臺灣大學生化科技學系學位論文
國立臺灣大學,正常發行
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子癲前症 (pre-eclampsia) 是一種以高血壓為特徵的妊娠相關疾病，根據世界衛生組織 (World Health Organization WHO) 統計約有3~8% 的孕產婦受到子癲前症的影響而造成母體損傷及胎兒發育不完全，並且在中低收入的國家中，子癲前症更是導致胎兒早產及死亡的主要原因之一。雖然子癲前症的患者大多在孕期20週後才出現不適的症狀，但許多研究也指出子癲前症可能在懷孕的初期就已發生，因此開發能夠早期偵測並診斷子癲前症的檢測方法是必要的。在本實驗中，我們選擇 miR-210 作為偵測目標並且結合雙股專一性核酸酶 (duplex specific nuclease, DSN)以及核酸增幅技術 (DNA amplification method) 並以96孔盤作為反應平台設計一種恆溫且類酵素連結免疫分析法 (Enzyme-linked immunoassay)的檢測方法。首先，目標 miRNA會被修飾在96孔盤底部的髮夾狀探針 (Hairpin probe) 辨識形成RNA-DNA雙股，接著透過DSN的專一性作用來產生附著於盤底的單股DNA，而此DNA可作為引子進而啟動下一階段的滾環式擴增法 (Rolling circle amplification, RCA) 使訊號得以被放大。在此RCA的反應中，核酸聚合酶可利用環狀探針 ( circular probe) 為模板合成出G-四聯體 (G-quadruplex) ，並且在加入氯化血紅素 (Hemin) 時形成具有辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase, HRP) 活性的 DNAzyme。當環境中有3,3',5,5' –四甲基聯苯 (3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine, TMB) 時，具HRP 活性的DNAzyme 便可催化過氧化氫的還原，進而使溶液由透明轉為藍色，透過分析顏色變化便可計算出樣品中 miR-210的含量。利用此設計，我們期望針對 miR-210開發出一套恆溫、高專一性、高靈敏性且操作門檻較低並有潛力診斷子癲前症的檢測平台。
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嗜鹽古細菌利用感覺型視紫質 (SR) 調控光趨性反應。本研究室於2010年發表了嗜鹽方形古菌 (Haloarcula marismortui) 為一株同時具有六種菌式視紫質的嗜鹽古細菌，其中包括三種光驅動離子幫浦和三種SR，除了被廣泛研究的SRI和SRII外，首次發現了SRM以及其配對傳導元HtrM。SRM-HtrM獨特之處在於SRM本身特徵吸收峰波長為503 nm，介於另外兩種感覺型視紫質之間；而HtrM相較於SRI和SRII的傳導元，同樣具有兩個穿膜螺旋，但在胞內側僅具一個HAMP-domain而非兩個，並且缺乏能與下游Che蛋白質作用的methyl-accepting domain。針對SRM-HtrM的特異性，2019年本研究室陳政良同學將SRM-HtrM移植到一株只有SRI和SRII兩種感覺型視紫質的Halobacterium salinarum中，發現活化SRM-HtrM同時會抑制菌體原先對藍光的迴避行為及對紅光的趨向行為，但其中的分子機制尚不清楚。本研究以生物資訊學分析SRM-HtrM發現：（一）HtrM和HtrII的第二個穿膜區進入胞內側的區域有一保守且與功能相關之轉角結構；（二）HtrM的C端有一個可能與Che蛋白質進行交互作用的區域。針對以上兩個功能相關區域進行突變得到突變型SRM-HtrM重組融合蛋白，並完成其特性測試。而為了往後測試HtrM與Che蛋白質間是否有交互作用，從Hm全基因序列中擷取CheW1基因並成功純化出帶有GST-tag之重組蛋白質。另一方面，截至目前為止，SR-Htr的功能性測試皆需要在嗜鹽古細菌中測試菌體光趨性，而嗜鹽古細菌的轉形相當耗時且不易成功。本研究以SRM和SRM-HtrM作為實驗對象，並結合全細胞光電流和蛋白質光電流測試發展出簡易且能快速測試SR與Htr之間是否有適當交互作用之功能性測試。
