中山醫學大學醫學研究所學位論文
中山醫學大學,正常發行
選擇卷期
- 學位論文
前言： 根據衛生署民國九十八年的臺灣民眾十大死亡原因報告， 慢性腎臟病已居國人十大死因的第十位， 慢性腎臟病除可能因腎功能持續惡化而導致末期腎臟病外， 更會增加病患本身死亡的危險性(Wen, Cheng et al. 2008; Bowling, Feller et al. 2011)。而其致病機轉眾多， 細胞凋亡(Apoptosis process)是慢性腎臟病的眾多機轉之一， 而細胞凋亡指標( Apoptotic makers)與急性腎臟病之間的關係已有相關探討(Kaushal, Basnakian et al. 2004; Bengatta, Arnould et al. 2009; Havasi and Borkan 2011)。 本文欲探討這些與急性腎臟病有關的細胞凋亡路徑( Apoptosis pathway)上的Markers在慢性腎臟病組織切片上的表現， 是否也與臨床慢性腎臟病嚴重程度呈現相關。 材料及方法: 我們收集三年內共七十位診斷為慢性腎臟病的病患因各種原因接受腎臟切除手術。 回顧式地研究其腎臟MDM2及p14ARF之免疫組織化學染色與臨床慢性腎臟病嚴重程度間的關係。 結果: 臨床慢性腎臟病較為嚴重( eGFR < 45 ml/min/1.73 m2)的病患其比較臨床慢性腎臟病較為輕微( eGFR >= 45 ml/min/1.73 m2)的病患， 在血清肌酸酐及貧血均有顯著的差異性。 臨床慢性腎臟病較為嚴重的病患其腎臟組織切片比較臨床慢性腎臟病較為輕微的病患， 在腎絲球組織硬化指數、腎間質組織硬化指數有顯著的差異性。 在腎臟組織的正常腎小管之細胞質( NTc)及萎縮腎小管之細胞質( ATc)， p14ARF的染色程度強的均落在慢性腎臟病較為嚴重這一組( p值分別為0.009及0.011， 均達統計顯著差異)( 如Table 7-1b及Figure 4)。 進一步分析發現病患年齡大於等於六十五歲、 BMI組成( 體重過輕與體重過重)、臨床診斷為Urothelial cell carcinoma ( UCC) 、血清肌酸酐 ( mg/dl)偏高、正常腎小管之細胞質( NTc)的p14ARF染色強度強等之變項均對於慢性腎臟病較為嚴重是較為危險( 其Odds ratio及 95% Confidence Interval分別為2.81及1.06－7.44； 66.00及6.08－ 716.18； 10.50 及2.34－47.04； 3.75及1.08－13.07； 558.00及48.24－6453.81； 5.76及1.62－20.45)。 結論: 這個研究指出正常腎臟腎小管細胞質的p14ARF免疫組織化學染色表現強度與臨床慢性腎臟病嚴重程度呈現正相關。
- 學位論文
Pemetrexed disodium (ALIMTA®)是一種多重抗葉酸藥物，其主要可抑制腫瘤 細胞中嘌呤與嘧啶之合成，目前已做為治療非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的一線或二線藥物。然而，目前缺乏臨床生物指標能作為評估其藥效反應之標記。本研究使用八株人類NSCLC細胞株來評估對於ALIMTA具有抗藥性與敏感性及其細胞生長與轉移分子的表現。MTT細胞毒性結果顯示，A549、TL-6、P014與P015細胞對於ALIMTA是較具為敏感性， H1975、H1650、HCC827及H1355細胞則較具抗藥性。以西方墨點法分析NSCLC細胞之內生性蛋白差異，敏感性的肺癌細胞除了A549外，其LCN2和E-cadherin的表現量皆低於具有抗藥性的細胞株。然而，A549與TL-6細胞在添加EGF，再處理ALIMTA後，其細胞存活率並不會因而提升。A549與TL-6細胞在處理ALIMTA後，其cyclin A、 pRB與pEGFR表現量皆有下降，而其LCN2、p-cyclin D、p53與p21則隨著ALIMTA劑量的提高而表現量增加。