臺北醫學大學醫學科學研究所學位論文
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一氧化氮（NO）已經成為許多生理學上功能的一個重要的調控者。最近的報告提出一氧化氮參與傷口治癒的過程。蟹足腫疤痕是過度的傷口癒合過程，同時一氧化氮在於傷口癒合的發炎治癒階段中扮演很重要角色。起因於一氧化氮在於蟹足腫疤痕形成時所扮演的角色目前尚未完全研究清楚。本論文研究探討一氧化氮在於蟹足腫疤痕形成時的作用機轉。誘導型一氧化氮合成酵素的表現和一氧化氮的產生在蟹足腫疤痕組織中是上升的，但是在於配對的週邊皮膚組織中並沒有上升。此外，外源性一氧化氮可以造成蟹足腫疤痕纖維母細胞(KF)的膠原蛋白質第一型的表現具有劑量－依賴性的增加。一氧化氮也造成膠原蛋白第一型的表現具有時間－依賴性的增加，並且在於蟹足腫疤痕纖維母細胞暴露於一氧化氮24小時後達到最高鋒。 為了要更明確定義NO卅cGMP信號路徑在於蟹足腫疤痕致病病因中的潛在效果，在本研究中進行探討外源性的一氧化氮（從一氧化氮提供者釋放出）在蟹足腫疤痕纖維母細胞的膠原蛋白質表現的提高效果可藉由膠原蛋白第一型蛋白質和TGF－β1的表現增加。DETA NONOate，一種一氧化氮的提供者，被添加入蟹足腫疤痕纖維母細胞的培養中，做為外源性的一氧化氮，釋放一氧化氮到培養基中。膠原蛋白的表現被測試然後決定在蟹足腫疤痕纖維母細胞中總可溶性膠原蛋白與膠原蛋白第一型的增加量。蟹足腫疤痕纖維母細胞中的cGMP濃度以EIA方法測量。外源性的一氧化氮被發現提高膠原蛋白的表現而且提升細胞內cGMP的濃度。而且，評估提升的細胞內cGMP 濃度對於膠原蛋白和TGF－beta1 表現的效果，同時cGMP和TGF－beta1是以ELISA的方式來測量。PDE的抑制劑像是IBMX（3-isobutyl－1-methylxanthine），Vinpocetine，EHNA，Milrinone和Zapriast，已經被報告降低PDE水解細胞內cGMP的作用，並且造成細胞內的cGMP濃度的增加，誘發TGF－beta1的製造和蟹足腫疤痕纖維母細胞的膠原蛋白合成。在這研究中，我們發現PDE活性的抑制作用加強外源性一氧化氮增加膠原蛋白合成的效果。提升的細胞內cGMP濃度是由外源性的一氧化氮所誘發或是由PDE抑制劑來抑制PDE的水解活性所造成的。 提高細胞內cGMP濃度可增加蟹足腫疤痕纖維母細胞的TIMP-1和HSP47的表現。外源性的一氧化氮明顯地加強蟹足腫疤痕纖維母細胞中TGF－beta1對應的增加的TIMP-1和HSP47的製造。 總結這些的結果可以推導一個結論：蟹足腫疤痕病變的過度膠原蛋白形成可能始於蟹足腫疤痕纖維母細胞的一氧化氮卅cGMP信號路徑來快速的增加TGF－beta1，TIMP-1和HSP47的表現所導致的。
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胰臟癌是西方國家是造成癌症死亡的第四項惡性腫瘤，在臺灣也是十大癌症死因之一。百分之八十五的胰臟癌在診斷確立時，已有遠處轉移或局部侵襲至臨近器官，此時只有少於百分之十能夠接受根除性手術治療。胰臟癌患者的平均存活時間只有四至六個月，並且整體的五年存活率小於百分之五。咖啡酸苯乙酯是蜂膠中所具有生物活性的成份。之前對咖啡酸苯乙酯的研究顯示咖啡酸苯乙酯是具有抗病毒、抗發炎、抗氧化、放射線治療的致敏劑等作用的性質。本實驗將以上列藥物作用於人類胰臟癌細胞株，希望能得到一些調控細胞週期及誘導細胞凋亡的相關機轉。對於中度及低度分化人類胰臟癌細胞株BxPC-3與PANC-1,我們以trypan blue dye exclusion test來偵測咖啡酸苯乙酯對細胞株生長的抑制作用。我們藉著觀察morphology，DNA histogram，annexin-V/PI雙染法，agarose gel electrophoresis來檢驗咖啡酸苯乙酯造成人類胰臟癌細胞株BxPC-3的死亡形式。隨著細胞株加入10 μ?g/mL濃度的咖啡酸苯乙酯處理，BxPC-3細胞株在第三天達到80.4 ± 4.1%的生長抑制，PANC-1細胞株在第三天達到74.3 ± 2.9%的生長抑制。