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白色念珠球菌 (Candida albicans) 為人體常見的伺機性致病真菌，平時與人體保持共生關係，唯人體免疫力低下時，白色念珠球菌會進一步增生並感染人體。在臺灣，白色念珠球菌是醫療照護相關感染 (health care–associated infection) 比例最高的真菌菌種，臨床上仰賴抗真菌藥物對其感染進行治療。然而，抗真菌藥物的廣泛使用驅使白色念珠球菌抗藥性菌株數量上升，因此發展新的抗真菌劑勢在必行。幾丁聚醣 (chitosan) 擁有發展成抗真菌劑的潛力，且對白色念珠球菌展現良好殺菌活性，但其中的抗菌機制尚未研究透徹。為了探討其中機轉，對前人的突變株庫 (mutant library) 篩選結果做進一步研究。結果顯示，相較於白色念珠球菌野生株，zcf31 突變株對幾丁聚醣敏感性明顯上升。幾丁聚醣的施加使白色念珠球菌產生不規則細胞形狀和細胞膜邊界模糊，而模糊情形在 zcf31 突變株細胞壁也可以觀察到。有趣的是，zcf31 突變株展現異常增厚的細胞壁，伴隨對細胞壁干擾劑抗性上升，細胞膜干擾劑抗性下降。透過 RNA-seq 分析，發現六個 mannosyltransferase 基因在 zcf31 突變株中表現量上升，分別在 zcf31 突變株背景下剔除此六個基因，其中 MNN41、MNN42、MNN45、MNN1 或 MNN15 基因的剔除可以部分回復 zcf31 突變株細胞壁厚度或對細胞表面干擾劑的敏感性。綜合以上結果，推測 zcf31 突變株中 mannosyltransferase 基因表現量上升，可能導致細胞壁蛋白質醣基化樣式改變，進而造成異常細胞壁結構和藥劑敏感性變化。
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對嗜鹽古生菌而言，氫視紫質會受光激發並作為氫離子幫浦，製造胞內外質子濃度梯度，進而驅動ATP合成酶運轉，對生產ATP相當重要。因此，如何在幫浦打出質子後，維持其功能不受外界提升後的質子濃度回饋抑制，為其能否達到更高的能源效率的關鍵。在2015年本實驗室分類的一種新BR亞型qR，發現到此類BR可以承受較低的pH環境，而窩氏鹽方扁平古菌 (Haloquadratum walsbyi) 的BR HwBR為其一員，同研究中亦已解得結構。鑑於BR是製造胞內外質子梯度來間接協助合成ATP，因此，可以耐胞外酸也表示，製造胞內外質子濃度差的能力是增加的。在先前實驗結果，發現到HwBR有較高的酸耐受性 (acid-tolerance)，且透過與結構比較，初步發現到有兩個區域與此性質有關，分別是在胞外側的R82與T201形成的脫水元 (dehydron) 結構，及在視黃醛結合口袋 (retinal binding pocket) D2位置的W94。在本研究中藉由將此三位點突變為R82E、T201S、W94F組合為三、雙、單點突變，藉由測試其光化學性質並比較不同突變組合的差異，進而了解各點位對HwBR酸耐受性之重要性。在光譜的實驗結果中，發現到W94F之有無決定了最高吸收峰 (Ab-max) 的藍移與否。在光電流的測試中，組合三突變點位後，蛋白質所能耐受酸的能力會因而下降，在pH 5.8的環境下便無法對抗環境中質子濃度進而打出質子，了解到三位點之間有抗酸的協同作用產生；而降低pH後，發現W94F突變株的酸耐受性明顯降低。進一步測試光週期狀態，在基態 (G state) 的結果中，W94F突變會造成光週期後段拖尾的現象；M態 (M state) 測試中，得到未受改變的結果；O態 (O state) 亦有明顯的拖尾，顯示前述W94F對BR作用機制造成的影響主要發生於O態。最後，本研究總結W94能獨立調節HwBR酸耐受性，然而BR整體仍仰賴胞外側的R82-T201及視黃醛結合口袋的W94共同合作，才能達到其高酸耐受性。
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MAPK路徑為真核細胞中廣泛存在且具重要性的訊息傳遞路徑，透過磷酸化方式導入外部訊息，並藉以活化特定反應或基因。在本篇研究中，我們證實白色念珠菌磷酸水解酶Cpp1可作為MAP激酶Hog1與Cek1之間連接橋樑，以調控菌體在不同環境刺激下的型態變化以及細胞反應。根據qPCR結果，CPP1基因在hog1∆突變株中的表現量相較於野生株有顯著下降的情形；Western blotting結果亦顯示Cek1激酶蛋白的磷酸化在hog1∆以及cpp1∆突變株中皆有明顯地提升，說明Cpp1作為Cek1磷酸化的抑制子可受Hog1調控基因表現並藉以控制Cek1蛋白磷酸活性。透過進一步的型態測試發現，CPP1基因的剔除可顯著提升菌體white-to-opaque轉換比率、誘導菌絲生成、以及異常地改變費洛蒙誘導的反應型態，而這些的現象亦會隨著CEK1基因的剔除而消失。