臺灣大學生化科技學系學位論文
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近年來真菌感染的患者日益據增，尤其以白色念珠菌(Candida albicans)最為常見，而抗真菌藥物的過度頻繁使用，也引發抗藥性問題。因此許多研究開始尋找其他的治療方法，像是兩種藥物的合併使用等。光動力殺菌(Photodynamic inactivation, PDI)是不同於以藥物治療微生物感染的方式，透過光反應產生單態氧與自由基對微生物造成傷害。本研究以PDI結合Fluconazole的方式，期望透過PDI增強Fluconazole對白色念珠菌的殺菌效果，降低藥物使用劑量，減少抗藥性產生機會。 在本研究中，發現PDI對於白色念珠菌之懸浮細胞具有殺菌效果，且PDI造成的damage程度越嚴重，菌體需要修復的時間就越長，越晚進入log phase。實驗結果也發現PDI結合Fluconazole能增強對白色念珠菌的殺菌效果，降低藥物使用劑量。進一步發現以TBO 0.1 mM進行PDI後，如果不於2小時內加入Fluconazole，菌體會有修復損傷情形，無法達到增強殺菌效果。類似的增強殺菌效果也在PDI結合Posaconazole的研究中發現。此外，結合PDI和Fluconazole對白色念珠菌的臨床抗藥性菌株，也會有協同性的殺菌效果。最後，應用在白色念珠菌的生物膜殺菌上，無法像在懸浮培養上有明顯的增強殺菌效果。未來將朝向生物膜表面的胞外聚合物破壞程度與藥物作用性質，探討如何進一步結合PDI和Fluconazole來增強對生物膜的殺菌效果。
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有別於傳統DNA技術在探索如何解密序列中編碼之遺傳訊息，DNA 奈米科技賦予了DNA新穎應用價值，做為多功能奈米材料用以構建各種可操控之奈米結構體及奈米裝置。本篇論文目的即為開發更多DNA奈米科技潛能，開發新穎訊號放大檢測平台。有鑑於人體內生物核酸分子之基因變異及其不正常表現量已被證實與許多疾病和癌症劃上等號，因此，科學家們致力於找尋與其相對應之具指標性核酸生物分子。僅管聚合酶連鎖反應技術廣泛應用於傳統上檢測核酸分子，然而，污染源於反應過程一併放大及需特定可執行變溫操控之儀器等等之缺點促使更多取代此技術的相關研究蓬勃發展。本論文中第一個研究將DNA奈米科技結合電化學系統應用於檢驗阿茲海默症之基因點突變。此系統利用立足點鏈替代反應來區分點突變，配合限制酶-聚合酶協同放大反應來擴增DNA分子的產出，進而引發下游電化學反應。實驗結果確定了此平台的可行性，並展現其對於同時存在的目標突變DNA及未具突變之正常DNA序列有良好選擇性。有鑑於最新研究指出微小去氧核糖核酸分子(microRNA)對於引發阿茲海默症扮演重要角色，同時microRNA也被指出與許多疾病甚至癌症的發展相關，故microRNA也成為一新興生物指標分子。特別是存在血液中的穩定的循環microRNA更是許多相關技術發展的重點。第二個研究則針對檢測microRNA的重要性來發展攝護癌的檢測平台。此平台利用量子點修飾一段含有兩功能DNA序列，其一是能辨識目標microRNA之互補序列，另一則是一序列引子，用以引發端粒酶作用延長序列以形成具催化光學受質之G-四面體結構DNA分子。藉由雙股辨識酶協助目標miR-141循環反應，使引子裸露引發訊號催化反應，如此二階段放大反應成功偵測miR-141，並有效區分同家族內或是不同家族間的相似序列之microRNAs。更甚者，此平台並實際應用於檢測攝護腺病人的血清並與健康男性做對比。實驗結果發現我們的系統優於現有之酵素連結免疫吸附分析法測量攝護腺抗原之方法，具有其臨床應用價值。第三個研究進一步將DNA 奈米技術應用於癌細胞成像及治療。此平台利用癌細胞表面大量表現之核仁素(nucleolin)作為標鈀，使其設計的DNA探針能以雜合鍵反應自組裝形成G四面體在癌細胞表面。利用DAPI螢光染劑染色共同培養之乳癌細胞(MDA-MB-231)與乳房正常上皮細胞(M10)，發現乳癌細胞能被專一性的染記標記，顯示DNA探針能成功自組裝於癌細胞上。利用具有細胞毒殺性之鋅紫原紫質(zinc protoporphyrin, ZnPP)可嵌入G-四面體之平面內的特性，分別處理癌細胞及與常細胞，發現在同時有DNA探針預先作用及ZnPP處理後的之癌細胞有顯著且協同細胞毒殺性。此結果展現此平台做為針對癌細胞同時檢測及治療的潛在應用能力。
