國立臺灣大學生化科學研究所學位論文/Institute of Biochemical Sciences
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標的鑑定為理解小分子化合物其生物活性作用之複雜機制所必須，然而現有技術受限於耗時以及特殊儀器已無法滿足與日俱增的需求。本研究發展一項融合疏水性交互作用層析法與親和性沖提之新技術：串聯式疏水性層析法之親和性沖提，提供鑑定小分子與蛋白質交互作用一系統性與效率性之策略。此技術之核心在於利用不同長度烷鏈構成疏水性層析管柱之基質，提供廣泛疏水性作用力與絕大多數蛋白質結合。樣本在進入串聯管柱之後，標的蛋白隨即選擇性地以一選定小分子沖提。作為首次方法學之驗證，我們針對小鼠腦部組織之三磷酸腺苷結合蛋白進行調查，並證實利用此技術能顯著提升三磷酸腺苷結合蛋白的鑑定率，其中約百分之十九為已知標的。本研究鑑定出RKIP為三磷酸腺苷結合蛋白，RKIP與三磷酸腺苷之結合導致減弱其與Raf-1激酶之親和力。更進一步在HEK293細胞中的研究發現，在短期能量耗竭的狀態下，RKIP與Raf-1的結合增強進而抑制下游ERK訊息傳遞路徑之活化。藉由此功能，RKIP對Raf-1激酶之抑制得以受到三磷酸腺苷濃度調節，這些資訊為細胞如何將能量狀態連結訊息傳遞提供新的線索。基於上述成果，我們展望串聯式疏水性層析法之親和性沖提於小分子標的鑑定之應用價值。
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淋巴細胞利用重組活化基因 (recombination activating gene, RAG1 and RAG2)產物，使V或D及J基因片段與重組訊息序列(recombination signal sequences, RSS)間產生斷裂，再由non-homologous end-joining修復作用使V或D及J基因片段結合，即所謂的V(D)J recombination。又accessibility理論假設RAG1及RAG2僅於細胞分化之特定時點可以結合特定基因片段之RSS，使V(D)J recombination過程具細胞發展階段專一性及重組位置專一性之特徵。然而特別是在wild type重組活化的染色質中，重組過程的分子調控機制則仍待實驗研究。本論文藉由探討native Jα 基因座(locus)，發現T細胞接受器(T cell receptor, TCR) α鏈的Vα與Jα基因重組過程，係受全面性與局部性之調控。全面性調控為在不同分化階段的胸腺細胞中，藉由組蛋白修飾(histone modification)，如histone H3及H4的acetylation (H3Ac、H4Ac)、H3K4的trimethylation (H3K4me3)及H3K9的dimethylation (H3K9me2)，影響Jα基因座結構的鬆散程度並調控RAG1及RAG2結合Jα基因座的能力及數量。另本論文研究發現，在in vivo的RAG1及RAG2結合Jα基因座時，並非僅限於RSS序列上，表示尚有其他因素調控此具RSS專一性的DNA裂解反應，即局部性之調控。研究結果顯示，在in vitro的CD實驗所偵測之DNA結構，與in vivo已知的Jα基因片段使用機率間，具高度關聯性，而且影響基因重組的DNA結構為RSS及Jα整體的DNA序列，而非僅有RSS或Jα的DNA序列所造成。 綜上，影響wild type Jα基因座進行V(D)J recombination的因素包括全面性的整體染色質的鬆散程度與可獲得性，及局部RSSJα的DNA結構可被RAG1結合並進行裂解反應的程度。本論文可作為後續探討DNA結構如何影響RAG結合專一性之方向，並可應用於研究臨床上常見的白血病或不正常的gene translocation現象所產生疾病的致病機轉。
