臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
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Epstein-Barr virus (EBV)是人類皰疹病毒，具有潛伏期和溶裂期兩種生活型態。EBV的感染途徑是透過唾液感染上皮細胞和淋巴B細胞，與傳染性單核血球增多症、伯基特淋巴瘤、T細胞淋巴癌、何杰金氏症、胃癌及鼻咽癌等疾病有密切關係。BRLF1和BZLF1是EBV的極早期基因，會轉譯Rta和Zta這兩個轉錄因子進而活化EBV溶裂期的基因表現。目前的抗EBV藥物如acyclovir、ganciclovir及indolocarbazole等主要作用於病毒的DNA聚合酶以抑制病毒的溶裂複製。然而病毒常常會突變而產生抗藥性的突變株，因此需要更新穎的藥物及治療方法。Triterpenoids (三萜類)是由三十個碳元素為骨架之天然化合物，普遍存在於植物或真菌中，具有抗發炎、抗腫瘤、抑制細胞增生及誘導細胞凋亡機制的調節作用。本篇研究的目的是探討triterpenoids的衍生物JYK-MA-37對抑制EBV溶裂期的效果。首先將P3HR1細胞以不同濃度的JYK-MA-37處理，接著並以sodium butyrate (SB)及12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)誘導EBV進入溶裂循環，利用西方點墨法與流式細胞分析，結果顯示10 μM的JYK-MA-37有效地抑制EBV的溶裂期蛋白質Rta、Zta及EA-D的表現，其EC50-Rta為11.32 μM，CC50為55 μM。接著，以冷光酵素活性分析測試JYK-MA-37對活化BRLF1與BZLF1啟動子Rp及Zp的影響，結果發現EBV溶裂期極早期基因BRLF1及BZLF1的轉錄活性會被抑制。利用即時聚合酶連鎖分析JYK-MA-37對EBV顆粒產生的影響，結果發現JYK-MA-37會抑制EBV顆粒的產生。綜合以上實驗結果，證明JYK-MA-37具有抑制EBV溶裂循環的能力。
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塔塔加高山生態系是台灣長期生態研究網 (Taiwan Ecological Research Network，TERN)研究站之一，本研究以雲杉、鐵杉及草原區這三處不同營養區，依土壤深度進行不同季節的塔塔加森林土壤微生物多樣性分析。其中微生物生質碳、生質氮、微生物族群、水分含量、總有機碳和總氮隨土壤深度增加而下降。雲杉區微生物生質碳和生質氮分別介於394-1323 µg/g 及 71-233 µg/g，在鐵杉區則分別介於430-1340 µg/g 和 56-261 µg/g，草原區則分別介於141-870 µg/g 和 46-161 µg/g，其中以草原區為最低。微生物生質碳和生質氮在春季較高，於冬季時最低。草原區因土壤中有機物質含量低，故微生物族群量最低，微生物族群中以細菌族群量最高。細菌多樣性分析先以16S rDNA進行聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)，再以變性梯度膠凝電泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)分析增幅子(amplicons)，得知三採樣區主要電泳片段非常相似，僅在次要片段有差異，且由PCR-DGGE分析亦顯示土壤剖面不同層間的差異，顯示在不同深度土壤分層均有特定微生物，得知微生物族群的數量與多樣性受地形影響。本研究生物技術所使用之可培養細菌，是以功能性篩出並以16S rDNA鑑定分析，這些分離株具有有機物、纖維素及有芳香環(酚)分解能力與溶磷功能。分離菌株以纖維分解菌最多、其次為溶磷及酚降解菌。