國立臺灣大學生命科學系學位論文
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ATP合成酶是一種以多個次單元組合而成的蛋白複合體，可以進行ATP的生合成，並提供細胞生存所需的能量。粒線體是細胞中重要的ATP合成胞器，因此，長久以來ATP合成酶被認為僅在粒線體中表現；然而，一些近期的研究發現ATP合成酶在癌組織的表皮細胞、淋巴細胞、肝細胞，以及乳癌和肺癌細胞株的細胞膜表現，這一類ATP合成酶我們稱它們為「異位表達ATP合成酶」。這些ATP合成酶具有在胞外合成ATP的功能，我們先前的研究發現透過藥物citreoviridin可以抑制其ATP產生的活性，進而引發癌細胞的死亡，然而它們是如何被運輸至細胞表面的機制至今仍然不清楚。為了找出參與在這種運輸機制的蛋白分子，我們使用RNA干擾為基礎的篩選實驗，首先在抑制25個參與運送有關的基因表現後，以細胞ELISA測量細胞表面的ATP合成酶表現量；我們同時也以流式細胞儀和細胞免疫螢光染色方法，驗證在細胞ELISA的實驗中被認為涉及ATP合成酶運輸的蛋白，是否真的可以改變細胞膜上ATP合成酶的表現量。結果發現有PARK2、MFN1以及COPA等基因可能在異位表現之ATP合成酶組裝、運輸機制中，扮演重要的角色。
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蛋白酶參與在生物體內許多重要的生理機制，像是消化、凝血及組織重組等。而在眾多蛋白酶中，金屬蛋白酶是一群具有最多元酵素功能的蛋白酶，其中基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)、ADAM及ADAMST為金屬蛋白酶中主要的三個類群，他們都需要金屬離子的協助才能具有正常的酵素活性。而MMP是目前具有最多研究的金屬蛋白酶，他們是主要調控細胞外間質(Extracellular matrix)的分解及構成，已被發現參與在發育及再生過程中的細胞增生及移動。雖然在斑馬魚及渦蟲中MMP已被發現參與再生的過程，但MMP在再生中的機制仍不甚清楚。由於淡水生的環節動物瓢體蟲 (Aeolosoma viride) 具有很強的再生能力，並且使用和脊椎動物類似的機制來進行再生，因此在此篇研究中被用來進行MMP與再生的研究。在此論文的研究結果中，選殖出瓢體蟲中三種基質金屬蛋白酶，其中兩種是鑲嵌在膜上的MMP (MT-MMP)而另外一種是分泌型的MMP。其中兩種MMP在再生早期會高量表現於新生成的組織中，顯示該兩種MMP可能參與在再生的早期過程。進一步去檢測在再生過程中MMP的活性變化，發現到MMP在再生24小時的時候會在新再生組織中具有很高的酵素活性。再以MMP活性的抑制劑GM6001去抑制在再生中MMP的活性，來了解MMP在再生過程中的功能，發現到只有在再生0-12小時內抑制酵素活性會顯著地降低再生的成功率。依據這些結果都確實MMP參與了瓢體蟲的早期頭部再生。
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蕨類配子體型態矮小相似，無足夠外型特徵以成功鑑別物種，但使用DNA分子條碼可提供較足夠的分子特徵，解決外部型態特徵鑑別蕨類配子體與未鑑別物種之困難。然而目前蕨類植物無一個通用所有物種的分子條碼，本研究以蕨類研究常用的matK、rbcL及trnL-L-F三個分子條碼區段，依據引子通用性(PCR成功率高低)、定序序列品質(扣除因重複鹼基造成讀序失敗後之成功率)、與物種區別效力(最小種間遺傳距離是否大於最大種內距離、種內個體能否形成單系群)三項標準加以評估效力，選取最有潛力發展為通用的蕨類植物分子條碼。 本研究樣囊括分類階層範圍為台灣蕨類植物28科77屬217種。第一項評估PCR成功率結果，trnL-L-F可成功放大99.33%物種、rbcL達88.55%、matK為67.34% ，若採取通用性加類群專一性兩階段引子放大matK，PCR成功率提高為85.86%。第二項定序品質成功率，在rbcL為100%、matK為98.01%、trnL-L-F為86.69%。第三項物種區別效力中，種間大於種內遺傳距離差距(Barcoding gap物種對)比例trnL-L-F為95.61%、rbcL為95.42%、matK為87.70%。種內個體形成單系群比例trnL-L-F為90%、rbcL為85%、matK為82%。綜合三項標準，trnL-L-F具最高分子條碼效力。本研究因廣泛取樣跨類群之台灣蕨類植物，對比過去其他研究大多僅採用一項標準的結果更為可信，由於trnL-L-F物種區別效力之種間種內遺傳距離差距比例與單系群比例，均超過90%，單一條碼trnL-L-F即可在蕨類通用性鑑種。
