臺灣大學臨床動物醫學研究所學位論文
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
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骨關節炎(osteoarthritis, OA)，又稱退化性關節病(degenerative joint disease, DJD)是一種非炎症性退化性的關節軟骨病變，無論人或動物，此疾病皆為中老年族群中最常見的問題之一。軟骨本身很差的再生能力再加上目前仍無有效逆轉病程的治療方式，也造成了骨關節炎在處理上的複雜性。 由於幹細胞具有分化的能力，能夠藉由新生組織，達到適當修復及癒合的效果，近年來已受到再生醫學領域的高度關注。以關節注射方式植入幹細胞，屬微創的外科治療方式，就機制上來說，間葉幹細胞有能力促進軟骨的新生及抑制關節內的發炎反應，進而延緩甚至改善關節炎的病程，故有機會成為關節炎治療的替代療法之一。 本研究第一部分，將利用系統性文獻搜尋的方法，以實證醫學的角度，探討動物關節內注射間葉幹細胞於治療骨關節病之臨床成效。研究共納入11篇動物相關研究文獻，種別包含鼠、兔、豬、羊、馬及犬隻，文中詳列出文獻所提之受試動物、研究材料、評估方式、試驗結果…等，並以美國FDA網站公布之實證醫學指導原則，針對各文獻實驗設計及研究方法的品質做分級。結果顯示，因相關研究極少，且各研究間之實驗異質性大，無法進行統合分析提出一有效之結論，不過就個別研究成果來看，以關節內注射提供間葉幹細胞的治療方式，大多數結果顯示的確能在關節內進行某種程度的組織修復效果。 第二部分的研究，將利用豬隻脂肪來源的異種間葉幹細胞，治療犬隻骨關節炎，並評估其治療效果。受試動物包含三隻臨床上患有膝部退化性骨關節炎的犬隻，以關節注射方式，植入每個關節約500萬個間葉幹細胞。關節炎病程評估方式包括：主觀性之骨科學檢查評量、飼主問卷評量，以及客觀性之放射學檢查與犬隻步態測力板分析。結果顯示在經過間葉幹細胞關節注射治療的三隻犬隻，無論是骨科學檢查、飼主問卷及測力板數據皆顯示能減緩膝部骨關節炎之症狀，進而達到患肢功能上的改善。 雖然以關節內注射間葉幹細胞之治療方式於實驗動物及臨床上的初步成果皆顯示有某種程度的治療效果，然而間葉幹細胞關節內作用機制尚未完全被證實，因此在將此療法納入常規治療前，其治療劑量、合適療程、介入時間點…等相關資訊，仍需經過日後更多大規模臨床試驗的證實。
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食蛇龜（Cuora flavomarginata）為台灣原生種烏龜，且為台灣四種原生龜中唯一陸棲型淡水龜，且由於長年棲地的破壞以及走私捕捉，面臨瀕臨絕種的危機，但現今爬蟲類文獻中對於食蛇龜的研究仍相當缺乏，尤其基礎生理及血液學資料皆尚未建立，因此本研究目的在於建立食蛇龜的正常體態參考指標及血液生化參考值，以期應用於獸醫臨床醫學及生態保育研究。 本實驗研究食蛇龜以圈養且臨床理學檢查正常之成年食蛇龜53隻，其中雄龜17隻、雌龜36隻作為觀測對象，健康體態參考指標以Jackson’s ratio、體重除以背甲長的對數回歸方程式進行分析。結果顯示食蛇龜的體重與背甲長存在正相關性，體重除以背甲長的比例會隨著背甲長增加；同時建立了食蛇龜的體重背甲長回歸方程式，可根據季節和性別的不同用來預測正常的體重範圍。 在血液生化參考值之建立上，以同一群圈養之食蛇龜於1月、4月、7月、10月為台灣四季代表月份，以物理保定方式進行頸靜脈抽血，檢驗血液中項目包含血容比、血紅素、紅白血球計數及血球細胞染色。血液生化學包含總蛋白、白蛋白、尿酸、尿素氮、肌胺酸酐、葡萄糖、天門冬酸鹽轉氨酶、氨基丙酸轉氨酶、膽固醇、三酸甘油脂、鹼磷酶、血鈣、血磷、肌酸磷激脢共14項，以國際臨床病理聯盟（International Federation of Clinical Chemistry, IFCC）法則建立正常參考值的範圍，並分析性別及季節單獨對於血液生化值的影響和性別與季節的交互作用。 