目前已知Cek1激酶活化為白色念珠菌活化費洛蒙吸附反應的必要因子，本篇研究亦有興趣尋找Cek1下游受轉錄因子Cph1所調節費洛蒙吸附反應的關鍵基因。透過基因轉錄的比較分析，我們系統性地篩選出至少四個受費洛蒙誘導表現的未知基因。利用對突變株的型態測試，我們發現ORF19.1539、ORF19.1725、ORF19.2430以及ORF19.5557，其基因缺失大幅降低白色念珠菌費洛蒙誘導的吸附力，但對於交配反應與交配效率並無造成明顯影響。說明white型態的白色念珠菌在費洛蒙誘導下，可利用Cek1活化下游特定的white-specific基因以啟動菌體吸附反應。此外，qPCR分析亦發現，ORF19.1725基因表現同時受轉錄因子Cph1與Tec1所調控，且其基因缺失對於菌體的生物膜、菌絲生成以及致病力皆有嚴重的影響。這些結果顯示此基因對於白色念珠菌的致病相關機制十分重要。綜合本篇研究的結果，我們對於白色念珠菌MAPK間訊息調控以及下游牽涉的重要基因功能皆有突破性的了解，期許這些成果未來可進一步發展作為臨床上抗真菌藥物開發的重要契機。
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白色念珠菌(Candida albicans)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為造成院內感染的常見菌株，且其在臨床上的治療也面臨抗藥性的問題。開發天然化合物或其衍生物來作為抗菌藥物，被認為是一種可行的研究方向。其中，從薑黃（Curcuma longa）的有效成分中萃取出的薑黃素(Curcumin)具安全有效的生物活性，如抗發炎，抗氧化等等；另外，薑黃素具廣泛的抗微生物活性，包括抗菌和抗真菌特性以及影響其生物膜形成的能力，且目前已有文獻發現，高濃度的薑黃素對白色念珠菌及金黃色葡萄球菌的懸浮細胞皆具有抗菌活性。本研究工作主要是利用實驗室既有配方所製備而成的Curcumin對白色念珠菌及金黃色葡萄球菌的抗菌能力進行測試。實驗結果發現相較溶解於DMSO的Curcumin，實驗室製備的Curcumin配方對白色念珠菌具較高的抑菌效果；而雖然針對金黃色葡萄球菌須採用較高濃度的劑量才具明顯抑菌能力，但在低劑量的情形下尚可嘗試結合臨床常用抗菌藥物的方式增強其抑菌效果。因此，本研究之目的除了利用實驗室製備的Curcumin配方測試對白色念珠菌及金黃色葡萄球菌的抗菌能力外，也進一步比較其結合臨床常用抗菌藥物(Ampicillin、Gentamicin及Fluconazole)對這兩種菌株之抑菌效果外，也比較這一配方在具抗藥性的菌株(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的殺菌能力。結果發現在結合臨床藥物及Curcumin配方後，發現可有效降低所需劑量或能達到全殺之抗菌效果。另外，為瞭解這一與臨床藥物的增強效果是否僅針對單一菌株具專一性，故同時測試同為革蘭氏陽性菌的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis )之抗菌能力，而實驗結果也發現具有相同的效力。
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愈來愈多的植物胜肽分子被發現會參與植物防禦，藉由啟動茉莉酸訊息傳遞路徑，促進次級代謝物生產。然而這些胜肽在毛狀根累積次級代謝物中扮演怎樣的角色仍所知甚少。本研究中我們首先建立番茄毛狀根。接著利用菸草毛狀根作為研究材料，測試多種胜肽對尼古丁含量之影響，並參考菸草毛狀根之操作程序測並測試胜肽對番茄毛狀根累積番茄鹼能力之影響。研究結果顯示，在菸草毛狀根中，0.1 μM茉莉酸甲酯能刺激尼古丁累積，但添加菸草或番茄系統素後，原本0.1 μM茉莉酸甲酯所能累積之番茄鹼含量受到顯著抑制。而在番茄毛狀根中，同時添加0.1 μM茉莉酸甲酯及番茄系統素或flg22，番茄鹼含量相較只有0.1 μM茉莉酸甲酯的處理下降20%。本研究結果顯示，無論在煙草或是番茄毛狀根中，特定胜肽會抑制0.1 μM茉莉酸甲酯累積代謝物之能力，暗示著與0.1 μM 茉莉酸甲酯及特定胜肽間存在著拮抗關係。