BxPC-3細胞株在咖啡酸苯乙酯處理的第二天見到典型的細胞凋亡型態變化但並未見到明顯的DNA片斷化。隨著細胞株加入不同濃度5 μg/mL至20 μg/mL的咖啡酸苯乙酯處理而隨著時間增加sub-G1 population的趨勢，第2日起有較高的細胞株的sub-G1 population 增加。BxPC-3以10 μg/mL濃度的咖啡酸苯乙酯處理、處理的細胞株產生粒線體膜電位下降，在二天後呈現下降至未處理細胞的66.2 ± 11.4%。BxPC-3在經CAPE培養之前加入泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk 50 μM處理，呈現部分的生長的抑制作用及sub-G1細胞群減少。並且BxPC-3細胞加入CAPE 10 μg/mL處理，在2小時後發現caspase-3/7的活性有2倍增加。說明caspase在咖啡酸苯乙酯誘導人類胰臟癌細胞株細胞凋亡中扮演相關的角色。本實驗結果顯示咖啡酸苯乙酯有強力的誘導人類胰臟癌細胞株細胞凋亡的活性，細胞死亡的同時也伴隨著粒腺體膜電位的減少及caspase的活化。
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馬兜鈴酸是一種來自馬兜鈴科(Aristolochiaceae)的生物鹼，已被證實有致癌性，且長期使用下將造成腎衰竭。最近的研究報告指出馬兜鈴酸可以抑制由蛇毒所引起的水腫現象、抗發炎，且有抑制血小板的活性的功效。然而，馬兜鈴酸在血小板上的藥理學功效尚未明確，因此我們有意探討馬兜鈴酸在血小板活化過程中，對於訊息傳遞方面的抑制機轉。由本研究結果顯示，馬兜鈴酸隨著濃度的增加(75-150 micro?molar)，能有效地抑制collagen (1 micro?gram/ml)所引起的人類血小板凝集反應以及ATP釋放反應；且馬兜鈴酸(115和150 ?micro?molar)可以抑制由collagen所刺激細胞內鈣離子的流動、phosphoinositide的增加和thromboxane A2的形成。此外，馬兜鈴酸(115和150 ?micro?molar)可以增加細胞內nitrate的含量及vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)的磷酸化。對於血小板內47 kDa蛋白質磷酸化，這是一個標記protein kinase C活性的方法。在本實驗中我們分別使用collagen (1 micro?gram/ml)和PDBu (150 nano molar)促進血小板47 kDa蛋白質磷酸化，發現馬兜鈴酸只能抑制由collagen所活化47 kDa蛋白質磷酸化。另外，馬兜鈴酸(115和150 ?micro?molar)可以抑制由collagen (10 micro?gram/ml)所引起p38 MAPK的磷酸化反應但不能清除由collagen (1 micro?gram/ml)刺激血小板所導致的自由基。 由結果證實，馬兜鈴酸抑制血小板活性的作用可能涉及下列路徑：(一)馬兜鈴酸可以抑制PLC的活性，接著進一步抑制phosphoinositide breakdown、鈣離子的流動、以及47 kDa 蛋白質的磷酸化(二)馬兜鈴酸可經由抑制p38 MAPK磷酸化來調控phospholipase A2的活性而使TXA2的含量減少而抑制血小板的活化。 (三)馬兜鈴酸會影響eNOS的活性，增加血小板細胞內NO的產生，可能進一步影響guanylate cyclase的活性，增加cyclic GMP的含量以誘發VASP磷酸化而抑制血小板的活化