血液學和血液生化值的參考值分析，雄龜和雌龜間的血紅素、血容比、紅血球總數、平均血球血紅素、淋巴球比例、嗜酸性球比例、單核球比例、鹼磷酶、天門冬酸鹽轉氨酶、尿素氮、血鈣、尿酸、膽固醇、肌酐激脢、血糖、血磷、總蛋白、三酸甘油脂具有差異存在。季節因子方面，除了平均血球血紅素、白血球總數、淋巴球比例、嗜鹼性球比例、氨基丙酸轉胺酶、血鈣、膽固醇、總蛋白不受影響外，其餘均有差異。繁殖行為及度冬是主要造成性別與季節間的差異原因。食蛇龜的血球在型態外觀上和其他爬蟲相似，在Liu’s Stain可得到良好的染色效果。此外和台灣另兩種原生烏龜班龜和柴棺龜比較，食蛇龜具有較高的嗜鹼性球比例和總蛋白，較低氨基丙酸轉胺酶濃度，而雌龜的三酸甘油脂則較高。 本實驗所完成的健康體態參考指標和血液生化參考值，可直接應用於獸醫臨床和生態保育相關工作上，根據實驗觀察此兩項檢查皆具有低侵入性的優點，實驗模式及資料未來可成為其他爬蟲類動物臨床或研究之參考。
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一、 研究目的 本實驗目的為調查犬隻嗎啡誘導嘔吐與麻醉下食道酸鹼值之關聯性。 二、 研究方法 研究對象為至臺灣大學生農學院附設動物醫院外科就診，因非腹腔手術而接受全身麻醉的犬隻病患，此外若罹患腸胃道疾病，以及持續服用已知會影響胃蠕動性、胃酸分泌能力或胃食道括約肌張力的藥物之病患，則不納入此研究。總共蒐集至少30隻犬隻病患作為實驗組，15隻犬隻病患為控制組。 實驗組為術前給藥計畫中包含嗎啡的犬隻，術前給藥不含嗎啡的犬隻病患納入控制組，但給藥計畫若包含其他嗎啡類藥物者，亦不納入控制組。嗎啡以肌肉注射途徑給予，劑量為0.5mg/kg。若在注射嗎啡後發生嘔吐，即量測及紀錄嘔吐物酸鹼值。病患在接受注射後至少十分鐘才能進入導入麻醉及插管，並於插管後經口放入食道酸鹼測量儀探頭量測食道酸鹼值，由麻醉醫師每五分鐘紀錄一次食道酸鹼值，直至麻醉結束。病歷記錄包括品種、體重、性別、年紀、鎮靜藥種類、propofol導入劑量、麻醉時間、術中及術後併發症。 三、 結果 共有47隻狗進入研究(實驗組31隻，控制組16隻)。實驗組中的31隻狗中有19例(61.3%)在給予嗎啡後十分鐘內發生嘔吐，此外，31隻狗中有16例(51.6%)在麻醉中發生胃食道逆流。其中發生嘔吐的19例中有10例(52.6%)發生胃食道逆流，未嘔吐的12例中有7例(58.3%)發生胃食道逆流。統計顯示嗎啡與嘔吐對於初始食道酸鹼值並無明顯的影響。嗎啡誘導嘔吐與性別、年紀、體重及鎮靜藥物亦無顯著關係，有關之風險因子只有品種。與控制組相比，術前給予嗎啡會顯著增加胃食道逆流的機率。 四、 結論 術前給予嗎啡無論是否引發嘔吐，均不會影響麻醉後食道之初始酸鹼值，顯示食道具有廓清酸性物質的能力。但術前給予嗎啡整體仍會增加胃食道逆流的機率，除此之外術前給予嗎啡在臨床上的短期副作用影響很小。
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肥大細胞瘤為犬隻中最常見的皮膚腫瘤，約佔所有犬隻皮膚腫瘤16到21%，現今大部份的治療方法為使用合併多種治療方法。在內科治療中，其中一個已被文獻證實有效對抗犬隻肥大細胞瘤的常用藥物為prednisolone，然而，目前尚未有文獻完整評估使用單一prednisolone治療犬隻肥大細胞瘤的臨床療效。本篇研究主要目的即為評估使用單一prednisolone治療犬隻肥大細胞瘤的治療效果，包括整體反應率、中位數反應持續時間、無疾病間隔時間以及治療無效時間。