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NF-κB控制著各方面的免疫反應，並調控著细胞的存活，增殖，和分化。由於其功能的多樣性，NF-κB的失調已經被發現與許多疾病有關連。我們先前的研究指出，TIFA蛋白質的的多聚化現象需要第九號蘇胺酸殘基的磷酸化， 進而活化NF-κB訊息調控路徑。此外，我們我們發現有與PI3K-Akt信號傳遞途徑相關的激酶參與磷酸化第九號蘇胺酸殘基。 在這項研究中，我們找到了上游能夠對TIFA蛋白質第九號蘇胺酸磷酸化的磷酸化激酶Aurora A， 在急性骨髓性白血病中，我們也證實前人所提出的Aurora A激酶活化NF-κB訊息傳遞路徑是由於TIFA蛋白質所調控的。 我們發現TIFA蛋白質表現量在急性骨髓性白血病中與Aurora A及NF-κB所調控的腫瘤存活因子的表現量有高度正相關性，且與病人的預後表現呈現負相關。我們進一步發現，抑制活體急性骨髓性白血病細胞中的TIFA表現量能夠擾亂白血病細胞激素的分泌，顯著地提昇化學治療的敏感度，並且提高人類急性骨髓性白血病細胞在裸鼠模式中的清除率。這些結果共同顯示，TIFA可以支持的AML的發展，並且標靶TIFA可以提高治療AML的效果。 我們也發現TIFA蛋白在肝癌細胞株與肝癌病人細胞中過度表達。而且越高的TIFA表現量，患者的無疾病存活期越短。這可能與TIFA調控上皮間質轉化的訊息傳遞作為肝癌腫瘤侵襲和轉移的分子機制有關。我們也發現了抑制TIFA可以特別地降低肝癌細胞株的細胞活性，提高化學治療毒性，並抑制其移動和侵襲的能力。這些結果顯示TIFA在未來將是一個嶄新的肝癌化學治療標把。 另一方面，在血管內皮細胞面臨促氧化和炎性刺激時，先天免疫反應主要主要是受到類鐸受體調控的NF-κB的訊息調控路徑所活化。我們發現ＴIFA在內皮細胞中是一個新穎的NLRP3炎性體啟動（訊息一）與活化（訊息二）的調控者。氧化和發炎的壓力例如剪切應力與氧化修飾的低密度脂蛋白皆會誘導並活化TIFA。 在訊息一中的炎性細胞激素和炎性體組成成分的轉錄活性中，TIFA的誘導被認為是必需的。 此外，Akt增加TIFA蛋白質第九號蘇胺酸的磷酸化並促使NLRP3炎性體組裝，可視為訊息二的炎性體活化。這些結果顯示TIFA透過訊息一以及訊息二來啟動與活化NLRP3炎性體，使其在內皮先天免疫反應扮演一個關鍵的調節者。 此研究所發現的機制提供了重要的轉譯意義，尤其是在哺乳動物細胞中的炎性反應。我們所得到的整體的結果不僅對腫瘤壞死因子到NF-κB的訊息傳遞有了詳細的解釋，並且在免疫疾病和癌症的治療中提供了潛在的治療靶標。
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特定離子細胞在狹鹽性硬骨魚類取代了哺乳類腎臟在滲透壓、水份以及酸鹼值等等的調節功能。透過表現在細胞膜上的特定離子通道可以將斑馬魚離子細胞區分為富鈉鉀幫浦細胞, 鈉氯離子運輸蛋白細胞, 富氫幫浦細胞, SLC26細胞 以及泌鉀細胞，在功能上分別負責：鈣離子運輸、氯離子/HCO3運輸, 氯離子運輸, 氫離子/鈉離子運輸, 以及鉀離子運輸。過去的研究中，已經對前四種離子細胞的功能有一定的了解，然而，泌鉀細胞對於鉀離子的調節模式還是未知的。近來學者指出，斑馬魚帶有一個與哺乳類Kir1.1(ROMK)同源的蛋白，Kcnj1a.1。其表現無論在原前腎或是皮膚細胞都跟鈉鉀幫浦次單元異構物 atp1a1a.4都具有共位現象。現在，斑馬魚除了kcnj1a.1之外還預測及比對出另外五個重覆複製的基因，命名為Kcnj1a.2到Kcnj1a.6。由於序列的相似，且具有高度保守的內向整流鉀離子功能domain，本研究的目的即在定義Kcnj1a亞家族成員在斑馬魚的表現以及調控鉀離子的功能。透過全體雙螢光雜合實驗發現，只有kcnj1a.1在腎細胞有表現，且與atp1a1a.4有共位現象。另外五個基因的表現則廣泛分布在卵黃囊、軀幹及少部分頭等區域的皮膚細胞，並且跟atp1a1a.4有部分共位現象。由於kcnj1a.2,3以及4的mRNA表現訊號較明顯，我們選殖出這三個基因的全長並且在HEK293細胞中過量表現，經由電生理實驗發現只有Kcnj1a.2在調控鉀離子具有非電壓依賴性，且其反轉電流最接近於鉀離子通道。在檢測斑馬魚體內鉀離子含量的實驗中發現，降低飼養斑馬魚水體環境中的鉀含量，會降低其體內鉀含量。然而提高水中鉀的濃度，相對於對照組而言，高鉀水飼養的斑馬魚體內鉀含量並沒有顯著差異。利用MO 技術來降低Kcnj1a在斑馬魚發育過程蛋白質表現，發現受精後三天的斑馬魚體內鉀含量如同低鉀水飼養的情況類似都會降低。因此，由上述結果證實Kcnj1a在斑馬魚胚胎發育階段扮演著調控鉀離子進出的角色。