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本研究以SACCHACHITIN（靈芝多醣幾丁質）進行研究，探討其對酪胺酸?活性的影響。由於之前已證實此材料能有效抑制蛋白質水解酵素（如MMP-1，MMP-8，MMP-9）以及脂肪?（Lipase），所以本實驗將進一步探討其抑制酪胺酸?活性之成效。本研究首先探討對抑制蕈酪胺酸? （Mushroom tyrosinase）活性的影響性，結果顯示：2.5 mg/ml的抗壞血酸顯示出非常顯著的抑制作用，在不同來源的幾丁聚醣中，只有SACCHACHITIN呈現劑量依存反應（dose-dependent reaction）其IC50約為17.2 mg/ml。接著在細胞模式下，SACCHACHITIN對B16細胞型態和增生沒有不良影響，不具有細胞毒性。再進行B16細胞黑色素含量的分析，加入誘導劑α-MSH濃度為25 nM所增加的百分比率最高，可以提高3.37倍的黑色素含量。不論在無或有誘導劑之下， SACCHACHITIN均可以減少B16細胞產生黑色素，和降低B16細胞之酪胺酸?活性，呈現劑量依存反應（dose-dependent reaction）。西方點墨法再次確認SACCHACHITIN確實能夠抑制B16細胞中酪胺酸?蛋白質的表現，尤其是當SACCHACHITIN濃度為2 mg/ml時，效果更加顯著，同時且隨著SACCHACHITIN的微粒化，有增進抑制B16細胞中酪胺酸?蛋白質表現的結果。
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精原幹細胞為一群具有多功能潛力的幹原細胞，在適當調控下可以形成成熟的精子或是發展成為個胚層所需之細胞與組織。因此，為了研究早期精子生成作用相關的分子調控機制以及多功能性精原幹細胞發展的潛力，在體外建立不含血清的精原幹細胞培養系統使其可以長期培養及增生或是誘導其分化是所必需的，亦有助於進一步釐清精原幹細胞生長所需之生長因子及其作用機制。 我們成功地利用ICR品系雄性小鼠睪丸中的細胞在體外培養出具有多功能特性的精原幹細胞群落，我們的實驗結果得知在laminin (6.25ng/ml)的coating material及EGF (10ng/ml) +倍Insulin/ transferring–selenium的培養下，這些細胞群落具有專一性且高度表現鹼性磷酸脢的活性及Oct4蛋白，顯現出這些細胞群落具有精原幹細胞的潛力。我們利用反轉錄聚合?連鎖反應以及細胞螢光免疫染色來鑑定精原幹細胞進一步專一性表現的基因及蛋白質，我們發現在mRNA層次上，細胞群落專一地表現精原幹細胞所特有的相關基因，包括Oct4, Mvh, Fragilis, Stella, Dazl, Tex14, Piwil2等但不表現c-kit及Gcnf (Oct4的抑制者)；在蛋白質層次上，則表現Oct4, SSEA1, CD29, CD49f等，但不表現CD117 (c-kit), CD30, CD34。 此外，我們利用EGFP-lentivirus感染這些具精原幹細胞潛力的細胞群落來追蹤，再使用細胞移植後以檢驗細胞的功能性，結果顯示我們成功地將精原幹細胞移植至原本未能正常進行精子生成作用的睪丸中，並且有明顯的螢光表現。我們的實驗結果證實，於本實驗室之未含血清的體外細胞培養模式，可以成功地培養處於早期精原幹細胞(c-kit negative)的細胞群落。
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Propofol是一種被廣泛使用的靜脈麻醉藥物，由於其具有短效且起始作用迅速的特性，因而常被用於全身麻醉之誘導與維持以及加護病房病患的鎮靜安眠。在加護病房中，嚴重的敗血症以及敗血性休克是最主要的致死原因。Nitric oxide (NO)是許多重要生理功能所必須的，但是過量的NO則被認為是敗血症中導致組織傷害的重要因子。本實驗的主要目的是探討propofol對受到脂磷壁酸(lipoteichoic acid; LTA)活化之巨噬細胞產生NO的影響與其作用機轉。 將巨噬細胞以25、50及75 ?M的propofol或1、5、10、20、50及75 ?g/ml的LTA處理後發現，細胞的存活率與對照組相比並無明顯差異。將細胞以100 μM的propofol、10 μg/ml的LTA處理，或以100 μM的propofol與10 μg/ml的LTA同時處理巨噬細胞，會造成明顯的細胞毒性。