產纖維酵素分離菌包括Chryseobacterium、Janthinobacterium、Flexibacter及Pedobacter等屬；溶磷菌包含Burkholderia、Enterobacter、Pseudomonas及Serratia等屬，而分離菌株中Acinetobacter、Bacillus及Staphylococcus等屬具有高效的酚降解能力。 研究更進一步以塔塔加分離株進行微生物產氫研究，利用加熱前處理技術分離出的塔塔加功能性產氫微生物族群，進行不同基質濃度產氫評估。由PCR-DGGE分析及氫氣產量得知，當增加前處理溫度時，產氫的微生物種類亦隨之改變，在15-20g葡萄糖基質下，最大產氫速率、氫累積量及產氫量分別為1390-1576 ml/l/day、2966-3146 ml H2/l及1.83-1.93 mol H2/mol glucose。本研究顯示加熱前處理法如同以特殊溫度篩選功能性菌株般，可有效從土壤分離產氫菌Clostridium。本研究探討加熱前處理法處理之森林土壤，在以纖維素合成培養基增菌後纖維素基質產氫能力，且完成以分批醱酵觀察不同濃度纖維素基質產氫效果。
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糖尿病為全球和臺灣盛行的重大慢性疾病之一，以第二型糖尿病佔最多數。糖尿病成因多元複雜，基因、環境及其交互作用皆參與其中。因此，若從個體與生俱來所帶有的基因多型性著眼，篩選人群中帶有罹患高血糖易感受基因的個體，期望未來將可有效減緩糖尿病發生率。有鑑於以糖化血色素當作糖尿病患者篩檢工具的敏感度和特異度與禁食血糖相似，且糖化血色素檢測值不易受短期或檢測當天生活習慣的突然改變而波動。從遺傳學的角度而言，糖化血色素遺傳度高達75%，且鮮少有漢人族群的糖化血色素計量性狀基因座相關性研究。促使本研究以糖化血色素為主要研究表型、禁食血糖為輔，利用臺灣漢人細胞與基因資料庫和弗明罕心臟研究，從單核苷酸和候選基因兩個層面描繪與糖化血色素相關的遺傳訊息。 本研究採用兩部分且各兩階段的相關性研究設計搜尋糖化血色素之計量性狀基因座。首先，於臺灣漢人資料庫中隨機抽取全基因體相關性研究兩階段的參與者（Nstage1=970; Nstage2=954），確認糖化血色素及單核苷酸基因多型性間的相關性。其次，以臺灣漢人資料庫為主（Nstage1=970），弗明罕心臟研究為輔（NFramingham=1,093），以兩階段候選基因之單核苷酸結合分析相關性研究預測禁食血糖和糖化血色素計量性狀之情形。所有的相關性分析皆校正年齡、性別及身體質量指數。 全基因體相關性研究第一階段中有16個標籤單核苷酸被認為與糖化血色素間有相關性，分別座落/鄰近ALDH1A1、FTO、KCNA4、KCNJ3及TBC1D4；但在第二階段無法重現其顯著性。以座落FTO基因上之rs7200972、rs1125338及rs1345390進行單倍體組合型分析，保護因子組合型（A-T-A/A-T-A）與參考組組合型（G-C-G/G-C-G）之個體相比，可能有顯著較低的「糖化血色素值偏高」之勝算比（全基因體相關性研究第一階段ORA-T-A/A-T-A = 0.57, 95%CI = 0.38-0.84, p-value = 0.005；全基因體相關性研究第二階段ORA-T-A/A-T-A = 0.86, 95%CI = 0.58-1.26, p-value = 0.433；所有全基因體相關性研究參與者ORA-T-A/A-T-A = 0.71, 95%CI = 0.53-0.93, p-value = 0.013）。兩階段候選基因之單核苷酸結合分析相關性研究中，與禁食血糖相關的候選基因ADCY5是唯一在不同族群中，在隱性遺傳模式下，分別和台灣漢人的糖化血色素有顯著的相關性（pRecessive = 5.24×10-4），和弗明罕心臟研究參與者的禁食血糖有接近統計顯著標準之相關性（pRecessive = 1.78×10-3）。 全基因體相關性研究結果無法在第二階段中再次驗證可能是受限於資料庫樣本數不足及糖化血色素數值不易呈常態分佈所致，需要藉由不同的研究設計和更大的樣本族群做進一步的分析和確認。兩階段候選基因之單核苷酸結合分析相關性研究中，台灣漢人與弗明罕心臟研究參與者的分析結果近乎沒有重複性，說明兩族群間存在基因異質性。所篩選出與糖化血色素有相關性的候選基因是否為台灣漢人族群所特有，或者，與禁食血糖有相關性的候選基因是否為弗明罕心臟研究參與者所特有，皆需藉由更多獨立研究結果加以驗證。