本實驗從2001到2010年總共有67隻狗，整體反應率為65% (38/67)，其中部份消退為25隻、維持穩定疾病為11隻以及完全消退和疾病進展各為1隻，此反應率較先前的化學治療文獻研究(包括單一治療或合併治療藥物)皆為高。在38隻外觀可摸到腫瘤的犬隻中，中位數反應持續時間為39.5天，而中位數治療無效時間為66天；其他27外觀無明顯腫瘤的犬隻中，中位數無疾病間隔時間為54天，而中位數治療無效時間為67天，無論中位數反應持續時間或中位數無疾病間隔時間皆比先前文獻較為短。大致上而言，所有病畜對單一prednisolone治療的副作用皆能良好承受。腫瘤鄰近淋巴結狀態(p=0.04)和治療反應(p=0.013)為影響反應持續時間的重要因子；犬隻品種(p=0.043)為影響無疾病間隔時間的重要因子；至於外觀可摸到腫瘤的犬隻中，無統計上明顯差異的因子影響治療無效時間；但在外觀無明顯腫瘤的犬隻中，犬種(p=0.031)和治療反應(p=0.013)為影響治療無效時間的重要因子。另外在使用單一prednisolone治療與使用合併治療(prednisolone加cyclophosphamide和prednisolone加vinblastine)的治療效果比較中，在反應持續時間和治療無效時間皆無統計上差異性。由於使用單一prednisolone的治療效果為高整體反應率、短暫的反應持續時間和無疾病間隔時間，我們推論在進行大範圍手術切除犬隻肥大細胞瘤之前，為了達到足夠的手術範圍而使用單一prednisolone治療進行縮小腫瘤體積是一個有效的治療方法。然而，如果肥大細胞瘤的犬隻選擇使用化學治療作為長遠的治療方法，使用多重藥物合併治療則較使用單一prednisolone為較建議的治療方法選擇。
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黑色素瘤(Melanoma)為犬的惡性腫瘤，致病的原因不明，對化療或放療反應不佳，目前有許多新療法如基因治療、標靶治療等正在研發。KIT是一個細胞膜上的RTK(Receptor tyrosine kinase)，藉由與其配體SCF(Stem cell factor)的接合，可活化細胞內的訊息傳遞，進而促進特定的細胞功能；若KIT的功能失調(過度表現或出現突變)則會使細胞癌化，在活體上造成惡性腫瘤。KIT的過度表現甚至是突變已在人黑色素細胞瘤中發現，尤其是在黏膜或肢端指甲下的黑色素瘤，其c-kit基因型的表現與標靶治療的效果具有相關性。本實驗以免疫組織化學染色法，佐以PCR技術，來分析臺灣大學動物醫院組織病理資料庫中49個犬黑色素瘤病例的KIT表現及c-kit基因突變的情形，再併同臨床上如發生的位置及預後等相關資料，分析其相關性，以評估KIT作為治療犬黑色素瘤標的之可行性。本研究蒐集的病例平均年齡為12±2.9歲，雄性佔59%(24/49)，雌性佔41%(20/49)，在可以評估的40個免疫組織化學染色的切片中，KIT染色皆為陽性，其中40%(16/40)呈現弱陽性，60%(24/40)為強陽性；在統計學上，KIT蛋白表現的強弱與犬黑色素瘤的發生位置、復發率或患犬的存活時間都沒有顯著的關聯性，但與腫瘤的轉移則有顯著的關聯性(p<0.05)；在49個檢體中，c-kit外顯子11皆沒有發現任何型式的內生性連續性複製(Internal tandem duplications; ITDs)突變，但在其中PCR產物的定序結果發現，一個C1743T的靜默突變(Silence mutation)存在於5個檢體中，這5個檢體中另發現一個T1736C的錯義突變(Missense mutation)，造成一個L579P的胺基酸突變，這個突變的發現，將有機會使用標靶藥物來治療部分犬的惡性黑色素瘤。