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Nogo-b也就是大家所熟知的「漿膜蛋白-4b」，在血管受傷後的保護機制中扮演著相當重要的角色。在哺乳類中，Nogo-b會特別表現在肝臟的膽管和非實質細胞裡。肝臟的纖維化和肝內膽管癌(ICC屬於較罕見原發性的肝腫瘤，具有極高度的轉移能力)都會造成Nogo-b表現量的下降。血液中Nogo-b的含量，可以作為肝硬化的有效指標。同時，Nogo-b也能抑制肝臟星狀細胞(HSC)的活性。對於肝細胞，Nogo-b會促進肝細胞的增殖以及肝臟的再生。這些資料讓我們想知道Nogo-b/Nogo受體訊號途徑是否參與斑馬魚肝臟的生長。目前，Nogo-b在肝臟發育中其功能也還未被釐清。 在本篇研究當中，我們收集已培養24、48和72小時的斑馬魚胚胎，透過反義寡核苷酸(MO)抑制和原位雜交技術來分析Nogo-b/Nogo受體對於肝細胞形成和分化的重要性。藉由pHH3免疫染色的結果可以看到抑制Nogo-b的表現能夠阻礙肝細胞增殖。此外，收集注射過Nogo-b-MO的斑馬魚胚胎進行原位雜交分析與對照組比較，結果可以看到Foxa3、Prox1a和Lfabp的表現量有所下降。另一方面，Nogo-b在斑馬魚體內的訊號傳遞，和哺乳類相似，包括三個配位體和四個受體，透過實驗我們確定降低Nogo-b以及其受體的NgR和兩個輔助受體p75和TROY的表現也能夠使斑馬魚的肝臟縮小。因此，我們推測Nogo-B 、NgR、p75和TROY可能形成複合體去影響斑馬魚肝臟的發育。
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肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor, HGF)為細胞表面上的酪胺酸激酶受體MET之受質。HGF/MET 的訊息傳遞路徑調節了許多細胞生理過程，包括了胚胎發育及組織修復等。然而不正常的MET訊號活化透過促進癌細胞增生、增加癌細胞移動與侵犯的能力及產生癌細胞對藥物的抗性等，增進了癌症進程的惡化。因此以抑制MET訊息路徑為標的，是對於多種癌症的治療之良好方針。在我們實驗室先前的研究當中發現肝臟分泌的白血球趨化因子2 (Leukocyte cell-derived chemotoxin 2, LECT2) 能內生性和MET受體結合，降低MET訊息路徑活化並抑制肝癌的血管侵犯。因此我們以MET對LECT2結合的片段作為抗原，生產了新型的MET單株抗體#5-9，評估其對於MET專一性的結合及抑制MET訊息路徑活化之效益。我們評估MET抗體#5-9的結合型態，發現此抗體能在不與HGF競爭下和MET受體結合。接著我們評估MET抗體#5-9 抑制MET訊號活化的效果，無論在是否經由HGF所誘導的MET活化模式當中，MET 5-9抗體皆能抑制癌細胞增生、移動與侵犯的能力。此外MET 抗體#5-9 抑制腦癌細胞球體形成 (sphere formation)，可能與MET抗體降低癌細胞產生對藥物的抗性有關。接著進一步去探討MET抗體#5-9 抑制MET訊息路徑的分子機制，我們發現MET 抗體#5-9 能防止MET形成活化的二聚體(dimerization)、促進MET受體內吞作用(internalization)而降低表面MET的表現，進而在無論是否由HGF所誘導的模式中都能降低MET磷酸化及達到下游訊息的抑制。最後在癌症異種移植(xenograft)的動物模式中驗證了MET抗#5-9拮抗MET訊息傳遞及抑制腫瘤生長的效果。總結來說，新型的MET單株抗體 #5-9能以抑制癌症MET訊息路徑為標的，未來若能應用於臨床可能是對於多種癌症的治療之良好方針。