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RNA 靜默作用對於植物的生長與發育都有重大的影響。RNA 靜默作用主要是由不同的小片段 RNA 與 ARGONAUTE (AGO) 家族蛋白質形成複合體來進行。阿拉伯芥中 AGO 蛋白質共有 10 種，AGO 複合體與不同的輔助蛋白質進行交互作用來產生不同的功能，包括對目標 mRNA 的降解、抑制轉譯作用、增加 DNA 和組蛋白質甲基化，以及對抗病蟲害等。本論文利用建立過量表現轉殖株、酵母菌雙雜合法和免疫共沉澱法等方式，尋找與 AGO1 或 AGO4 可能具有交互作用的蛋白質。由於載體上的設計錯誤，造成 frame-shift，本實驗得到兩種基因表現低下的突變株 ago1 與 ago4。藉由酵母菌雙雜合法，篩選到兩個與 AGO1 產生交互作用的 CHR 蛋白質，它們屬與需要 ATP 共同作用的染色質重組酵素。另外，以大腸桿菌表現 GST-AGO1 與 GST-AGO4 重組蛋白質作為釣餌，與阿拉伯芥葉片抽出的蛋白質粗抽液，進行免疫共沉澱測試，發現了數個候選蛋白質，進一步以 LC-MS/MS 進行分析，它們是分別是 clathrin binding protein (epsin)、F-box/FBD/LRR-repeat protein、short-chain dehydragenase/reductase、Ferredoxin-dependent glutamate synthase 1、Glutamine synthetase、ATP synthase subunit alpha和 Elongation factor 1-alpha。未來需進一步的分析，才能證實 AGO 與這些候選蛋白質間的交互作用。
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苯丙胺酸脫氨裂解酶 (Phenylalanine ammonia lyase; EC 4.3.1.5 簡稱 PAL) 為類苯丙酸生合成路徑中的第一個酵素。在植物體中，PAL常由多基因家族組成。其催化苯丙胺酸 (L-phenylalanine) 進行生物轉化反應，產生肉桂酸 (trans-cinnamic acid) 與氨 (ammonia)。在單子葉植物中，PAL可能具有催化酪胺酸脫氨裂解的能力。 BoPAL1 與 BoPAL2 的胺基酸序列相似度高達 96％，但兩者對於基質的專一性卻有不相同。將兩者於活性區中不同之胺基酸進行點突變互換，藉以觀察哪些胺基酸可能會對 PAL 基質專一性造成影響。經大腸桿菌表現系統之表現蛋白質 BoPAL1 F133H 與 BoPAL2 I198V、F134H、A149P、G389N，其對phenylalanine基質的親和力較原態差。對 tyrosine基質而言，表現蛋白質 BoPAL1 F133H 與 BoPAL2 A149P、 G389N 較原態有較高的酵素比活性。 BoPAL4 為綠竹 PAL 基因家族的一員。將表現載體 pTrcHisA/BoPAL4 轉形至大腸桿菌 Top10 中進行大量表現，所得到之表現蛋白 BoPAL4 於 N 端帶有 (His)6-tag，因此可透過鎳離子管柱層析進行純化。以膠體過濾層析法測得表現蛋白質 BoPAL4 原態分子量約為 290 kD，另外以 SDS-PAGE 測得表現蛋白質 BoPAL4 單元體分子量約為 70 kD，由上述結果推測表現蛋白質 BoPAL4 為同質四元體形式。表現蛋白質 BoPAL4 最適反應溫度為 50℃，最適反應 pH 為 9.0，且其活化能為 24.7 kcal/mol。表現蛋白質 BoPAL4 對 Phe 基質之 Km 值為 2072 μM 而 kcat/Km 值為 7.87。表現蛋白質 BoPAL4 對 tyrosine 基質之 Km 值為97 μM 而 kcat/Km 值為 5.56。與 BoPAL2 比較的結果，表現蛋白質 BoPAL4 對tyrosine基質具有較高的酵素活性。
