臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
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本研究利用鼷鼠淋巴癌細胞株 L5178Y (tk+/-) 法評估市售蛋黃油、自製蛋黃油及其經長時間加熱(260℃，48hr)所製的加工品與紅麴米丙酮萃出物之安全性。蛋油試驗品以絕對酒精溶解，紅麴米丙酮萃出物及其矽膠管柱區分物以 DMSO 溶解後，添加於含 5%馬血清之 RPMI1640 培養基 (內含 1 × 107 cells)，均勻混和後，經過三小時的處理，進行細胞毒性試驗。結果發現，當三種蛋油樣品濃度為 1 mg/mL 時，細胞的致死率皆為 100%；三種蛋油樣品中以黑燒卵油(PYO)對試驗細胞株之細胞毒性最為顯著，濃度為 0.625 mg/mL 時其細胞致死率約為 30%；在紅麴米丙酮萃出物中，矽膠管柱區分物之乙酸乙酯區分物在濃度為0.055 mg/mL，細胞致死率為 40%。在基因毒性的測試方面，先將細胞以樣品處理三小時，之後以不含樣品之培養基培養二天後，再以含有嘧啶類似物 TFT (5-trifluorothymidine) 2 μg/mL的培養基培養存活下來之細胞，培養十二天之後，以計算其處理過後所誘發的突變率。結果顯示，三種蛋黃油試驗樣品及紅麴米丙酮萃出物及區分物不論是否經 S9 處理，皆未顯示有明顯的基因毒性。
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纖維素、半纖維素、木質素是自然界中存量最多的大分子物質， 其中木質素由於結構複雜最難以分解。已知有三種酵素具有分解木質 素之功能分別為漆氧化酶（laccase, 1.10.3.2）、含錳過氧化酶(manganese peroxidase, 1.11.1.13)和木質素氧化酶( lignin peroxidase, 1.11.1.14)。 靈芝屬真菌屬於白腐型真菌，具有能夠分解木質素的能力。本文 將探討靈芝屬真菌中漆氧化酶基因之種類、特性與異源表現之結果。 以漆氧化酶基因之保守性序列設計引子，對十一株靈芝屬真菌進行聚 合酶鍊鎖反應，將產物定序，共得到26 條漆氧化酶部分基因序列，比 對顯示，靈芝屬真菌普遍具有兩條以上的漆氧化酶基因，將選殖之序 列與其他物種之漆氧化酶基因序列進行演化計算，發現靈芝屬真菌之 漆氧化酶可分為三種類型，其中第一類型與第二種類型下可分別再分 為兩群，序列比對與演化分析結果顯示，這三類基因有屬於自己的 intron，可能有獨立的演化來源，其中第三類的漆氧化酶基因可能在靈 芝屬與雲芝屬的分類形成前就已出現。 自靈芝屬真菌Ganoderma lucidum RZ、G. tsuage 1109、G. fornicatum 0814 中，分別選殖出漆氧化酶基因RZ.lac4 、0814.lac1 、1109.lac1，基 因全長依序為2121 bp、2019 bp、2110bp，皆具有9 個intron，其蛋白 質各由520、521、521 個胺基酸組成，其中前21 個胺基酸為signal peptide，在保守性Cysteine 之後第十個胺基酸為Phenylalanine，顯示 三者皆屬具有高還原電位之第三類漆氧化酶。 針對G. lucidum 之RZ.lac4 基因進行5’端Genome walking 所得上 游啟動子區域中含有真核生物常見的啟動子TATA、CAAT 序列之外， 還有MRE（ Mental-responsive element ）、STRE （ Stress-responsive promoter element）序列，顯示此基因之表現可能受到金屬離子之調控。 使用AOX1 起動子、pPICZ 載體，將所選殖之三條基因轉殖入嗜 甲醇酵母Pichia pastoris KM71 進行異源表現，所得之重組蛋白質皆具 有漆氧化酶活性，漆氧化酶轉型株reRZ.lac4、re0814.lac1、re1109.lac1 胞外上清液之最適反應pH 值為3.0，最適反應溫度分別為55、55-75、 65℃。