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自分泌運動因子(Autotaxin, Atx)是一種存在於大部分的體液當中之分泌性溶血磷脂酶，在胚胎發育的過程中扮演著重要的角色。已知在老鼠胚胎中剔除Atx導致血管與神經系統發育不全，並於胚胎發育期9.5天時死亡。然而，Atx調控神經系統發育的作用機制則尚未明瞭，主要由於哺乳動物胚胎發育不易觀察，因此我嘗試利用體外發育且通體透明之斑馬魚建立Atx缺失模式以利機轉探討。首先我觀察到atx表現於出生後11小時至36小時的斑馬魚胚之神經系統，利用嗎
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前端無顆粒狀腦島皮質(rostral agranular insular cortex, RAIC)是大腦皮質中 島葉的前端,在人腦中位於顳葉的內側,又稱大腦的第五葉。島葉是腦邊緣系統的 一部份,和很多感覺調控都有關係,包括內臟感覺、情緒等,也參與在疼痛反應的 調控上。過去研究指出當島葉有病變或是受到藥物抑制時,會有鎮痛的反應。這表 示在正常狀態下,活化島葉會造成痛覺過敏。過去腦核磁照影也指出島葉會參與在 調控慢性痛的迴路裡。慢性痛是一個非常麻煩的病症,對於患者會持續產生疼痛感 覺和影響患者的生活品質,過去研究指出慢性痛的生成可能和大腦中疼痛核區的 突觸長期性改變有關。而突觸長期性的改變,或稱可塑性(Plasticity),通常和核 區內興奮性和抑制性細胞的調控失衡有關,而影響一個核區的活化。所以我們假設: 島葉是因為核區內興奮性和抑制性細胞的調控失衡,而活化核區,最後影響慢性痛 的生成。實驗室過去的研究已提出一個有力的證據,在前端無顆粒狀腦島皮質中, 第五層的錐狀神經元與丙胺基丁酸神經元細胞會在慢性痛後有差異性的活化,只 有投射細胞錐狀神經元被活化。 因此,為了更進一步探討慢性痛在突觸上產生的可塑性變化,我進行了全細 胞鑲嵌技術(Whole-cell patch clamp)同時紀錄第五層的錐狀神經元與丙胺基丁酸 神經元細胞,探討這兩種細胞對來自於第二三層同樣的興奮性刺激的突觸生理,並 比較其在疼痛前和疼痛後的差異。我的研究主要在於疼痛處理前做探討,分為兩個 部分,突觸後與突觸前反應。 (1) 突觸後反應:可以發現在錐狀神經元的興奮性突觸後電流較丙胺基丁酸 神經元細胞來得慢也比較長。同時我也測量了N-甲基-D-天門冬胺酸接 iv 受器(NMDA receptor)在突觸後神經元的比例,我發現錐狀神經元細 胞中的N-甲基-D-天門冬胺酸接受器較丙胺基丁酸神經元細胞有較大的 比例。 (2) 突觸前反應:我紀錄了配對脈衝比率(Paired-pulse ratio),發現錐狀細 胞的前突觸皆為配對脈衝促進性,但丙胺基丁酸神經元細胞有些呈現促 進性,而有些呈現抑制性。還發現投射到丙胺基丁酸神經元細胞的前突 觸趨勢性較高的神經濾胞釋放機率。 最後,由於先前研究指出慢性痛會誘發磷酸化細胞外信號調節激酶(pERK), 所以我測試了該激酶對於島葉突觸的影響。我發現當誘發磷酸化細胞外信號調節 激酶(pERK)時,會增加興奮性突觸後電流。而進一步的疼痛研究將是我們未來 的目標。
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開花植物如何演化並藉其有性或無性繁殖策略維繫物種存續，是植物學研究的重要議題之一。俄氏草具有包含「成花反轉」及「假性胎生」並形成無性繁殖體（珠芽）的獨特繁殖方式，先前研究顯示俄氏草花序特性基因ToCEN亦在珠芽序中表現，暗示珠芽序和花序在結構與遺傳調控上具有若干同源性。演化發育學理論敘及新形態發生常源自修改既有基因與調控機制而產生，因此本研究旨在探討是否也具有同源套組基因參與調控俄氏草花與珠芽分生組織這兩種同源構造的發育過程。研究中選擇了成花決定套組基因作為主要的探討對象，即幹細胞特性基因WUSCHEL (WUS)與其共同調控因子AGAMOUS (AG)。有趣的是，在大多數物種裡都只會有各一個WUS和AG的直系同源基因(ortholog)，然而這兩個基因在俄氏草裡都發現了基因複製的現象，並且在發育過程呈現分歧表現。其中ToWUS1、ToAG1、ToAG3主要表現在花序，而ToWUS2與ToAG2則主要表現在珠芽序。雖然這類保守的套組基因複製並不常發生，一旦發生了則通常會伴隨著天擇作用。而此現象正好與在俄氏草裡看到的結果相符，模式檢定亦支持ToWUS2有受到正向天擇的證據，或許和它複製後具有其時空表現與功能棲位有關，並提供珠芽分生組織無限生長之特性。總結本研究呈現在俄氏草遺傳組中複製的幹細胞特性基因ToWUS1與ToWUS2分別和同源之有性與無性分生組織的器官生成相關，而創新的WUS-AG套組基因表現模式可能和新的形態發生有關，且該新形態係構成在俄氏草繁殖策略中至關重要的珠芽序。