相反地，H1650與H1975細胞之cyclin A與pRB表現量有微幅上升的情形，p53、p21與LCN2則無變化，p-cyclin D的表現量則微幅下降。進一步地分析對細胞週期影響，不論是對ALIMTA敏感或是具抗藥性的肺癌細胞，ALIMTA皆造成細胞週期之S期的累積。當ALIMTA在低濃度(0.08 μM)時，即能夠有效抑制A549、TL-6和H1650細胞的移行與侵襲能力。最後，以 ELISA偵測45位NSCLC患者在接受ALIMTA治療前及治療後第一次回診抽血中LCN2的濃度，結果顯示，病患在接受ALIMTA第四週期治療即無效者，其LCN2濃度會下降，但可使用ALIMTA達四週期以上有反應療效者，則LCN2濃度則會上升。因此，ALIMTA可影響肺癌細胞之細胞週期變化及轉移能力，並且LCN2變化可以在肺癌中作為對於ALIMTA反應之預測指標。
- 學位論文
研究目的: D型肝炎病毒 (HDV) 引起嚴重肝臟疾病，是造成肝癌以及肝硬化的重要危險因子，而其獨特的複製生活史更加引起研究者對它的興趣。可能因為HDV RNA的序列結構，使得轉錄因子透過D型肝炎病毒抗原 (hepatitis delta antigen, HDAgs) ，能夠轉而辨識HDV RNA來進行RNA之轉錄及複製作用。因為HDV所產生的HDAgs，Small-HDAg (S-HDAg) 以及Large-HDAg (L-HDAg)，具有基因轉活化能力。因此，本研究旨在探討: (1) HDAgs轉活化能力對於細胞基因之調控以及基因與HDV之相關性。(2) 鑑定HDV RNA基因體關鍵性序列片段與HDV RNA複製之相關性。 研究方法: 我們首先建立人類肝癌細胞株Huh7穩定表現HDAg之細胞株，Huh-S和Huh-L，進行HDAgs對細胞基因轉活能力研究。利用人類全基因晶片來篩選受HDAgs所調控之基因。其中部分基因利用real-time PCR以及Western blots確認基因表達量，利用luciferase reporter gene assay以及chromatin immunoprecipitation assay (ChIP assay) 鑑定HDAgs對此基因之調控方式以及確認此基因是否接受HDV調控。此外，本研究將HDV RNA基因體反轉錄成HDV cDNA序列，並搜尋含有啟動子活性之片段，接著共同轉染HDV cDNA啟動子片段以及HDAgs質體觀察HDAgs對此啟動子活性之影響。之後利用in vitro transcription合成野生型和突變型HDV RNA，將in vitro RNA轉染至Huh-S細胞中，利用Northern blots分析序列之複製功能以及利用Western blots分析HDAgs合成能力。 研究結果: 在HDAgs對細胞基因轉活化能力研究中發現: (1) HDAgs能轉活化細胞基因，以全人類基因晶片篩選出近兩萬個受HDAgs影響之基因，當中我們挑選11個基因進行分析。(2) Clusterin (CLU) 受HDAgs誘導表現，且CLU表現與HDV複製成正相關性。(3) S-HDAg以及L-HDAg皆可增強CLU啟動子histone H3乙醯化程度及CLU表現，降低細胞對於化學治療藥物之感受性。在HDV RNA基因體序列的研究中發現: (1) HDV cDNA序列含有兩段雙向啟動子活性區 (TR-P1, nt 1582~1683和TR-I5, nt 1223~1363)，且HDAgs不同程度地正向調控此啟動子活性。(2) HDAg-ORF上的AUG密碼 (nt 1599~1601) 突變成UAG (Amber) 使得單套體RNA能夠合成但是雙套體RNA卻無法合成。(3) TR-P1以及TR-I5進行突變分析會影響HDV RNA複製的能力。(4) 也發現HDV單套體RNA即可編輯合成L-HDAg且獨立於double rolling-circle複製機轉之外。 