以BMMHY 為誘導培養基，以30℃、0.5% 甲醇、250rpm 之條 件誘導七天，以ABTS 為活性測定基質，在最適反應條件之下測得轉 型株reRZ.lac4、re0814.lac1、re1109.lac1 之胞外上清液活性依序為 1.13U/ml、5.9U/ml、6.6U/ml，比活性依序為 32U/mg、90.2U/mg、 81.7U/mg。reRZ.lac4、re0814.lac1、re1109.lac1 之胞外上清液在30℃環 境下放置24 小時後，皆保有90%以上的活性，而re1109.lac1 在55℃ 環境下放置24 小時後，仍保有將近100%的活性，顯示具有良好之耐 熱性。而pH 穩定性實驗顯示re0814.lac1 之上清液置於不同pH 緩衝液 中，在室溫放置24 小時後，皆仍保有90%以上之活性，顯示其重組蛋 白可能具有良好的pH 穩定性。
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利用基因差異表現分析法 (DD-PCR) 比較生長中綠竹筍之各組織間基因表現情形。本實驗共獲得 46 個具差異性表現之 DNA 片段，經反向北方分析 (reverse northern analysis) 結果顯示，僅 12 個 DNA 片段具有表現之差異性。其中 AA23100b-2 基因片段經定序與 BLAST 比對分析，預測為 homeoboxes 基因。為選殖出 AA23100b-2 基因全長，進一步以 AA23100b-2 基因片段作為探針，篩選綠竹筍 cDNA 庫。選殖得到之 cDNA 與水稻 putative homeodomain leucine zipper protein 高度同源，並命名為 BoHDZip，其 DNA 序列總長度為1869 bp，但仍缺少基因之 5’端序列。推衍之胺基酸序列含有 homeobox 蛋白質之 START domain 保守性胺基酸。因此推測 BoHDZip 屬於植物 homeobox 蛋白質的 HD-GL2 家族。
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本實驗室利用壓制性扣除雜交法 (suppression subtractive hybridization) 自綠豆 (Vigna radiata) 抗豆象品系VC6089A選殖出和抗豆象性狀有關的植物防禦素 (plant defensin) cDNA，命名為VrCRP (Vigna radiata Cysteine Rich Protein) cDNA，經過大腸桿菌 (Escherichia coli) 系統及嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 系統表現的VrCRP，對豆象 (Callosobruchus chinensis) 及立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani) 具有抗性。經純化後得知天然VrCRP的成熟胜
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已知小腸細胞鐵還原酵素 ferric reductase 是影響鐵吸收率的重要因子。本實驗目的在於利用 Caco-2 細胞模式，探討 ferric reductase 反應的電子來源及影響其活性之成份，並評估這些成份對細胞攝鐵能力之影響。 Caco-2 細胞在滿盤後 13-18天進行攝鐵實驗，以 100 M FeCl3 提供鐵源，處理 6 小時之後，測量細胞 ferric reductase 酵素活性及鐵蛋白含量，作為攝鐵能力之指標。培養槽有單槽與雙槽兩種，使用雙槽培養皿時，細胞接種於內槽形成具有 tight junction 之單槽，鐵源均添加於上層，維生素 C 等實驗成份則依實驗設計而添加於上層或下層。 單槽實驗結果顯示，以不添加任何維生素 C 為控制組， 1 mM 還原型維生素 C (AA) 可使 ferric reductase 活性升高 12 倍，使細胞鐵蛋白含量升高 10 倍，其效應與劑量有正相關性。 