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細胞分裂與細胞分化往往需要精準分配彼此的比例來確保胚胎發育過程中適切的成長與神經特化。藉由鑽研斑馬魚腦部發育，我觀察到一個微管(microtubule)降解基因，stathmin-like 4 (stmn4)特別且專一地表現在背側中腦（dorsal midbrain）區域。而且該表現區域能與另一個泛神經分化代表基因，elavl3，交錯表現在發育中腦部，暗示stmn4於神經發育的角色。經由morpholino oligonucleotides (MOs)抑制部分蛋白質生成或是給予外加持續活化形式的Stmn4蛋白質，我發現不論是降低(knockdown)或是提高(overexpression)都導致神經分化訊號提早出現於背側中腦。同時，利用CRISPR/Cas9基因修改技術，我也製作出stmn4突變魚(mutant)。但是在其純合子（homozygous）突變幼魚裡卻只觀察到少於10%之前在降低表現幼魚(morphants)所看到的現象，這或許是因為stmn1b增加的補償作用來撫平stmn4的缺失。此外，在縮時攝影當中我發現到在morphants神經前驅細胞分裂與分化的差異。再者，morphants的細胞週期中明顯增長的G2相也能被我用外加的Cdc25a降回正常。最後，把Wnt訊號抑制更能將stmn4轉錄產物給剃除。這些結果都告訴我在神經龍骨時期（neural keel），Wnt訊息傳遞能藉由調控Stmn4在斑馬魚背側中腦的動態平衡來控制細胞週期中G2相長度，進而確保中腦免於過早進入神經分化。
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蛋白質是頭足類動物重要的營養來源，而氨是胺基酸代謝的主要產物，因此氨的調節對於頭足類動物生理恆定十分重要。本研究運用真蛸(Octopus vulgaris)、虎斑烏賊(Sepia pharaonis)以及萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)的鰓進行離體灌流實驗，比較並探討採取不同運動模式的頭足類動物對於氨之調節策略。實驗結果顯示：頭足類動物鰓部對氨的運輸皆具有雙面向的調節功能：真蛸、虎斑烏賊與萊氏擬烏賊鰓部血液中的含氨濃度分別高於300 μM與100 μM會進行排氨；而血液含氨濃度在分別低於300 μM (真蛸與虎斑烏賊)與100 μM (萊氏擬烏賊)時，則不排氨以維持鰓部氨濃度。檢測鰓部的排氨速率則發現：萊氏擬烏賊之排氨速率高於其他兩物種。另外，真蛸與虎斑烏賊正常血液含氨濃度皆高於萊氏擬烏賊。進一步經由血酸處理(pH 7.2)與對照組(pH 7.6)的比較結果發現：氫離子伴隨氨排除濃度增加的現象只出現在真蛸鰓部。這些結果暗指頭足類動物體內和鰓部組織的含氨濃度與牠們採取不同運動模式有著密切關聯。除此之外，本研究利用離體灌流優勢進行藥理實驗探討鰓部氨運輸之機制，成功地在軟體動物導入嶄新的離體生理研究模式並釐清頭足類對於氨的調節機制。
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藍斑核(Locus Coeruleus)大部分是由去甲腎上腺素神經元(noradrenergic neurons)所組成，是主要提供正腎上腺素(norepinephrine)至前腦(forebrain)的腦區，它調控了許多生理行為作用如焦慮、記憶、學習及清醒等等。之前我們實驗室的鼠腦片(brain slice)電生理的研究顯示，伽瑪-氨基丁酸乙型接受器(γ-Aminobutyric acid B receptors，GABAB receptors)是只要主要調控藍斑核的強直性抑制(tonic inhibition)的神經傳導物質接受器，並且可以藉由調控環境中的伽瑪-氨基丁酸可以調控藍斑核的神經放電速率(firing rate)。