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白點症病毒 (white spot syndrome virus, WSSV) 為目前蝦養殖產業最主要也是最致命的病原菌。自白點症病毒爆發至今已有二十餘年，但因其開放譯讀區的序列與目前已知的物種有很大的差異，因此至今尚未能完全了解其致病機制並發展出有效的藥物來控制白點症病毒所造成的疫情。白點症病毒為一具有外套膜的大型雙股DNA病毒，能感染許多的甲殼類動物 (crustacean)，其中對蝦科 (Penaeidae) 在感染此病毒後會在二至五天內死亡，死亡率高達90%-100%。本研究室從白蝦 (Litopenaeus vannamei) 選殖出一轉錄因子，將此轉錄因子基因的胺基酸序列進行線上資料庫比對後，發現其為一個類Ying Yang 1 (YY1) 蛋白質，並將其命名為 LvYY1。先前本研究室的研究指出，LvYY1會透過結合於白點症病毒極早期基因wssv108以及ie1啟動子上的YY1結合位來調控啟動子的轉錄活性。Dorsal是哺乳類動物NF-κB家族轉錄因子中RelA的同源蛋白質，而許多報導指出，Dorsal轉錄因子會參與無脊椎動物的Toll/NF-κB調控路徑，此路徑為無脊椎動物先天性免疫的調控者。本研究透過冷光報導分析法 (luciferase reporter assay) 發現LvYY1能活化wssv108啟動子的轉錄活性至10.39倍，過量表現LvDorsal時則無法活化wssv108基因的表現。但是當共表現LvYY1與LvDorsal時會協同活化wssv108啟動子的轉錄活性至44.57倍，此現象說明LvYY1及LvDorsal會協同調控極早期基因wssv108的表現。除此之外，LvYY1與LvDorsal也會協同調控ie1及wssv304核心啟動子的轉錄活性。另外利用GST-pull down法發現LvYY1與LvDorsal能在細胞體外直接結合，而透過免疫共沉澱法也得知LvYY1分別能與LvDorsal及PmTBP於細胞內結合。然後以電泳泳動性轉移分析法 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 及DNA親和性沉澱分析法 (DNA affinity precipitation assay, DAPA) 證實LvYY1可能會伴隨著細胞中內生的轉錄因子結合在wssv304的核心啟動子上。LvYY1於協同效應中扮演著關鍵的角色，而白點症病毒能夠挾持宿主轉錄因子LvYY1及LvDorsal大量表現極早期基因，以協助自身基因組的複製。
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光動力療法為常用之癌症治療方法之一，乃透過給予特定波段光源以活化光敏劑，並產生自由基及活性氧化物(如單氧分子)，而引發細胞毒殺作用。然而光動力療法之效果常取決於病灶組織內氧氣濃度，在深層腫瘤區域普遍缺氧或因光動力治療而造成腫瘤處局部缺氧情形而使療效受限，導致癌細胞無法有效地被毒殺。目前針對治療深層腫瘤組織的缺氧區域，已有低氧性生物還原型前驅藥物(TPZ, Tirapazamine)被研發出來並進行臨床試驗中，癌細胞在吞噬該藥物後經由特定還原酵素活化即可產生毒殺的效果。因此本論文研究旨結合光動力治療及低氧性生物還原型前驅藥物，針對腫瘤內組織氧氣分布不均的環境進行治療，期待改善單一藥物在癌症治療上的效果。將光動力治療所造成的腫瘤環境氧氣濃度下降的缺點轉變為有利於低氧性生物還原型前驅藥物作用的微環境，希望藉此複合型治療策略提升癌細胞毒殺效率。本論文結果證實在正常氧壓(21% O2)的環境下，光動力治療所使用之光敏劑PpIX經由波長630 nm激發光活化後會消耗環境中的氧氣並產生單氧分子；且也發現氧氣濃度的降低至5%以下會提高該細胞內CYPOR還原酵素的活性。藉由在模擬實際腫瘤組織內氧氣濃度為5%、2%及1%的細胞實驗中，結果發現隨著氧氣濃度降低會造成光動力治療對細胞的毒殺能力下降，反之TPZ藥物對細胞的毒殺能力有上升趨勢。將兩種療法結合，則可在5%氧濃度環境下發揮協同毒殺作用，推測即為TPZ受到酵素催化形成的中間產物，在有氧的環境下會回復成原前驅形式藥物，伴隨接收電子後生成的超氧化物在細胞中造成毒性傷害。總結來說，本論文所觀察到的研究結果發現，根據腫瘤微環境氧氣濃度的分布而發展出的複合型治療法結合光動力治療和低氧性生物還原型前驅藥物TPZ應可為腫瘤治療策略上提供新的方向。