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嗜甲醇酵母菌 Komagatealla phaffii (Pichia pastoris) 為目前被廣泛使用之重組蛋白質表現系統，可以甲醇誘導之強力啟動子 AOX1 大量表現重組蛋白質，且具有與哺乳動物較為相近之轉譯後修飾及可以釀酒酵母之外泌訊號胜肽α因子將蛋白質分泌至胞外之特性，常被使用於科學研究及工業發酵領域。 近年來隨著合成生物學之發展， 同時針對 Komagatealla phaffii 蛋白質表現系統內不同因子進行調控以及建構多個基因迴路之研究逐漸盛行，希望能以各式策略強化 K. phaffii 系統之各種優勢，使其能具備更高之應具價值。然而目前 K. phaffii 系統中已發表之合成生物學常見工具，如基因編輯系統、基因篩選標記回收系統、胞內 DNA 組裝工具及基因調控系統皆較為缺乏，妨礙此類研究的大幅進展。 本研究首先以前人於 K. phaffii 內建構之以 AOX1 啟動子表達 Cas9 及以 U6 啟動子表達 sgRNA 之 CRISPR/Cas9 工具將 K. phaffii 內生性基因 ADE2 及外源性基因 ZeoR 進行剔除，證明以該系統進行基因編輯之可行性。再以鼠李糖 (Rhamnose) 誘導之 LRA3 啟動子取代 AOX1 啟動子表達 hspCas9，避免影響 AOX1 啟動子之重組蛋白質表達量，並配合在質體上加入目標基因之同源重組模板及改變誘導表現 hspCas9 之流程，以提升 CRISPR/Cas9 基因編輯工具之效率，進一步改善本實驗室建構之 U6 CRISPR/Cas9 基因編輯工具之應用性。
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NDT80 在真菌當中是一個非常保守的基因，然而Ndt80p卻在不同的物種當中演化出不同的功能。在發酵酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 當中Ndt80扮演調控減數分裂的角色，但是在致病真菌白色念珠菌 (Candida albicans) 卻演化出三個 NDT80-like 基因，NDT80、REP1 與 RON1，並在白色念珠菌當中負責調控生物膜生成、藥物抗性 (drug resistance) 與代謝N-乙醯葡醣胺 (N-acetylglucosamine, GlcNAc) 的功能。同樣是屬於CTG支序群 (clade) 的熱帶念珠菌，也擁有三個NDT80-like的同源基因。在台灣非白色念珠菌念珠菌屬 (non-albicans Candida spp.) 在院內感染的情形日益嚴重，而最盛行的即為熱帶念珠菌 (Candida tropicalis)。在本研究中將著重於探討熱帶念珠菌RON1 所扮演的功能。透過序列比對， CtRon1 與 CaRon1 僅具有39.7% 的保守性 (identity)，而在以N-乙醯葡醣胺為碳源的培養基上，熱帶念珠菌 ron1∆ 突變株仍能正常生長，且不參與調控代謝GlcNAc的相關基因。然而，實驗結果顯示，REP1 與GlcNAc 代謝有關。在菌絲調控上，熱帶念珠菌ron1∆ 突變株沒辦法透過血清誘導生成菌絲，同時也會造成生物膜形成的缺失。有趣的是，rep1∆ 在N-乙醯葡醣胺的刺激下，會促使菌絲生成，有別於N-乙醯葡醣胺對於熱帶念珠菌野生株所扮演之抑制菌絲生成的角色。最後利用小鼠觀察RON1是否影響熱帶念珠菌的致病能力，結果顯示，ron1∆ 突變株的致死率大幅降低。說明在熱帶念珠菌當中，RON1 參與調控菌絲、生物膜生成以及影響對小鼠的致病力。
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發展規劃指的是當胎兒在早期胚胎發育階段，母體受到外界環境的刺激下，會增加子代成年後罹患心血管及代謝性疾病的風險，表觀遺傳的調控可能參與其中。研究顯示母親孕期間暴露於高膽固醇血症會增加子代成年後罹患胰島素阻抗及動脈粥硬化之風險，且已知心血管疾病與基因組高度甲基化程度有關。故本實驗旨於研究降低母體甲基化程度是否會影響子代罹患動脈粥狀硬化的病程。六週齡大 ApoE 缺陷小鼠以正常飲食或西方飲食誘導，懷孕前及泌乳期間給予甲基轉移酵素抑制劑 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza)或 PBS，子代出生後皆餵食西方飲食。結果發現親代母鼠給予 5-aza 的處理下，其子代雌雄鼠在3週齡斷奶期間，5-aza + CW組別在體重以及血脂濃度都顯著低於 PBS + CW組；子代雄鼠 5-aza + CW 組別相較於 PBS + CW 組有較差的葡萄糖耐受性及胰島素阻抗，但是血管內有較少斑塊的堆積；另外母體施打 5-aza 的子代雌鼠，脾臟細胞有較低比例的 CD8 T-cell 以及巨噬細胞，且降低了其骨髓衍生巨噬細胞 (BMDM) 進行古典活化 (M1) 及發炎反應。 綜合實驗結果可知，母鼠低甲基化程度，可能藉由影響 M1 巨噬細胞的極化分化以及發炎反應來減緩子代成年後罹患動脈粥狀硬化之風險。