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惡性卡他熱 （ Malignant Catarrhal Fever; MCF ）是一種系統性、致命的病毒性傳染病，主要發生於牛及多種馴養及野生的偶蹄類動物。造成惡性卡他熱感染的病源是皰疹病毒屬下的多種病毒，包含α皰疹病毒第一型 (AHV-1)、α皰疹病毒第二型 (AHV-2 )、綿羊皰疹病毒第二型 (OHV-2)、山羊皰疹病毒第二型 (CpHV-2)及MCFV-WTD。 在2008年10月到12月間，台灣地區的野生動物園曾經發生圈養的台灣水鹿突發性大量死亡，組織切片下發現淋巴結大區域的出血壞死、腸道黏膜出血壞死及系統性多器官血管壞死和血管炎，經病理學診斷懷疑為惡性卡他熱。該野生動物園內的所有動物是採集體混養的飼養方式，為了確定感染各種不同的反芻動物的惡性卡他熱病原種類，自2008年七月開始收集動物園內反芻動的物器官生體，和血液樣本，以巢氏聚合酶鍊鎖反應檢測惡性卡他熱病毒，並綜合屍體解剖的病理結果，分析感染不同種反芻動物的惡性卡他熱病毒及不同種反芻動物的惡性卡他熱潛伏感染情形。結果顯示，造成此野生動物園內惡性卡他熱集體感染的病原為綿羊皰疹病毒第二型，其在園內多種反芻動物上都呈現陽性顯性感染，但在園內的綿羊及山羊多為不顯性感染，此病毒在美洲野牛發病多為急性型惡性卡熱，動物於發病後2到3天後死亡。已將感染發病的動物做單獨隔離，並將園區內容易感染發病的反芻獸與病毒的保毒宿主綿羊和山羊做區隔，避免感染情形繼續擴大。
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日本腦炎是人畜共通傳染病，於公共衛生安全上為一重要議題。為了瞭解臺灣馬匹日本腦炎之流行病學現況以供日後之預防與監控，自2010年5月至10月起，於臺灣23處馬場採取217個馬匹血液樣本進行馬匹血清抗體以及血液病毒抗原檢驗。本次接受調查之馬場分為北部 (台北、桃園)、中部 (新竹、苗栗、台中)、南部 (高雄、屏東) 以及東部 (花蓮、台東) 四個區域。採取之血液分別以反轉錄聚合酶鏈反應檢測日本腦炎病毒特定核酸序列以及酵素結合免疫吸附法分析日本腦炎IgG及IgM抗體。反轉錄聚合酶鏈反應及IgM抗體調查結果皆為陰性，但IgG抗體檢驗結果陽性率為94%(204/217)。動物血清IgG抗體之陽性率和性別、年齡、品種、馬匹生活之地理位置、馬場環境管理以及疫苗施打與否無明顯相關，但和馬場環境周圍有稻田以及有機會與豬隻或與禽鳥接觸有顯著相關。
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蒲公英 ( Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz. ) 為著名的傳統中藥，廣泛地被中醫所應用，有清熱解毒、消癰散結、利尿通淋、健胃消炎等功效，通常用來治療炎症性疾病和病毒性傳染病等。乳腺炎 ( Mastitis ) 主要是由細菌或黴菌感染引起乳腺組織的炎症反應。通常使用抗生素治療，但乳品抗生素殘留及抗藥性細菌的問題，日益嚴重，目前首重之課題便是尋找一個替代的治療或預防方法，藉由提高牛隻的免疫能力，增強乳牛抵禦病原菌入侵的能力，為本研究探討的主要目的。 實驗主要分為兩大部分，首先在LPS的刺激實驗中，分別將LPS添加於牛的周邊血液單核細胞 ( PBMCs ) 與乳腺上皮細胞株 ( MAC-T cells ) 中，濃度為 1 μg/mL 與10 μg/mL，以同步定量逆轉錄聚合酶連鎖反應 ( Real time RT-PCR )，測量細胞激素 ( 即IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, GCP-2 ) 表現量的變化，建立基礎值。