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紅麴發酵產物廣泛應用於亞洲，提供數種生理功效。本研究探究紅麴山藥酒精萃取物之化學防護效應對口腔癌預防與治療效果，以人類口腔癌細胞株為細胞模式，探討紅麴山藥酒精萃取物誘導癌細胞凋亡之效果及其分子機制；並透過倉鼠口腔頰囊癌變為動物模式，評估紅麴山藥酒精萃取物於口腔癌預防及治療之成效，並分析其作用機制。在細胞模式中，評估紅麴山藥酒精萃取物對於人類口腔癌細胞之細胞增殖、細胞週期及細胞凋亡之影響，並分析其分子機制。實驗結果顯示，紅麴山藥酒精萃取物對於口腔癌細胞較紅麴米酒精萃取物具有更強之細胞毒性，而紅麴山藥酒精萃取物對 SCC-25 細胞株具有最佳之毒殺能力 (IC50: 78.1 μg/mL)。在細胞週期分析中，紅麴山藥酒精萃取物促使 SCC-25 細胞停滯在 G2/M 期，此乃透過抑制 NF-κB 蛋白進而調控 G2/M 期的 Cyclin B1 及 CDK1 蛋白表現量下降，因而造成細胞週期停滯，此現象顯示紅麴山藥酒精萃取物對口腔癌細胞具有抑制活性。經由 Annexin V-FITC 雙染試驗發現，紅麴山藥酒精萃取物能促使口腔癌細胞凋亡，乃更進一步探討其作用機制。結果顯示，紅麴山藥酒精萃取物顯著地透過粒線體路徑來提升促凋亡蛋白 Bax 之表現量，因而活化了 caspase-9 酵素並進而活化 caspase-3 活性。此外，紅麴山藥酒精萃取物亦能增加 caspase-8 之活性，顯示死亡受體路徑亦參與紅麴山藥酒精萃取物所調控之口腔癌細胞進行細胞凋亡。在治療組動物模式中，研究目的乃在探討紅麴山藥酒精萃取物對於二甲基苯蔥 (7,12-dimethyl-1,2-benz[a]anthracene, DMBA) 誘導之倉鼠頰囊癌化之治療效果。以 0.5% DMBA，每週 3 次、連續 14 週塗抹黃金敘利亞倉鼠之頰囊，以誘導口腔鱗狀細胞瘤 (oral squamous cell carcinoma, OSCC) 生成。於第 9 週時以相同頻率加入塗抹抗發炎藥物 celecoxib 及 50、100、200 mg/kg 紅麴山藥酒精萃取物及 200 mg/kg 山藥酒精萃取物，並於 14 週後犧牲動物。結果顯示，DMBA 造成 nitric oxide (NO)、reactive oxygen species (ROS)、prostaglandin E2 (PGE2)、transforming growth factor-β (TGF-β) 之過度表現，而紅麴山藥酒精萃取物則減緩了這些因子的增加。此外，紅麴山藥提升血清中 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 及interleukin-1β (IL-1β) 之含量，因而刺激了 caspase-8 及 caspase-3 之活性，顯示紅麴山藥酒精萃取物延緩 DMBA 所造成之氧化傷害並誘導口腔癌細胞凋亡，因而達到對 OSCC 之治療成效。以預防組動物模式探討紅麴山藥酒精萃取物於 DMBA 誘導之倉鼠頰囊癌化之預防作用，並評估其抗發炎及抗氧化能力。將 DMBA 每週 3 次，連續 14 週塗抹於倉鼠頰囊袋，並於每次塗抹 DMBA 的隔天進行抗發炎藥物 celecoxib 及 50、100、200 mg/kg 紅麴山藥酒精萃取物及 200 mg/kg 山藥酒精萃取物之塗抹，14 週後犧牲動物。結果證實，紅麴山藥酒精萃取物藉由提升抗氧化酵素之活性，抑制 ROS、NO、PGE2 以及促發炎細胞激素因 DMBA 誘導而造成之過度表現，進而延緩腫瘤形成，顯示紅麴山藥酒精萃取物展現良好之抗發炎及抗氧化活性而達預防口腔癌之效果。綜合以上結果得知，紅麴山藥代謝產物之化學防護功效在抵抗 OSCC 上具有相當良好之抑制能力，具潛力開發為預防口腔癌之功能性食品或於口腔癌之治療上作為輔助治療劑。