研究結論: HDAgs基因轉活化能力的研究中發現，CLU是能夠被HDV所調控的基因之一，S-以及L-HDAg能夠增強CLU基因轉錄活性。透過CLU，本研究提供的證據顯示，HDAgs有能力藉由基因體學上 (epigenetic) 乙醯化程度的改變來調控基因表達。然而，細胞內有多少基因透過此方式受HDAgs調控目前仍不清楚。根據基因篩選結果，細胞內受HDAgs影響之基因數量甚為龐大，當中可能部分基因與HDV RNA複製作用相關，另一部分則與CLU功能相似，具有保護細胞承受外界壓力之功能。因此，HDV帶原者可能因為HDAgs對細胞基因的轉活化能力，促使細胞存活能力增強，進而提升細胞致癌性的可能。在鑑定HDV RNA基因體序列的研究中發現，TR-P1可能是合成HDV mRNA、genomic和antigenomic RNA的RNA啟動子。此外，我們發現TR-I5序列與HDAg-ORF序列的正確性與RNA double rolling-circle replication的機制密不可分。藉由本研究對於HDAgs的基因轉活化能力以及HDV RNA-dependent RNA replication過程 相關證據能夠對HDV的探討提供新的想法。
- 學位論文
研究背景:藉由法國休葛蘭醫師 (Choukroun, 2001, Nice, France) 所創新的血小板濃縮技術，不用任何特殊處理即可將富含血小板纖維蛋白從自體的血液萃取出來，此富含血小板纖維蛋白被發現可以增進造骨細胞的生長與增殖，然而為何富含血小板纖維蛋白具有這種功能，其機轉至今尚未被確切了解，本研究是在確立富含血小板纖維蛋白對於人類造骨細胞的細胞附著、增生及phosphorylated Akt、heat shock protein 47 (HSP47) 與 lysyl oxidase (LOX) 等蛋白質表現的效應。 研究方法:收集10位健康的自願者的血液，分別使用細胞增生分析試劑WST-1和螢光偵測染劑alamlar blue方法，經由比色法測定來估量人類造骨細胞 (U2OS) 的細胞吸附與增生效應，用西方墨點法 (Western blot) 來評估p-Akt、 HSP47及LOX等蛋白的表現。 研究結果:在與對照組比較下，富含血小板纖維蛋白被發現可獨自刺激U2OS的細胞附著，且在5天的細胞培養期間可促進造骨細胞的增生。除此之外，富含血小板纖維蛋白以隨時間增加而增加的方式作用(time-dependent manner) 來促進Akt調控蛋白質的磷酸化作用，諸如HSP47與LOX等有相關的膠原蛋白濃度，也因富含血小板纖維蛋白的刺激而提升。 結論: 富含血小板的纖維蛋白能夠增進造骨細胞的細胞附著、增生及同時調升相關膠原蛋白質產物，這些作用可有效促進骨頭新生。
- 學位論文
研究背景及目的：Epithelial-mesenchymal transition (EMT)已被認為是腎間質纖維化的機轉之一。E-cadherin和β-catenin已被視為EMT的指標，和腎纖維化之關係也已被發表。但是仍有關於EMT是否不完全的爭議存在。P120-catenin (p120)具有與E-cadherin跟β-catenin的密切接觸，並對於細胞移行有影響力，因此可能在EMT佔有一席之地。因此，這一篇研究的目的要探討p120在腎小管上皮之表現與腎間質纖維化之關係。同時探討p120與E-cadherin和β-catenin之間的關係。 研究方法及資料：本篇為橫斷面之研究。有73位因為各種原因接受腎臟切除的患者納入研究當中。在排除25位個案後，有48位患者納入研究當中。接著以免疫組織染色法研究這些腎臟當中E-cadherin, β-catenin和p120的表現。再分析指標之間的相關性以及跟腎臟間質纖維化之關係。 研究結果：有較高纖維化程度之族群，其estimated glomerular filtration rate (eGFR) 較低，並有比較高的比例為urothelial cell carcinoma (UCC)以及各種發炎之診斷。