再者，進行蒲公英萃取物的添加實驗，以LPS的刺激實驗為基礎，在LPS刺激前的4小時，預先將蒲公英萃取物加入周邊血液單核細胞 ( PBMCs ) 與乳腺上皮細胞株 ( MAC-T cells ) 當中，濃度分別為10 μg/mL 與100 μg/mL，同樣以同步定量逆轉錄聚合酶連鎖反應 ( Real time RT-PCR )方式，進行細胞激素表現量的分析，以評估蒲公英萃取物對細胞激素的影響。 實驗結果顯示，蒲公英萃取物在LPS對於牛隻相關細胞所引起的炎症反應有顯著的抑制效果，主要透過調降 ( Down-regulation ) 細胞內前發炎細胞激素( Pro-inflammatory cytokines ) 與趨化激素 ( Chemokines ) 的產生，以達到抑制炎症反應的效果，避免細胞激素過度產生所造成的傷害，進而達到抑制高體細胞數及仿指乳汁變性的效果。 綜合以上可知，蒲公英透過提高牛隻的免疫能力，增強乳牛抵禦病原菌入侵的能力，抑制過度的炎症反應；本研究結果將有助於了解蒲公英在調控發炎相關方面所扮演的角色，以期未來能應用於臨床的治療用途，降低乳房炎的發生率，進而減少抗生素的使用。
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青光眼因為高眼壓會造成視網膜缺血並導致視神經傷害進而視神經細胞死亡。在亞洲國家，枸杞被認為有滋肝補腎與改善視力的功能已經超過2500年之久，此外，近年來奈米技術一直是個熱門話題，認為更小的粒子可能具有更多的有效生物利用度，值得進一步的研究。介質研磨的方式，可以將物質的粒徑減小到奈米/次微米等級，使物質具有較高生物活性成分（膳食纖維，總類胡蘿蔔素，β物胡蘿蔔素和粗多醣）之萃取效率。 為了了解不同粒徑的中草藥枸杞在青光眼高眼壓導致的視網膜缺血、神經細胞的死亡和氧化性傷害等之保護效果，我們建立高眼壓大鼠動物模式，並分析高眼壓大鼠動物模式之視網膜病變特徵，作為青光眼和視網膜缺血傷害之預防與治療研究的基礎。本實驗成功建立穩定高眼壓視網膜缺血大鼠模式，並分析高眼壓大鼠動物模式之視網膜病變特徵，利用視網膜電波圖測量、組織病理學分析、抗氧化物（總麩胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）與脂質過氧化產物丙二醛之濃度測定，評估奈米/次微米枸杞對於實驗性視網膜缺血動物模式造成的視網膜傷害是否具有神經保護之功能。 投予不同粒徑大小不同劑量（細碎非奈米化、介質研磨奈米化；500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg）之枸杞，評估是否對於視網膜缺血性病變有神經保護與對抗氧化傷害的效果。所有枸杞治療組的視網膜電波a波與b波相較於高眼壓視網膜缺血大鼠的未治療組都有保留波幅的效果: a波可以保留約55~60%的波幅，b波可以保留約43~62%的波幅。所有枸杞治療組對於視網膜缺血病變都具有保留視網膜功能的作用。其中以250 mg/kg之介質研磨奈米化枸杞對於視網膜電波圖b波具有最好的保護效果。 在抗氧化傷害方面，不同粒徑大小不同劑量枸杞對於視網膜內抗氧化物（總麩胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）相較於高眼壓視網膜缺血大鼠未治療組均有提升，而代表氧化壓力之脂質過氧化產物丙二醛相較於高眼壓視網膜缺血大鼠未治療組皆有下降，不管細碎非奈米化或是介質研磨奈米化枸杞皆具有保護視網膜的效果。整體來說，250 mg/kg之介質研磨奈米化枸杞與500 mg/kg之細碎非奈米化枸杞相較與其他實驗組，具有最好的抗氧化效果。在血漿中，抗氧化物總麩胱甘肽與過氧化氫酶在傷害未治療組與各治療組間並未見明顯差異，在超氧化物歧化酶與脂質過氧化產物丙二醛則可觀察到投予枸杞皆具有提升抗氧化酵素與降低氧化傷害的能力。綜合結果顯示，枸杞在高眼壓視網膜缺血時對視網膜結構型態及功能與對抗氧化傷害能力上均發現有保護的效果，尤以250 mg/kg之介質研磨奈米化枸杞之保護效果最佳。