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在快速生長的竹筍中，細胞壁多醣類的生合成相當旺盛。本論文藉由篩選cDNA庫及RT-PCR，共選殖出10株纖維素合成酶 (cellulose synthase, CesA) 之cDNA (BoCesA1~BoCesA10)，其中7株具有完整的譯讀序列 (open reading frame)，分別可轉譯出1061∼1080個胺基酸（分子量介於 120.77∼122.24 kDa）。 BoCesA1-BoCesA8這8株cDNA彼此在核苷酸序列及胺基酸序列分別有62%-97% 及 67-98% 的同質性，且其胺基酸序列上皆具有植物CesA 序列的特徵，包括：zinc-binding domain、植物CesA所特有的高度變異區域 (HVRI 及HVRII)、八個預測的貫膜部位，及具有高度保守性的UDP-glucose 鍵結部位 (D及DxD motif) 及催化部位 (D 及QxxRW motif) 之可溶性部位。以演化樹分析發現，BoCesA1-BoCesA8 分別屬於三群 (clades)，其中BoCesA1, BoCesA2, BoCesA3及BoCesA8屬於VI-A次群，BoCesA4, BoCesA5屬於V-A次群，而BoCesA6及BoCesA7則屬於I-A次群。 由Southern分析的結果推測BoCesA2、BoCesA5、BoCesA6、BoCesA7在綠竹的染色體中有2-3個拷貝。以quantitative real-time PCR分析此4種BoCesA基因在不同綠竹組織及於試管中培育的綠竹多芽體中之基因表現圖譜，顯示此4種BoCesA基因普遍在綠竹各組織器官中表現，但受到差異性調控。另外，BoCesA基因的表現會受到α-naphthaleneacetic acid的負調控與thidiazuron差異性的影響。由in-situ RT-PCR分析結果顯示出BoCesA2、BoCesA5、BoCesA6及BoCesA7在未出土的竹筍基部及節間是普遍存在，而在綠竹側枝的節間中則是主要表現在維管束中央部位，其中BoCesA2及BoCesA6 mRNA的分佈具空間特異性。藉由TAIL-PCR選殖得BoCesA2 及BoCesA5之5’端序列，以CpGisland2 及CpGplot 程式分析，可在其上搜尋得可能的 core promoter element (CpG island)。此外，在BoCesA2 之轉譯起始點上游序列中，也存在一些類似於參與荷爾蒙調節、維管束專一性表現及光反應有關的cis elements。 另以GST pull-down、yeast two-hybrid 及免疫共沈澱等實驗探討BoCesA是否會與催化UDP-glucose 生成的酵素間具有交互作用。結果顯示， BoCesA7與蔗糖合成酶 (sucrose synthase, SuS) 間具交互作用，但BoCesA7 與UDP-glucose焦磷解酶 (UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase) 間則否。此外，也發現在積貯組織中SuS 與UGPase具交互作用。目前正以雙螢光互補分析法 (biomolecular fluorescence complementation assay) 進一步驗證BoCesA7、BoSuS及BoUGPase 蛋白質間的交互作用。