指標之間的相關性分析發現，p120與E-cadherin在所有的腎小管皆有相關性，而E-cadherin和β-catenin則在萎縮腎小管的表現有相關性。單變項分析發現eGFR越低，p120在腎小管的表現越高，以及診斷為UCC或是發炎等診斷，皆與較高之纖維化程度有關係。多變項分析發現，p120在腎小管的表現，以及患者是UCC或是發炎等診斷，皆是預測腎間質纖維化之獨立因子。 研究結論：這篇研究顯示p120在正常腎臟小管細胞質之表現與腎間質纖維化之嚴重度有相關性。同時研究也顯示p120與E-cadhein這一個EMT指標在腎小管細胞質中的不正常表現也具有相關性存在。
- 學位論文
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) 會引起十字花科植物黑腐病 (black rot)，造成農業上的重大損失。Xcc 之毒力取決於多種因子，包括胞外酵素、胞外多醣與運動能力。近來有研究指出 Xcc 有一反應調控者 (response regulator，基因編號 XCC3315) 與本菌的壓力反應有關，係由一個CheY-like 接收區 (REC domain) 與一個功能未知的組胺酸-天門冬胺酸輸出區 (histidine-aspartate-related output domain, HDOD domain) 所組成。本研究的目的在於探討 XCC3315 的功能與表現，共分三個部份進行。第一部份：進行 XCC3315 突變株與其互補株的表型分析，探討 XCC3315 的功能。發現 XCC3315 突變會降低本菌的運動能力，但對於致病性與胞外酵素的產生無顯著差異。蛋白質體學分析顯示數種蛋白的表現量因 XCC3315 的突變而改變，其中一個在 XCC3315 突變株中表現量降低的蛋白質被鑑定為由 fliC 所編碼的鞭毛蛋白 (flagellar protein)。報導基因分析也顯示 fliC 之轉錄受到 XCC3315 的正調控。進一步研究發現，XCC3315 調控鞭毛基因 flhF 與 flhB 的表現。第二部分：訂定 XCC3315 重要的高保留性胺基酸。定點突變結果顯示，REC 接收區之 R100 與 HDOD 輸出區之 H287 與 W298對於XCC3315 調控運動性上是很重要的。第三部份：探討 XCC3315 的表現。利用 cDNA 末端快速增幅 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) 技術訂定 XCC3315 之轉錄起始點，位於轉譯起始點上游第 45 個核苷酸 ‘‘A’’。啟動子活性分析與 gel retardation 的結果顯示，XCC3315 的表現受到多元調控蛋白 Clp (cAMP receptor protein-like protein) 直接正調控。報導基因分析也顯示 XCC3315 轉錄起始點上游 -156 至 +80 的片段為其表現所必需。
- 學位論文
海洛因成癮個案接受美沙冬維持療法治療時間長短及門診留存率已被證實與治療的成功及較好的預後有重要相關。治療留存率及影響的相關因子長期以來一直是改善鴉片類藥物成癮治療方案的重要研究課題。 由於台灣美沙冬門診治療留存率大多比歐美及國外很多國家美沙冬門診低，因此本研究之目的在探討中部海洛因成癮個案在兩家醫院門診接受美沙冬維持治療一年的治療留存率及中止治療的危險因子，以作為改善治療成效及提供未來美沙冬門診治療模式改進的參考。本研究採用前驅性、非隨機的世代研究，並以存活分析進行接受美沙冬治療個案的中止治療風險評估。本研究共有995位海洛因成癮個案在中山醫學大學附設醫院及草屯療養院接受門診美沙冬維持治療並經同意後加入研究。本研究所使用的量表包括物質依賴嚴重度量表中文版、生活品質量表(台灣版) 、衝動控制量表、家庭關懷量表、流行病學研究中心憂鬱量表。本研究顯示門診留存率在治療第3個月時為65.7%，第6個月時為61.7%，在12個月時為58.6%，前3 個月是個案中止治療比例最高的時期。