本文將於2026/12/31開放下載。若您希望在開放下載時收到通知，可將文章加入收藏。
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子代的代謝狀態會受母親所提供的子宮環境而影響，且這樣的影響可能會造成子代成年後健康，也就是所謂胎兒規劃 (fetal programming) 假說。 過去的文獻指出，懷孕期間母體若攝入過多脂肪及膽固醇而引起高血脂症，會提高子代成年後出現心血管疾病以及脂肪肝的發生率，但詳細的機制目前還不清楚。故本實驗欲建立一個穩定的高膽固醇血症動物模式，研究母體營養對其子代成年期健康之影響及其可能分子機制。我們選用對於高油脂高膽固醇飲食有高敏感性的 apolipoprotein E 剔除 (ApoE-/-) 小鼠做為模式動物，在母鼠孕期前、孕期及哺乳期進行高油脂高膽固醇飲食處理，並在子代斷奶後持續以飲食誘導，欲觀察子代在發育早期處於高膽固醇的環境所造成的健康影響。 本研究中將孕鼠分為高油脂高膽固醇 (Western diet, WD) 組及正常飲食組 (Control diet, CD)。WD 組及 CD 組子代斷奶後皆餵食 Western diet，分別為 W-W 組以及 C-W 組，一共生 3 胎子代。本研究測量動脈粥狀硬化及脂質代謝評量指標: 主動脈弓粥狀硬化斑塊、體重組織重量、血液及肝臟脂肪含量、肝臟及脂肪之病理切片。W-W 組子代在 3 週齡斷奶時，血清膽固醇及三酸甘油酯濃度顯著高於 C-W 組，但 8 周齡後兩組間沒有差異。23 周齡犧牲時，第一、二胎兩組肝臟脂肪含量無顯著差異，但 W-W 組子代有較嚴重的脂肪肝，其餘生理指標如動脈粥狀硬化斑塊面積比例、脂肪細胞大小的差異則不明顯。之後第三胎子代於 16 周齡犧牲，W-W 組子代比起 C-W 組，肝臟及脂肪重量顯著增加，肝臟膽固醇及三酸甘油酯含量顯著增加，肝臟中脂質合成的相關基因 Fasn、Acacb、Srebf1、Srebf2、Lipe 和Chpt1，以及脂質運輸相關基因 Abcg5 和 Abcg8 在 W-W 組子代比 C-W 組有較高的表現量。 綜合以上結果，母鼠孕期前後的高血膽固醇會造成子代成年後脂質在脂肪組織以及肝臟堆積，隨著年齡增長還可能演化為脂肪肝。而肝臟脂質堆積可能是與脂質合成以及運輸相關基因表現量提升有關。後續的研究將會著重於表觀遺傳如何影響此現象。
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便秘為常見之腸胃道症狀，飲食及生活習慣改變或代謝、神經系統等方面疾病會導致便秘，便秘也會使腸道老化，其亦為大腸癌之風險因子之一。目前已有許多文獻指出乳酸菌可增加便秘患者之排便頻率及糞便含水量。本研究以 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 原末菌粉評估便秘之改善功效。以每日 2 次皮下注射 loperamide (2 mg/kg BW) 減緩 Sparque-Dawley (SD) 大鼠腸道蠕動速率誘導便秘產生，同時介入低、中、高劑量之 NTU 101 原末菌粉 (1.3、2.6、13.0 mg/kg BW) 探討其改善效果。結果顯示管餵 NTU 101 菌粉低、中、高劑量均可增加腸道蠕動速率，分別較誘導組上升 12.4%、13.2% 與 15.0%；並可增加糞便含水量，分別較誘導組增加7.6%、8.4% 與 10.9%，此結果顯示低劑量即有改善排便之功效，且隨著劑量增加效果更佳。此外，餵食 NTU 101 原末菌粉可增加糞便中Bifidobactrium spp. 菌數，減少Clostridium perfringens 菌數，增加糞便短鏈脂肪酸濃度及降低 pH 值，並能夠增加結腸黏膜層厚度 (mucosal thickness)、分泌黏液之杯狀細胞 (goblet cells) 及卡哈氏間質細胞 (interstitial cells of Cajal, ICC)。綜合以上結果，NTU 101 原末菌粉可改善由 loperamide 所引起之便秘症狀外，也具有改善腸胃道功能之效果。