在本實驗中，我們測試了伽瑪-氨基丁酸乙型接受器是否也能夠在生物體的藍斑核中擁有調控其強直性抑制及神經放電速率的功能。 首先，在測試實驗中，我們先以伽瑪-氨基丁酸乙型接受器促效劑(agonist)經由外管直接注入至活動大鼠(Sprague-Dawley Rats)的藍斑核，在不同天的同一時間測試其睡眠以及清醒的時間比例差別，結果發現在藥物給予後的大鼠其睡眠時間有顯著性的增加(P=0.020526，N=4)。故我們推斷伽瑪-氨基丁酸對於藍斑核的抑制作用確實會影響生物體的睡醒比例。為了確定是伽瑪-氨基丁酸乙型接受器的作用造成此結果，我們將外管植入至藍斑核，在由異氟烷(isoflurane)氣體麻醉的誘導全身麻醉(general anesthesia)之下，將實驗老鼠四腳朝天以翻正反射(return of righting reflex)以及腦電波(Electroencephalography，EEG)來判定其由麻醉轉至清醒所需的時間。我們的結果顯示，在異氟烷停止給予後，經由內管對藍斑核的直接局部灌注伽瑪-氨基丁酸乙型接受器拮抗劑(antagonist)藥物CGP35348能夠降低結束麻醉至翻正反射的時間(845.89±98.73 seconds，N=9)，其數據顯著低於控制組(灌注人工腦脊髓液)(N=9)，以及沒有注射至藍斑核的組別(N=10)。 但是在局部灌注下，無法確定該行為上的改變是由於藍斑核或是其他鄰近藍斑核區域例如中腦三叉感覺核區(mesencephalic trigeminal nucleus neurons，Me5)等受到藥物影響而產生，故我們使用能夠同時記錄單一神經元神經放電速率以及注射藥物的電極，記錄在聚氨脂(urethane)或三氯乙醛(Chloral hydrate)麻醉下的老鼠其在緩慢注射伽瑪-氨基丁酸乙型接受器拮抗劑藥物CGP35348之前後藍斑核神經元神經放電速率的變化。此實驗數據顯示，藍斑核神經放電速率在藥物注射前300秒之神經放電速率為2.9158±0.9422Hz，在藥物注射後300秒則為9.8599±2.5460Hz，其神經放電速率在藥物注射後明顯高於注射前(P=0.01497，N=6)，而在其他型態染色上非位於藍斑核之神經元放電速率紀錄統計，其神經放電速率在藥物注射前以及注射後並無顯著差異(N=29)。且在藍斑核位置注射控制組磷酸根緩衝液生理食鹽水(phosphate buffer saline，PBS)之前後也並無顯著變化(N=6)。綜合上述實驗，我們的結果證實伽瑪-氨基丁酸乙型接受器對藍斑核的強直性抑制的確會對於生物體的睡醒調控有一定影響。
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黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)在許多重要的細胞生理過程上扮演著重要的角色，其中包括了胚胎發育及器官發育等過程。儘管我們已知FAK在胚胎發育過程中的重要性，然究竟FAK如何調控早期胚胎發育，又如何在此一時期與其他訊息分子溝通的研究還是很有限。在本論文中，藉由比較fak1a與1b與人類FAK的氨基酸序列, 我發現兩者有高度的相似性。利用mopholino oligonucleotides (MO)抑制蛋白質生成，我觀察到魚胚(morphants)的外包作用(epiboly), 胚體趨中與延展作用(convergent extension)以及下胚層(hypoblast)細胞的移動都受到明顯的影響。藉由細胞的移植實驗, 我發現fak1a所調控的細胞移動受外界環境所影響，肌凝蛋白(filamentous actin，F-actin)在細胞外包作用時所產生的環狀構造(actin ring)在fak1a缺乏的胚胎是不完整的,進而推測其可能為導致胚外包作用缺失的原因。我同時也利用了CRISPR/Cas9的基因修改技術製作出了fak1a的突變魚(mutant)，但僅有少部分胚有腔腸化缺陷的表型。然而在mutants與mophants我發現相同的基因有上升之趨勢，此顯示相似的細胞傳導路徑受到了影響，更重要的是我發現Wnt5b可能位於fak1a的上游調控下游路徑以調節細胞移動的過程。藉由mRNA拯救的實驗我發現其下游因子是small GTPase，Rac1與CDC42。總結,我首次在斑馬魚胚腔腸化過程中發現了FAK與WNT5b共同藉由調控Rac1與CDC42影響了肌凝蛋白之動態平衡以控制細胞移動現象。