本研究發現與同居人或朋友同住的藥癮個案、女性藥癮個案、無緩起訴身份、使用較低美沙冬劑量（小於60毫克）、較低家庭支持及剛接受治療時有較高的心理範疇滿意度的個案皆是美沙冬門診維持治療一年期間中止治療的相關危險因素。建議在治療前三個月應特別注意具備高風險因素而容易中止美沙冬門診治療的個案以減少個案流失；並建議未來能進行更長期的追蹤研究以探討所有會影響藥癮個案持續接受美沙冬維持治療之相關因子，以期能提高門診留存率，而改善預後及達到減少使用海洛因的治療目標。
- 學位論文
蛋白尿與阻塞型睡眠呼吸中止症 (obstructive sleep apnea, OSA) 兩者皆與心血管疾病或死亡相關。我們藉由決策樹的統計分析來檢驗阻塞型睡眠呼吸中止症是否為蛋白尿的預測因子以探討可能因族群分類的不同而有相異的結果。在此橫斷群組世代研究上，藉由人口學、血壓、血液生化分析、單一尿液試紙分析及整夜的多頻道睡眠生理檢查等資料應用於分析300名從事靜態工作的男性。結果發現:其中61位(20.3%)有蛋白尿，且經由邏輯回歸分析顯示糖化血紅素 (glycated hemoglobin, HbA1c)，動脈血氧飽和度<90%的時間長短、年齡、高敏感性C型-反應蛋白 (high-sensitive C-reactive-protein, hs-CRP) 的對數值等；但不包含睡眠呼吸障礙指數 (apnea-hypopnea index, AHI) ，僅能解釋16.7%蛋白尿的產生。而決策樹分析則顯示：年齡大於49歲者會比低或等於49歲者（即對應組）有更高的蛋白尿風險。在高於49歲的族群中，應較對應組 AHI >21次/小時會有較高的蛋白尿風險；相對地在低於等於49歲的族群中，當其HbA1c >7，或是 ≦7，但其BMI >27.4Kg/ m2 時則相對於對應組會有較高的蛋白尿風險。結論: AHI是主要的從事靜態工作的中年後期男性蛋白尿產生的唯一決定因子；而HbA1c與BMI，則是年輕男性蛋白尿產生的決定因子。經由決策樹法統計分析，本研究利用階層分級模式併全方位多因子考量，應更能了解蛋白尿的相關聯因子。
- 學位論文
研究目的：C型肝炎病毒 ( Hepatitis C virus ) 感染是造成肝癌的重要原因之一。本研究想了解在C型肝炎罹病及治療過程中微型核醣核酸 ( microRNA ) 可能產生之影響及變化，並探討其變化與治療療效間之相關性，希望能對C型肝炎臨床治療上有所幫助。另外也可望透過microRNA之篩選，對C型肝炎病患之診斷及再復發的可能性能提出新的判斷依據。 研究方法及資料：首先挑選C型肝炎患者與未受C型肝炎感染者 ( 對照組 ) 各10位之血液檢體做microRNA表現輿圖分析 ( microRNA microarray analysis ) 並由分析結果和已知文獻中選出與對照組表現相比有明顯差異之microRNAs及其下游基因利用及時定量聚合酶連鎖反應 ( Real-time RT-PCR ) 做進一步研究。 研究結果：在慢性C型肝炎患者周邊白血球中，miR-16、miR-193b、miR-199a-3p、miR-222及miR-324-3p表現量增加，而miR-122表現量減少。經過長效型干擾素 ( IFN-alfa ) 與雷巴威林 ( Ribavirin ) 治療後，只有miR-222表現量有增加現象，而miR-16、miR-122、miR-193b及miR-199a-3p表現量減少。此外，miR-324-3p在HCV基因型第一型 ( GT-1 ) 或治療失敗 ( non-SVR ) 患者表現量增加，但HCV基因型非第一型 ( GT-non1 ) 患者表現量卻減少。然而，結束治療三至六個月後，microRNAs表現都有增加之情形。再進一步分析其下游調控基因，發現Mcl-1與miR-193b、miR-199a-3p及miR-324-3p有顯著負相關情形，而Cyclin D1僅和miR-16、miR-324-3p有明顯負相關的現象。 結論與建議： 本研究未發現microRNA與藥物治療效果 ( SVR ) 有直接關係，但其中miR-193b與 miR-199a-3p有高度鑑別慢性C型肝炎之能力。且C型肝炎治療後的實驗結果推測microRNA表現可能與免疫調節有關，需要未來長期及深入研究。