本文將於2026/08/01開放下載。若您希望在開放下載時收到通知，可將文章加入收藏。
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EB病毒 (Epstein-Barr Virus)，屬於皰疹病毒科γ亞科，其生活史包括潛伏期 (latency) 與溶裂期 (lytic cycle)。病毒在進入溶裂期後會大量表現病毒基因，複製遺傳物質並組裝成為病毒顆粒，此過程中外鞘殼體 (capsid) 的組裝是非常重要的步驟。BORF1是EB病毒的次要外鞘蛋白質 (minor capsid protein)，能與BDLF1形成三聚體 (triplex) 並引導其餘的外鞘蛋白質進入細胞核內進行組裝。Tripartite-motif 5 alpha (TRIM5α) 是反轉錄病毒的限制因子 (restriction factor)，本實驗室先前研究發現TRIM5α能與BORF1直接結合，並利用其E3連接酶 (E3 ligase) 活性催化BORF1的泛素化修飾使其穩定性下降，進而抑制病毒溶裂期的發展。本研究首先證明TRIM5α B30.2功能區上的surface patch區域對其與EB病毒外鞘蛋白質BORF1的結合相當重要。接著觀察BORF1泛素化修飾的情形，顯示lysine 114為其上重要的泛素化修飾位置，若突變會提昇BORF1蛋白質的穩定性。TRIM5α亦能催化BORF1的K63鍵結長鏈泛素化修飾，顯示其降解可能與選擇性自噬作用有關。本研究進一步發現選擇性自噬作用的受體p62/sequestosome 1 (SQSTM1) 能透過辨認BORF1上的泛素化修飾而與其結合。此外，若抑制溶酶體 (lysosome) 活性則會使受泛素化修飾的BORF1累積，並提昇與p62的結合量。最後，若以siRNA抑制細胞中p62的含量，則BORF1的表現量會上升。綜合以上結果，本研究發現TRIM5α能與p62共同作用，透過選擇性自噬作用降解BORF1。
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腦中風再灌流 (cerebral stroke reperfusion) 所導致腦部傷害包括腦中產生大量自由基所造成氧化壓力傷害、能量不平衡、發炎反應以及細胞凋亡。先前多篇文獻指出乳酸菌具有降低氧化壓力、發炎反應等功效，另外近年也有文獻提到益生菌透過菌腦腸軸線 (brain-gut-microbiota axis) 間接影響腦部認知功能。本研究探討 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 原末菌粉對腦中風大鼠是否具有改善學習記憶能力及降低腦中發炎反應的效果。腦中風的動物誘導模式使用八週齡大之 Sparque-Dawley (SD) 雄性大鼠進行雙側總動脈斷流再灌流 (bilateral common carotid artery occliusion-reperfusion, BCCAO) 手術。此誘導模式會造成大鼠學習記憶能力大幅下降、腦部嚴重發炎，而餵食 NTU 101原末菌粉對大鼠學習記憶能力具有明顯的改善效果，可抑制神經膠質細胞 (neuroglial cell) 中星形膠質細胞 (astrocyte) 及微膠細胞 (microglia) 的活化，並降低腦中發炎細胞激素 TNF (tumor necrosis factor)-α、IL (interleukin)-6和 IL-1β及一氧化氮 (nitric oxide) 濃度，顯著降低發炎相關蛋白 iNOS (inducible nitric oxide synthase)、NF-κB以及MAPK路徑蛋白之表現量。綜合以上結果，餵食 NTU 101原末菌粉可透過減輕發炎反應，改善腦中風再灌流所造成的學習記憶損傷。
