以上結果得知，生物資訊分析可提供我們了解硫基亞硝基化由一級序列至二級結構上的分佈與特性，解開潛在性分子標的之特性。
- 學位論文
先天免疫反應的基因表達受到嚴密調控。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在先天免疫反應中扮演關鍵腳色，它透過磷酸化下游轉錄因子和RNA結合蛋白，可活化炎性細胞因子（proinflammatory cytokines）的合成。MAPK磷酸酶（MKP）藉由去磷酸化作用使MAPK失去活性。目前研究指出Mkp-1是一個重要的負調控因子，它可以關閉炎性細胞因子的生產。我們已經證明Tristetraprolin（Ttp）可以藉由與具有特殊的多腺嘌呤-尿嘧啶序列（AU-rich element, ARE）的Mkp-1 mRNA結合，並透過後轉錄機制將Mkp-1 mRNA降解。TTP家族包含三個主要成員，Ttp，Zfp36l1和Zfp36l2。本論文的目標即在了解其他TTP家族蛋白在先天免疫反應中扮演的角色。首先我們觀察TTP家族蛋白的mRNA與蛋白質表達。在受到脂多醣（Lipopolyssacharide, LPS）刺激的老鼠巨噬細胞RAW264.7中，TTP的mRNA和蛋白質被高度誘導，但Zfp36l1和Zfp36l2的mRNA表現降低，而蛋白質表現則保持一致。利用Zfp36l1和Zfp36l2的knockdown分析，我們發現兩個受到Zfp36l1和Zfp36l2調控的目標mRNA：Mkp-1和Cox-2。減少Zfp36l1和Zfp36l2的表現，可延長目標mRNA的半衰期，進而使目標mRNA增加。當細胞內Mkp-1的表達增加時，會抑制p38 MAPK的活性，使老鼠巨噬細胞對LPS刺激的敏感度下降。此外，我們還發現高度磷酸化的Zfp36l1會與支架蛋白14-3-3結合，並使Mkp-1 mRNA不被降解。綜合上述，我們的研究結果顯示Zfp36l1和Zfp36l2的表現與磷酸化修飾，可調控老鼠巨噬細胞RAW264.7受脂多醣刺激時，Mkp-1 mRNA的表現，這也說明Zfp36l1和Zfp36l2是先天免疫反應中重要的調控因子。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。