1 mM 氧化型維生素 C (DeHA) 會使酵素活性升高 3-4 倍，並使鐵蛋白含量增高 5-6 倍。 AA 對酵素活性的影響約為 DeHA 的 4 倍，對鐵蛋白的影響則約為 1-2 倍。 以 DeHA 處理細胞時，若同時利用 BSO 降低 GSH 含量， 可使酵素活性及鐵蛋白含量分別降低 60% 及 50%；若利用 BCNU 降低細胞 GSH 含量，也可使酵素活性及鐵蛋白含量則分別降低 60% 及 40% ；可見 GSH 與鐵之吸收有關，小腸細胞會利用細胞內 GSH 還原氧化型維生素 C 而增加 ferric reductase 活性與促進鐵吸收。以 quercetin 或單寧酸處理細胞時，都會使 ferric reductase 活性上升，但鐵蛋白含量卻低於控制組，表示此兩種物質會藉由化學作用抑制鐵質進入細胞。 雙槽實驗結果顯示， AA 無論添加於上層或下層，均可使 ferric reductase 活性與鐵蛋白含量顯著高於未添加者； DeHA 添加於上層也可使酵素活性與鐵蛋白含量顯著高於未添加者，但添加於下層則無效應。添加於下層之 AA 無法拮抗 quercetin 或單寧酸對鐵吸收的抑制作用。針對 carbonyl Fe、FeCl3、Fe-NTA 三種鐵劑，下層未添加 AA 時，鐵蛋白含量為 Fe-NTA > FeCl3 > carbonyl Fe；添加 AA 時， carbonyl Fe 與 FeCl3 處理組之鐵蛋白含量顯著增加，以 FeCl3 顯著高於 carbonyl Fe ，但 Fe-NTA 與前述兩者並無顯著差異；顯示利用 Caco-2 細胞評估食物鐵可利用率時，細胞維生素 C 含量不足可能成為限制因素而有低估三價鐵之利用率的疑慮。
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光動力治療(Photodynamic therapy, PDT) 是一種使用特定波長 之激發光將光感物質(photosensitizer) 激發成高能量激發態，經由能 量或電子傳遞，將細胞周圍氧分子轉變成有細胞毒性的單態氧 (1O2)，或與環境分子作用產生自由基，造成細胞死亡的方法，目前已 應用於癌症治療及微生物防治(Photodynamic inactivation, PDI)。研究 顯示，將光動力治療應用在微生物防治上已有部分成效，而積極開發 新光源及光感物質，使光動力治療能更有效發揮，為目前研究的新趨 勢。藻藍素(phycocyanin, PC) 為螺旋藻(Spirulina platensis) 中的一 種水溶性螢光蛋白，可吸收光能並進行能量及電子傳遞，具有光動力 治療之潛力。本實驗由螺旋藻Spirulina platensis 中萃取藻藍素作為光 感物質，並以發光二極體(Light emitting diodes，LED) 為光源，對 革蘭氏陽性及陰性菌進行光動力抑制，並進一步探討菌體在懸浮狀態 與生物膜狀態下，光動力殺菌效果是否不同。實驗結果顯示由螺旋藻 中萃取並純化出藻藍素，回收率可達56.1%，純度(A620nm/280nm) 為 4.56，其品質與商品化之藻藍素相當。而以藻藍素進行光動力治療， 在藻藍素濃度100 µg ml-1，照光強度360 J cm-2 之條件下，可將濃度 107 CFU ml-1 之革蘭氏陽性菌S. aureus 及S. epidermis 懸浮細胞完全 抑制，但對革蘭氏陰性菌E. coli 及P. aeruginosa 之效果則不顯著； 而以藻藍素對S. aureus 及S. epidermis 生物膜進行光動力抑制，在藻 藍素濃度900 µg ml-1，照光強度360 J cm-2 之條件下。亦可將108 CFU cm-2 之生物膜菌體完全殺滅。此研究顯示由螺旋藻中萃取之天然光感 II 物質藻藍素對革蘭氏陽性菌之懸浮菌體及生物膜細胞皆有良好之光 動力抑制效果，在未來的應用上極具潛力。 關鍵詞：光動力抑制、螺旋藻、藻藍素、生物膜