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研究DNA聚合酶之忠實性機制對於化學催化和生物意義上是個基礎且重要的議題。在2000年以前高忠實性複製型DNA聚合酶已被廣泛的研究，然而對於低忠實性修復型DNA聚合酶則較少被研究。本實驗室藉由X-射線結晶學解出12個DNA聚合酶 λ 蛋白質晶體結構並使用酵素動力學測量DNA聚合酶 λ 如何藉由本身結構特性調節忠實性之功能，亦藉由生物物理之測量方法發現DNA聚合酶 λ 具有無需DNA之存在下可以結合dNTP。本實驗室解出第一個apo-型DNA聚合酶 λ，發現apo-型DNA聚合酶 λ 之dNTP結合位已和催化型活化態之三級結構一樣，總和以上發現指出apo-型DNA聚合酶 λ 可以預先結合dNTP，這可以瞭解低忠實性修復型DNA聚合酶 λ 如何保持較低的忠實性。更進一步，DNA聚合酶 λ 之活化區具有一個疏水性核心，由四個胺基酸所組成(Leu431, Ile492, and the Tyr505/Phe506 motif)。本實驗室藉由突變型Leu431Ala發現Leu431扮演調節忠實性之功能。DNA聚合酶具有結合DNA和dNTP之能力，在過往中心教條上DNA聚合酶先結合上DNA，再結合dNTP，此優點可以藉由DNA序列上之鹼基配對來提高複製忠實性。倘若DNA序列上之鹼基受到氧化壓力(ROS)或是太陽光(UV)照射造成鹼基產生突變，會使得高忠實性複製型DNA聚合酶停在DNA複製叉上，若無法通過這些突變鹼基完成複製，進一步造成雙股螺旋DNA斷裂提升基因組不穩定。本論文證實低忠實性修復型DNA聚合酶 λ 具有預先結合dNTP之能力，提供了一條新的路徑，DNA聚合酶可以先結合dNTP越過突變之鹼基優先完成複製，使基因組穩定。
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癌細胞的轉移是導致人類死亡主要原因之一。當癌細胞開始轉移，他們會分泌基質金屬蛋白(MMPs)及促進皮質-間葉細胞型態轉變(EMT)。在EMT的過程中，會誘導轉錄因子的表現，像是Snail及Twist，而這些與癌細胞的轉移是有關連性的。我們先前的研究顯示攝取木犀草素(Luteolin)與槲皮素(Quercetin)可藉由逆轉皮質-間葉細胞型態轉[epithelial-mesenchymal transision (EMT)]來抑制高入侵能力的癌細胞的轉移。然而木犀草素與槲皮素如何調控癌細胞的轉移仍然是未知的。本研究主要探討癌細胞可經由UBE2S透過EMT來增強轉移能力，而這過程可經由木犀草素與槲皮素來進行抑制。 先前實驗室已取得高侵入性的子宮頸癌上皮皮膚癌細胞A431-III，此細胞能大量表現MMP-9及比母代有較佳轉移能。我們發現較高入侵能力的A431第三代細胞(A431-III)會比A431母代細胞(A431-P)明顯較高的UBE2S表現量。經由UBE2S siRNA阻斷UBE2S的表現，及大量表現UBE2S實驗中，顯示UBE2S能藉由EMT來增加細胞的入侵及移動能力。處理木犀草素與槲皮素後可以明顯抑制UBE2S的表現量。抑制A431-III的UBE2S表現及A431-P大量表現UBE2S的實驗中，也顯示了能負調控VHL的表現，而與Hif-1α的表現呈正相關。 UBE2S泛素載體蛋白是為E2泛素連接酶,可經由連結蛋白質後，進入蛋白酶體進行降解，近年來被報導與癌細胞的形成及進展有相關性。而在此篇研究中，我們發現在惡性腫瘤中大量表現UBE2S藉由誘導EMT的發生促進癌細胞的移動及入侵能力。同時，我們數據亦證實，UBE2S能促進IκB的降解及活化NF-κB的路徑，進而影響Snail的表現及促進EMT的發生。 木犀草素與槲皮素可以抑制這反應。在子宮頸癌細胞中顯示UBE2S與VHL及Hif-1α的表現有相關性。這些結果顯示UBE2S能幫助子宮頸癌細胞的活動能力，並可經由木犀草素與槲皮素來抑制子宮頸癌細胞的轉移。我們的實驗結果進一步證實UBE2S可作為腫瘤細胞轉移治療的標的。