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第二型糖尿病發生前乃會經過糖尿病前期，判定標準為禁食血糖與葡萄糖耐受性異常，因此如何於糖尿病前期有效地控制血糖，便成為避免發展成第二型糖尿病的重點之一。早期苦瓜為學界所知之降血糖成份，乃是透過皮下或是腹腔注射投予以達到功效之植物胰島素，然而亦有許多文獻指出，以口服的方式給予苦瓜可降低血糖。本實驗室過去研究顯示：口服山苦瓜之降血糖活性存在於水萃物、且會受熱破壞；攝取山苦瓜補充飲食之動物有較高之 insulinogenic index、以及肝臟 dpp4 (dipeptidyl peptidase 4) 基因表現較低之特徵。因此，本實驗假說為：苦瓜降血糖機制之一乃是透過「腸泌素效應」－ incretin effect。 細胞實驗中，建立腸道內分泌細胞株 STC-1 之 GLP-1 (glucagon-like peptide-1) 分泌量分析作為初步篩選苦瓜降血糖物質之平台，結果發現：山苦瓜水萃物刺激 GLP-1 分泌之倍數最高；有趣的是，苦瓜苦味粗萃物亦具有活化 GLP-1 分泌之潛力。進一步評估苦瓜於動物體透過 incretin effect 降低血糖之可能，選用以 30% 高奶油飲食誘發高血糖症狀之 C57BL/6J 公鼠，結果發現：單一劑量急性投予水萃物中、3 kD 以下小分子區分物可降低血糖，並且伴隨血液胰島素與 GLP-1 濃度增加；此功效受到 GLP-1 受器之拮抗物 Exendin-9 的抑制、但卻不影響血液 DPP4 活性。推測此萃物並非透過抑制 GLP-1 之降解、而是刺激腸道內分泌 L 細胞分泌 GLP-1，進而活化胰臟 beta 細胞分泌胰島素，與細胞實驗之結果吻合。此外，刺激 GLP-1 分泌活性成份中，可能有一些是苦瓜中的苦味化合物，活化了 L 細胞上的苦味受器以刺激 GLP-1 分泌。 本研究首次發現：苦瓜水萃物中 3 kD 以下小分子區分物，透過刺激 GLP-1 分泌、而活化胰臟 beta 細胞分泌胰島素之腸泌素效應，以達到降低血糖之功效。
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放射線治療為有效控制腫瘤的癌症治療方式。放射線雖然能抑制癌細胞增生和毒殺癌細胞，但也會因發炎與纖維化反應而對正常組織造成傷害。因此，如何減少放射線治療衍生的副作用為一重要課題。紅麴 (Monascus) 為中國傳統發酵真菌，運用在食品上已有數千年的歷史，其二次代謝產物經現代科學研究證實具有降低膽固醇、抗發炎、抗腫瘤與抑制腫瘤轉移等功效，適合輔助放射線治療減輕副作用。本研究分為體內動物實驗和體外細胞實驗兩部分，探討紅麴山藥酒萃物 (ethanol extract of red mold dioscorea, RMDE) 是否具有緩解放射線治療衍生的副作用之功效。實驗結果顯示，RMDE 的餵食，能增加放射線治療後小鼠的體重和攝食量，並且抑制腫瘤的復發。此外，RMDE 能緩解放射線所引起脾臟腫大之情形，血清促發炎激素 (tumor necrosis factor-α, TNF-α; interleukin-1β, IL-1β; interleukin-6, IL-6)、促纖維化激素 (transforming growth factor-β1, TGF-β1) 和血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 也因 RMDE 的餵食，具有顯著性降低的現象。由組織病理切片結果得知，RMDE 對於小鼠肺、肝和腎臟並無任何的影響。在細胞實驗方面，RMDE 中的 ankaflavin 和 citrinin 對於小鼠皮膚初代細胞和 B16-F0 並不具明顯抑制效果，而 monascin 對於小鼠皮膚初代細胞不具明顯抑制，但可以有效抑制癌細胞 (B16-F0) 的生長。在放射線誘導細胞損傷模式中，紅麴山藥酒萃物和其功效成分 ankaflavin 能抑制放射線所誘發 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 TGF-β1 mRNA 大量表現之情形，monascin 對 IL-1β、IL-6 和 TGF-β1 mRNA 表現具抑制作用，但對於 TNF-α 則不具影響。綜合以上，紅麴山藥酒萃物能緩解放射線治療衍生的副作用，適合輔助臨床癌症治療。
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