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動物體內鐵的恆定受到小腸細胞的嚴密調控，小腸對鐵的吸收能力與體內鐵貯存量與造血組織需求量有關。Hepcidin（Hepc）為一循環胜肽，在肝臟中合成，受鐵貯存、發炎、貧血等因素調節其表現，動物研究中發現，Hepc的表現，與小腸鐵吸收分子的表現有協調關係，推測Hepc可經血液循環，作用於小腸，調控小腸鐵的吸收。Iron regulatory proteins（IRPs）與iron responsive element（IRE）系統是調節細胞鐵恆定的樞紐，隨著細胞鐵量的增加，IRPs的結合活性減少，DMT1、TfR表現減少，減少鐵的吸收與獲取。本實驗以人類大腸腺細胞瘤Caco-2細胞模式，探討Hepc對小腸細胞鐵調節蛋白活性之影響。實驗中以化學合成胺基酸個數為20與25之Hepcidin（Hepc20、Hepc25），經氧化處理形成分子內雙硫鍵，作為細胞處理之Hepc來源；另以市售之氧化態Hepc25處理細胞，觀察Hepc25對小腸細胞IRPs活性之影響，並與自行化學修飾之Hepc對照其效應。化學合成一級結構之Hepc，純化後經質譜分析鑑定分子量為2,199.9與2,797.2。於適當緩衝溶液中進行空氣氧化反應，使完成蛋白質折繞，經質譜鑑定可知氧化態的Hepc分子量為2,191.1（Hepc20）與2,787.9（Hepc25），相差8 Da，表形成4個分子內雙硫鍵。以此三級結構Hepc處理Caco-2細胞：以10 μM濃度Hepc20與Hepc25處理12與24小時，細胞IRP1活性沒有顯著變化；增加處理濃度至20 μM，細胞IRP1自發活性仍無顯著變化。市售氧化態Hepc25以10 μM濃度處理48小時，IRP1自發活性亦不受影響。本研究發現單獨以化學合成，經氧化處理之Hepc20與Hepc25不影響Caco-2細胞之IRP1自發活性。
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本研究之主要目的是評估台灣地區男女兩性成人與老人之鐵營養與貧血狀況，並篩選其重要影響因子。樣本取自兩個調查資料：（1）「82年-85年國民營養健康狀況變遷調查」﹙NAHSIT 1993-1996﹚之19-64歲成人，計有男性886人及女性1017人，共計1903人。（2）「台灣地區老人國民營養健康狀況調查」（NAHSIT 1999-2000）之65歲以上居家老人，完成問卷資料與鐵營養指標分析者，計有男性724人及女性703人，共計1427人。缺鐵評估採用多指標模式，以血紅素、運鐵蛋白飽和度及鐵蛋白濃度三項。預測模式與影響因子之篩選採用多元逐步迴歸分析及邏輯式迴歸分析。 結果可見，缺鐵率方面：男性輕度缺鐵率為0.1 %、19-50歲女性8.6 %、51-64歲女性6.2 %，男性老人2.3 %、女性老人1.4 %。男性缺鐵貧血率為0.1 %、19-50歲女性6.8 %、51-64歲女性1.3 %，男性老人2.5 %、女性老人2.0 %。男性總缺鐵率為0.2 %、19-50歲女性15.4 %、51-64歲女性7.5 %，男性老人4.8 %、女性老人3.4 %。貧血率方面：男性為6.6 %、19-50歲女性25.2 %、51-64歲女性16.0 %，男性老人19.5 %、女性老人18.8 %。女性是缺鐵、也是貧血的主要危險群，尤其是停經前女性。 鐵營養方面，多元逐步迴歸分析結果，血清鐵蛋白濃度的迴歸公式分別為： 19-50歲女性：血清鐵蛋白濃度對數值＝3.62－0.83×(是否有月經)－0.11×(月經天數)＋0.52×(是否規律使用補充劑)－0.001×(飲食維生素C量)＋0.02×(年齡)＋26.97×(飲食鐵密度)＋0.06×(血液維生素狀況)－0.16×(生產次數)＋0.03×(BMI; Body Mass Index)；51-64歲女性：血清鐵蛋白濃度對數值＝2.69＋0.03×(年齡)－1.21×(是否有月經)＋0.001×(飲食維生素C量)＋0.09×(血液維生素狀況)＋0.06×(BMI)；男性：血清鐵蛋白濃度對數值＝4.55＋0.07×(血液維生素狀況)＋0.001×(酒精攝取量)＋0.01×(海鮮與肉類攝取頻率)；女性老人：血清鐵蛋白濃度對數值＝1.59＋0.01×(年齡)－0.01×(血液葉酸濃度）＋0.10×(營養資訊）＋0.41×(血液肌酸酐濃度)＋0.34×(白蛋白濃度)＋0.01×(肌酸酐排除速率)；男性老人：血清鐵蛋白濃度對數值＝4.15－0.01×(年齡)＋2.33×(腰臀比)＋0.91×(ETKAC; Erythrocyte transketolase activity coefficient)－1.44×(EGRAC; Erythrocyte glutathione reductase activity coefficient)－0.02×(血液葉酸值)－0.04×(飲食血基質鐵量)－0.03×(飲食粗纖維量)＋0.001×(飲食維生素C量)。