接著以不同濃度的LTA刺激巨噬細胞，結果發現，NO的產生與LTA的濃度成正比。再將LTA與不同濃度的propofol同時處理細胞，發現propofol可以抑制由LTA所誘導的NO產生，而且抑制的效果與propofol的濃度成正比。為了探討propofol對NO生成的抑制機轉，所以接下來觀察iNOS 蛋白與mRNA的表現。免疫轉印分析的結果顯示，propofol可以抑制因LTA誘導所造成的iNOS蛋白增加，而反轉錄?連鎖反應分析的結果顯示，propofol可以減低LTA刺激造成的iNOS mRNA上升。為瞭解propofol抑制LTA誘導導致iNOS表現的機轉，接著觀察轉錄因子nuclear factor-κB (NF-κB)的變化。免疫轉印分析的結果顯示，propofol可以降低LTA誘導的NF-κB活化，而且propofol對於dominant negative mutant inhibitor κB所造成NF-κB轉位至細胞核的抑制作用有加成的效果。進一步探討轉錄因子NF-κB上游inhibitor κB kinase與extracellular signal-regulated kinase1/2的改變，結果發現，propofol可以抑制LTA刺激產生的inhibitor κB kinase與extracellular signal-regulated kinase1/2活化。以上結果顯示，臨床濃度的propofol可以抑制巨噬細胞因LTA誘導所產生的NO，此抑制作用與propofol降低iNOS蛋白及mRNA的表現有關。而對於iNOS表現的抑制作用，與propofol降低轉錄因子NF-κB的活化，以及propofol抑制NF-κB上游inhibitor κB kinase及extracellular signal-regulated kinase1/2的磷酸化有關。
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低密度脂蛋白(low density lipoprotein; LDL)容易被氧化形成氧化態低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein; oxLDL)。oxLDL會造成組織和細胞的損傷。Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1(LOX-1)是一種細胞膜蛋白，且為內皮細胞最主要的oxLDL受體，負責將oxLDL胞飲(endocytosis)入細胞，並對細胞產生毒性。腦血管內皮細胞(cerebral endothelial cells; CECs)為血腦障壁(blood brain barrier; BBB)主要組成之一。在CECs中，LOX-1基因的表現量會被誘導，但是其中調控的機制卻還不清楚，因此本研究主要探討oxLDL誘導CECs中LOX-1基因表現之訊息傳遞路徑。 本實驗室先前的研究結果顯示，oxLDL會導致CECs凋亡，因此我們首先探討LOX-1是否在此凋亡反應中扮演重要的角色。利用LOX-1 siRNA達到knockdown的效果，並以顯微鏡觀察細胞形態和利用流式細胞儀評估凋亡細胞所佔的比例，發現LOX-1 siRNA有效的抑制了oxLDL所導致的細胞凋亡反應，顯示了LOX-1可能參與調控此凋亡反應。接續以RT-PCR和real-time PCR分析腦血管內皮細胞中LOX-1 mRNA，發現oxLDL的確會誘導LOX-1基因表現，並且有時間與濃度效應。 在訊息傳遞路徑探討上，於先前研究中發現oxLDL會造成CECs中活性氧分子(reactive oxygen species; ROS)上升，而NF-κB 為對氧化還原反應靈敏度高的訊息傳遞轉錄因子(redox sensitive transcription factor)，因此接續利用核質分離的方式分析氧化壓力相關的轉錄因子NF-κB之轉位(translocation)現象，發現CECs經oxLDL處理後，NF-κB轉位入核的量有時間效應的增加，並在3小時達最大轉位量，進ㄧ步以NF-κB 的抑制劑Bay 11-7085進行前處理後，oxLDL誘導LOX-1 mRNA表現的情形會受到抑制，實驗結果顯示oxLDL的確會透過活化NF-κB 誘導LOX-1基因表現。 