- 學位論文
研究目的：多環芳香烴受器 (Aryl hydrocarbon receptor，AhR) 是一種轉錄因子亦為戴奧辛與多環芳香烴類化合物之受器，當標的細胞暴露於這些污染物質後能使 AhR 活化，進而促進其下游基因表現。我們已於先前研究證實AhR表現在肺腺癌中相較於周邊正常肺組織高，推測AhR在肺腺癌的形成過程中可能扮演重要角色。而許多研究已證實，發炎相關之細胞激素之表現在肺癌形成的過程中亦扮演重要角色。此外AhR已被報導可作為抗癌藥物之作用標的。17-allylamino- 17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) 為HSP90之專一性抑制劑，目前已進入多項腫瘤治療之人體臨床試驗。已知未活化之AhR會與HSP90結合並存在於細胞質中，目前有研究指出，17-AAG處理舌部鱗狀上皮癌細胞 MSK-Leuk-1以及人類上皮角質細胞HaCaT細胞，會降低AhR蛋白量及抑制AhR功能。因此本論文研究之目的為：(1) 探討在肺癌中AhR調控細胞激素IL-6表現的分子機轉；(2) 探討在肺腺癌細胞中AhR表現與抗癌藥物17-AAG之藥效之相關性。 研究方法：收集200例非小細胞肺癌患者之肺癌組織，利用組之免疫染色法分析AhR、 RelA與IL-6之相關性。以siRNA、AhR表現質體或是單株細胞方式來調控肺癌細胞中AhR、 RelA與IL-6基因的表現。以聚落形成能力試驗與裸鼠皮下注射試驗來偵測腫瘤生長情形。NFκB活性以reporter gene assay來偵測。17-AAG對細胞之抑癌活性，以計數細胞存活率與細胞週期分佈來分析。利用免疫沉澱法與細胞免疫螢光染色來偵測蛋白於細胞中之存在位置。蛋白與mRNA量分別以西方墨點法與real-time RT-PCR方式進行偵測。 研究結果：於200例非小細胞肺癌檢體之組織免疫化學染色結果顯示，AhR表現與細胞核RelA及IL-6表現有極顯著正向相關性，尤其是在不抽菸的患者。在人類支氣管上皮細胞 BEAS-2B 與人類肺腺癌細胞 H1355中過度表現 AhR時，會增加 IL-6 mRNA 及蛋白的表現量。而經由 reporter gene assay 方法證明調控IL-6之轉錄因子NFκB的活性會隨AhR過度表現而增強，並透過細胞免疫螢光染色法看到 NFκB 有轉移至細胞核之現象，印證增加AhR表現會促進NFκB活化。此外，在高度表現AhR的細胞中，AhR與RelA會形成複合體並進入細胞核與IL-6啟動子上之κB區段鍵結，進而調控IL-6基因表現。17-AAG處理對高度表現AhR之肺腺癌細胞有較佳的抑癌活性。17-AAG能透過降低AhR蛋白量，進而抑制NFκB調控細胞生長之路徑。17-AAG亦能透過降低細胞週期調控蛋白CDK2、CDK4、cyclin D1、cyclin E、phospho-Rb蛋白量，造成G1期停滯而抑制細胞生長；而在AhR表現較高的細胞中，17-AAG處理後上述細胞週期調控蛋白降低的程度更顯著。高度表現AhR之肺腺癌細胞能表現較多的NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1)，NQO1能將17-AAG代謝形成更具HSP90鍵結親和力之代謝物，因而17-AAG對高度表現AhR之肺腺癌細胞有較強的抑癌活性。 研究結論：我們的研究結果證明，增加AhR表現能促進NFκB活化並增加 IL-6 表現，此機制可能是AhR促進肺癌發生之重要途徑。而在肺腺癌細胞中，AhR除了是抗癌藥物17-AAG之作用標的外，AhR亦是增加17-AAG之抑癌活性之重要因子。