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癌症轉移是指癌細胞從體內原來的地方擴散到另外一個部位，為主要造成癌症病人死亡的主因。找出抑制腫瘤轉移之分子並了解其分子機制，可以做為診斷的參考與治療的標靶。細胞介素-33 (Interleukin-33)為細胞介素-1家族的成員之一，透過與受體ST2L的結合調控下游訊號通路。IL-33在恆定的情況下表現於多種類型的細胞和組織，但在發炎反應的過程中其表現量會增加。有許多研究探討IL-33在免疫細胞與癌細胞中扮演重要的角色，但在癌症進展中的作用仍有爭議需進一步探討。在我們的研究中發現IL-33促進細胞的移動性、癌幹細胞特性、非貼附依存性生長和轉移能力。在癌細胞的機制探討發現，經由IL-33的增加人蝸牛同源物2 (Slug)表現量進而影響細胞上皮-間質轉化(EMT)而有形態學上的改變，同時也促進癌細胞的移行性和浸襲性。進一步探討IL-33如何調控Slug發現，IL-33透過與受體ST2L的結合，促進下游的ERK訊息傳遞，經由c-Jun/Fra-1的調控增加Slug的表現量。此外，過去研究證實缺氧的狀態下會促進癌細胞上皮-間質轉化，進而增加癌細胞浸襲性與腫瘤轉移。在我們的研究顯示當癌細胞面臨缺氧環境時，可能因增加了IL-33調控Slug路徑的活化，促進癌細胞的轉移。另外，我們也發現了IL-33是具有雙重作用的因子，會因其分佈的位置而有不同的作用。全長的IL-33主要在細胞核內降低癌細胞的細胞移行和浸襲能力，但當IL-33釋放到細胞外則促進腫瘤的發展。因此，細胞外的IL-33可做為未來治療癌症轉移之一有潛力的標靶與臨床診斷的評估指標。
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Xga是表現於紅血球上的血型抗原，此抗原是否表現會因個人不同，分成Xg (a+)及Xg (a-)；CD99是表現於細胞表面的抗原，而CD99及Xga兩種抗原的表現性具有性別上的差異性。過去的研究已知，CD99的表現量在紅血球上呈現高低的差異，且其在紅血球上表現量的高低跟Xga是否表現有著共同調控的關係。研究指出，當Xg(a+)表現型者時，CD99表現量高；Xg(a-)表現型者，CD99表現量低；但在男性的紅血球上會呈現第三種表現型；特定比例的Xg(a-)男性，CD99卻呈現高表現量。然而Xga及CD99抗原特殊表現型之分子遺傳機制尚未明瞭。 本研究室首先取不同個體之血液的gDNA進行研究，依據其Xga及CD99表現型將其分類成上述三種類型，接著取16人的gDNA以NGS進行性染色體大區域定序，範圍包含XG及CD99兩個基因，並排列出此區域之單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,簡稱 SNP)。經由分析結果發現，位於CD99及XG 兩個基因間的SNP rs311103 (G/C) 的基因型吻合三種表現型的分佈，可能對兩者間的調控有很大的關聯性。我們先利用了報導基因法確認了SNP rs311103區域，扮演著enhancer的角色。之後進一步使用程式預測可能與此SNP區域結合呈現親和力差異的轉錄因子，得到GATA family (GATA1~6)、LEF1等轉錄因子的預測。 我們利用K-562細胞可進一步被誘導分化為紅血球性狀做為模型，以及real-time PCR去分析這些轉錄因子在細胞中本身表現量的差異，發現GATA1於K-562細胞分化時表現量增加；接著利用報導基因分析法去做進一步的檢驗，經由分析我們推測GATA1最有可能扮演刺激此SNP的角色。從EMSA實驗中，我們觀察到 GATA1與SNP rs311103基因型為G時可能具有專一性結合。後續實驗我們想利用ChIP進一步證實兩者間的結合作用，並利用報導基因法觀察是否影響兩基因之啟動子以及3C (Chromosome conformation capture) 等實驗更進一步去證實GATA1在SNP rs311103異合子型的細胞株中，對於不同對偶基因型的XG及CD99基因間的表現是否有影響，來證實GATA1轉錄因子扮演差異性調控，因而造成Xga及CD99於紅血球上呈現表現差異之分子機制。