接著依序往NF-κB 訊息傳遞路徑上游探討，以免疫轉漬法測定oxLDL對CECs中protein kinases的磷酸化情形，結果顯示CECs經oxLDL處理後，IKK磷酸化會在30分鐘時增加，ERK1/2磷酸化的增加出現於15分鐘，而MEK1/2磷酸化增加出現在5分鐘，Raf的磷酸化則在1分鐘後開始增加，以免疫沉澱的方式也可看到活化態Ras的增加。再進ㄧ步利用LOX-1 siRNA方式探討LOX-1受體在oxLDL誘導LOX-1基因表現之訊息傳遞路徑中所扮演的角色，實驗證實LOX-1 siRNA有效的抑制了oxLDL對LOX-1基因的誘導，同樣的oxLDL所引發的NF-κB轉位現象以及Raf磷酸化也會受到抑制。 研究結果顯示，oxLDL的確會透過LOX-1受體導致CECs產生細胞凋亡反應，並經由LOX-1受體活化細胞內Ras/Raf/MEK/ERK的訊息傳遞路徑，進而磷酸化蛋白激?IKK導致轉錄因子NF-κB 的轉位入核的量增加，使得LOX-1基因表現量的增加。
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冬蟲夏草為真菌中珍貴的藥用真菌，屬於子囊菌亞門，核菌綱，球殼菌目，麥角菌科，蟲草屬。於蟲草屬(Cordyceps)中又有282種。其中蛹蟲草(Cordyceps militaris)為本屬之代表種，並於1950年中發現蟲草素(cordycepin)，並曾利用在抗腫瘤的治療。近年又將蟲草素利用於抗病毒的研究也發現有其價值。故本論文希望藉由育種的技術，找到具有高產量蟲草素的品系。為找出含有高產量的品系，並了解蛹蟲草的交配型態，期能首先將子座上產生的有性孢子收集。使用PDA(Potato Dextrose Agar)分別進行單一孢子培養，發現外觀菌絲的顏色可分為三類,鮮黃色,淡黃色及白色。也觀察到其生長的情形似乎也與菌絲的顏色有關聯性，其中白色生長速度最慢，鮮黃色最快。從子座上取下的菌絲生長速度最快。經玻片培養並以HCl-Giemsa stain後觀察細胞核的型態,從染色的型態學上觀察並無法區分，觀察到均為單一的細胞核。過去研究子囊菌均無法由交配反應判斷性別因子。本論文使用流式細胞儀，單染Propidium Iodide (PI) 以及Acridine Orange(AO)藉由DNA含量不同，來確定單倍體或是二倍體；再經由不同單孢的交配，收集交配的菌絲，使用流式細胞儀分析是否成為二倍體，另外使用鏈鎖聚合?反應，經由放大MAT基因確定性別的控制因子為2個基因，分別為MAT1-1-1及MAT1-2-1。因此證明了C. militaris為heterothallism的性別遺傳模式。C. militaris液態培養中蟲草素的含量，經層液相色層分析法(TLC)分析，結果顯示菌液中確實有蟲草素的成分。並發現在不同的天數產生蟲草素的產量有差異，進ㄧ步使用High Performance Liquid Chromatography (HPLC)分析菌液中蟲草素的差異，顯示單性菌株蟲草素之產量高於交配後之兩性菌株，因此，在選種上可採用單子囊孢子菌株，進行篩選。
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沙門氏菌中的第一型線毛 (type 1 fimbriae) 的表現常會有相變化 (phase variation)的情形。也就是說，個別的細菌會在線毛表現相 (fimbriated phase) 及線毛不表現相 (non-fimbriated phase) 之間，會形成的細菌族群包含了兩種不同相的細菌。而在前人的研究中，只知S. Typhimurium生長於靜態液態培養基時，絕大多數的細菌會產生type 1 fimbriae。反之，當培養於固態培養基時，絕大多數的細菌則不產生fimbriae。 