升高缺鐵風險的因素分別是：19-50歲女性有月經者、教育程度高、年齡大；51-64歲女性為BMI<18.5；男性老人為飲食鐵密度高。降低缺鐵風險的因素分別是：19-50歲女性為BMI大、水果攝取頻率高、酒精攝取≧3 g；51-64歲女性為月經週期天數長；男性老人為BMI大。 貧血方面，多元逐步迴歸分析結果，血紅素濃度的迴歸公式分別為：19-50歲女性：血紅素濃度＝10.83＋0.43×(鐵蛋白濃度)＋0.03×(水果攝取頻率)；51-64歲女性：血紅素濃度＝11.92＋0.46×(鐵蛋白濃度)－0.29×(血液維生素狀況)；女性老人：血紅素濃度＝10.61－0.04×(年齡)＋0.10×(BMI)＋0.96×(白蛋白濃度)－0.80×(血液肌酸酐濃度)＋0.23×(血清鐵蛋白濃度)－0.04×(飲食血基質鐵)；男性老人：血紅素濃度＝9.26－1.26×(血液肌酸酐濃度)＋0.88×(白蛋白濃度)＋0.06×(BMI)＋0.03×(飲食肉類攝取)－0.01×(生肉/煙燻肉/茶/咖啡攝取頻率)－0.01×(飲食指南分數)＋0.77×(ETKAC)－0.01×(年齡)。升高貧血風險的因素分別有：19-50歲女性為缺鐵；51-64歲女性為缺鐵與血液維生素狀況佳；女性老人為缺鐵與血液肌酸酐濃度高；男性老人為缺鐵。降低貧血風險的因素分別有：19-50歲女性為水果攝取頻率高；51-64歲女性為抽煙者；女性老人為BMI高與血液白蛋白濃度高；男性老人為BMI高與肌酸酐排除數率高。 本研究結果顯示，男女兩性成人與老人的鐵營養狀況都會受飲食因素的影響；此外，停經前女性還受個人生理特性的影響。老人則受個人生理特性與慢性疾病的影響。男女兩性成人與老人貧血的主要影響因素是缺鐵以及飲食與營養因素，老人的貧血還受個人生理特性與慢性疾病的影響。因此，改善個人微量營養素之充足程度有助於降低國人的缺鐵與貧血問題，此外若能針對性別與年齡特質提供進一步的保健防治措施，例如停經前婦女的個人生理問題的調理，老人慢性疾病的良好控制等，成效將可更為顯著。
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中文摘要 蔗糖磷酯合成酶 (sucrose phosphate synthase) 是蔗糖生合成中一個極為重要的調控酵素，本論文以甘藷塊根蔗糖磷酯合成酶之 cDNA 作為材料，於酵母菌 (Pichia pastoris) 中進行重組表現。所得表現之蔗糖磷酯合成酶，單體分子量為 50 kD，此結果和實際甘藷塊根中，蔗糖磷酯合成酶單體之分子量 (120 kD)，相差一倍，反而與甘藷葉片純化出之蔗糖磷酯合成酶者相近。 而在生化性質分析中，對於異位調控因子影響方面，表現之重組蔗糖磷酯合成酶性質，與甘藷塊根蔗糖磷酯合成酶並不相同，而卻與甘藷葉片之蔗糖磷酯合成酶相似：葡萄糖 6-磷酯 (G 6-P)能活化此蔗糖磷酯合成酶，而無機磷酸鹽 (Pi)則抑制之。最適反應 pH 值實驗中，發現本論文表現之重組蔗糖磷酯合成酶最適 pH 值為 7，其與其他組織內以及真核原核系統表現之蔗糖磷酯合成酶相同，都屬於中性的酵素，並且在酸性與鹼性環境中，呈現不穩定之現象。至於金屬離子對本論文表現之重組蔗糖磷酯合成酶之影響，Ca2+、Co2+ 及 K+ 離子能活化它，而 Na+ 離子則會抑制其活性。此結果類似於甘藷葉片中的蔗糖磷酯合成酶，而非甘藷塊根中之蔗糖磷酯合成酶。因此推論甘藷蔗糖磷酯合成酶，在甘藷中可能沒有其他同功異構酶，而其在各器官或組織中，會產生結構與調控方式之差異，極可能是轉譯後修飾作用後所造成之結果。