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Epstein-Barr Virus (EB 病毒) 屬於人類疱疹病毒科，其生活史包括潛伏期 (latent life cycle) 與溶裂期 (lytic cycle)，而極早期蛋白質 Rta 是促使 EB 病毒進入溶裂期的關鍵轉錄因子之一。本實驗室在先前的研究中發現 Rta 蛋白質在 EB 病毒潛伏期時會分布於粒線體。粒線體參與了許多細胞生理途徑，如能量的產生、細胞死亡、宿主免疫反應的誘導和老化等；而粒線體自噬 (mitophagy) 為維持粒線體網絡健康的重要機制。本研究欲證實 Rta 蛋白質上是否具有粒線體導向序列 (mitochondria targeting sequence，MTS)，並初步探討 Rta 蛋白質位於粒線體上的意義及其扮演的角色。首先以具有病毒潛伏的 P3HR1 細胞、B95-8 細胞及 293-2089 細胞為材料，利用免疫螢光染色分析探討 Rta 於細胞中的分佈情形，結果證實 Rta 蛋白質位於粒線體；同時利用粒線體分離分析結果指出，細胞中 Rta 蛋白質在細胞質與粒線體中皆有表現。接著利用 293T 細胞為材料，轉染入不同 Rta 片段之建構質體，可藉由觀察其進粒線體與否推定出 MTS 為 Rta 蛋白質之 N 端第 68 至 90 胺基酸片段，並由生物資訊軟體預測出其具有 α 螺旋體結構。接著以共免疫沉澱分析證明了 Rta 蛋白質會與粒線體外膜蛋白導入受體 (import receptor) Tom20 結合。而後以 ATP 測定分析結果發現，在 293T 細胞表現 Rta 後會使細胞中的 ATP 產量提高。最後，以 carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) 處理 293T 細胞，誘導粒線體損害進而引發粒線體自噬，結果發現 Rta 蛋白質的表現可能會促進粒線體自噬。總和以上所述，本研究首度證實 Rta 含有一 α 螺旋體結構的 MTS，可位於粒線體並影響粒線體的功能。
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根據世界衛生組織在2012年的統計報告中顯示，全球男性罹患攝護腺癌的比率佔所有癌症的第二名，且因癌症而死亡的病患人數佔所有癌症的第五名，其中侷限性攝護腺癌 (localized prostate cancer) 的病患在確診五年後的存活率高達百分之八十，而大多數造成死亡的案例是因為攝護腺癌轉移至周遭的骨骼、淋巴腺或是其他器官，所以亟需開發針對轉移型攝護腺癌的診斷平台。Integrin α2β1為type I collagen 主要的受體，且在許多癌症中會過量表現並參與癌症的惡化及轉移的路徑，所以Integrin α2β1為合適的癌症診斷的生物標記，我們的實驗目標為透過噬菌體呈現技術篩選對於integrin α2 I domain具高度專一性的胜肽，並未來將之運用於臨床檢測及分子影像。首先，我們利用C7C phage display library進行biopanning且篩選對於integrin α2 I domain有結合性的環狀胜肽，並且透過phage ELISA binding assay找到兩個與integrin α2 I domain 有結合力的目標胜肽，再利用type I collagen competition assay鑑別目標胜肽與integrin α2 I domain之間的專一性，發現只有C7 胜肽會影響type I collagen與integrin α2 I domain之間的鍵結能力。隨後，利用FITC saturation binding assay測試目標胜肽與integrin α2 I domain的dissociation constant (Kd)，發現兩個目標胜肽的Kd落在μM鍵結等級區間，接著將兩個目標胜肽進行in vitro實驗。我們將具有螢光標定的C7或C8胜肽與攝護腺癌細胞PC-3或22Rv1進行反應，透過螢光訊號偵測兩個胜肽結合到攝護腺癌細胞的能力。由實驗結果發現，兩個目標蛋白對於攝護腺癌細胞鍵結強度的差異與其integrin α2β1的表現量成正相關。綜合目前的實驗結果，我們認為C7或C8胜肽在in vitro中具有與integrin α2β1鍵結的能力，而in vivo的實驗正在進行中。
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