目前對於線毛相變化的機制並未有詳盡深入地探討研究。本研究主要以transposon嵌插入S. Typhimurium LB5010菌體DNA中，以建立嵌插突變菌株資料庫。自10,000個菌落中，挑選出2,400個單一菌落，並以酵母菌凝集試驗及甘露糖凝集試驗篩選出37株突變株。而其中有25株突變株，不論那種培養環境均會表現type 1 fimbriae。11株突變株均不會表現type 1 fimbriae。而有1株突變株以agar的培養環境會有type 1 fimbriae的表現情形，但若以broth培養則不會有type 1 fimbriae。南方墨點法 (Southern hybridization) 偵測突變株中是否含有單一kanamycin cassette的DNA片段，結果其中僅有30株突變株為單一DNA片段。接下來定序後分析29株突變株的資料，初步得知S. Typhimurium的第一型線毛調控表現，除了fim gene cluster外，還會受到其他的基因的影響，如與fimbrial biosynthesis、metabolism、membrane-associated protein、enzyme、putative cytoplasmic protein、putative protein、globular regulator等七類有關的基因，進而調控線毛phase on/off的表現情形。回復試驗及後續的研究正持續進行中。
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中文摘要 關鍵詞： 肝癌 Hepatocellular carcinoma (HCC) 樹突細胞 Dendritic cell 腫瘤裂解物 Tumor lysate 自體 Autologous 肝癌是臺灣地區癌症死亡原因中的前二名，而目前對於末期的患者仍然沒有經臨床試驗證實有效的治療方法。所以發展新穎的治療來改善生活品質及延長壽命有其必要性。而樹突細胞是目前已知功能最強的抗原呈現細胞，也扮演引發先天性及後天性免疫反應之重要角色。假若能於體外讓樹突細胞在最有利之條件下攝取並處理腫瘤抗原，應該能夠刺激產生或活化對抗腫瘤之殺手T細胞反應，進而抑制腫瘤之生長。 雖然腫瘤疫苗在動物腫瘤模型已經取得了令人興奮的結果，但是 成功的臨床試驗尚不多見，其中因素有腫瘤病人本身的問題，例如免 疫缺陷或病人T細胞信號傳導缺陷或腫瘤逃避生物體的免疫監視。另 外腫瘤疫苗的效價也會受到腫瘤抗原成分的異質性及多樣性所影響 。腫瘤裂解物含有很多的腫瘤抗原，被認為是一個很好的腫瘤抗原來源。本實驗的目地是研究肝癌患者自體周邊血液單核球培養來的樹突細胞，與自體的肝癌細胞裂解物刺激之後，於體外觀察啟動毒殺性T淋巴細胞對抗自體肝癌細胞的能力。腫瘤細胞得自肝癌患者手術後的肝癌組織細胞，另外用自體周邊血液單核球經rhGM-CSF及rhIL-4來培養成未成熟的樹突細胞。之後再將這些細胞與腫瘤裂解物共培養，並用細胞激素來熟成。我們用流式細胞儀來分析腫瘤裂解物刺激後之樹突細胞的成熟度。然後用carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) stain來檢測樹突細胞對混合淋巴細胞的活化與增生。另外用Trypan blue來評估經過樹突細胞活化後的混合淋巴細胞其對肝癌細胞的抑制能力。結果顯示細胞激素可以很明顯地提高CD83的表現量，從15 % 上升到64 % (p < 0.05)，顯示肝癌病人單核球可經適當培養為成熟的樹突細胞。經腫瘤裂解物刺激後之樹突細胞，可以看到刺激自體淋巴細胞增生的能力，但若使用正常淋巴球裂解物來刺激樹突細胞就沒有淋巴細胞增生的效果，顯示此樹突細胞可引發肝癌專一性淋巴球反應。在腫瘤抑制率方面，使用腫瘤裂解物刺激之後的樹突細胞，可以使腫瘤抑制率從2.4 % 上升到73.6 %。若與未經腫瘤裂解物刺激的樹突細胞相比，樹突細胞經過腫瘤裂解物刺激之後會下調DC-SIGN的表現量，但不會影響CD83的表現。我們的結論是自體樹突細胞經自體腫瘤裂解物刺激之後，可以很顯著地活化肝癌專一性淋巴細胞來對抗肝癌細胞。