臺北醫學大學生藥學研究所學位論文
臺北醫學大學,正常發行
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神經膠質瘤在原發性腦瘤中最為常見，其中有三分之二屬惡性。美國每年約有17,000 名被診斷出患有原發性腦瘤，而神經膠質瘤就佔 60 %。根據世界衛生組織分類為高惡性度屬於第三級退化性星狀細胞 (anaplastic astrocytoma, AA) 及第四級多型性神經膠質母細胞瘤 (glioblastoma multiforme, GBM) 最為普遍。腦瘤治療通常以手術切除為主，輔以化學及放射線治療。但腦瘤治療的預後不佳，特別是化學及放射線治療會產生游離自由基，不僅會殺死癌細胞，連正常細胞也會殺死。最近有研究指出，抗氧化劑能提高治療效果、降低副作用並保護正常細胞。天然植物資源豐富種類繁多，據科學證實其具保健並防止癌症在復發之潛力，且多酚具有預防癌症之效果。 本研究共採集 60 種天然植物資源製備成冷凍乾燥甲醇取物，利用人類神經膠質腦瘤細胞屬於第三級的 U-87 MG 與第四期的 GBM 8401 以 MTT 還原能力法來評估萃取物對於神經膠質瘤細胞抑制生長之作用進行篩選。其中以 YY-02 甲醇萃取物抑制率最高，接著再以不同極性之溶劑正己烷、乙酸乙酯、丙酮及甲醇依序進行分離萃取，再評估其總多酚及類黃酮之含量、抗氧化及抗脂質過氧化能力，結果以甲醇再分離萃取的效果最好，並且對此兩種人類惡化神經膠質瘤細胞均具有抑制效果並具有濃度依存性，另由細胞形態及細胞週期分析結果亦發現 YY-02 甲醇分離萃取物之抗腫瘤機制乃經由細胞凋亡之模式造成神經膠質瘤細胞死亡，因此 YY-02 將來可能成為一具有開發潛力的藥物以做為治療神經膠質瘤之新應用。
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中文摘要 蕨素成分（pterosin）為一群結構相近之倍半萜類化合物（sesquiterpene），以1-indanone為基本骨架，種類繁多甚為複雜，廣泛存在於蕨類植物。為了解蕨素成分（pterosin）於蕨類不同品種間之分布情形，本研究選擇二十五件台灣產蕨類植物，應用液相層析串聯式質譜技術（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS），針對蕨類三種特定成分-蕨素A（pterosin A）、蕨素I（pterosin I）、蕨素Z（pterosin Z），建立其快速分析方法，並應用於二十五件蕨類植物之低、中、高極性溶媒分配萃取層之分析，以追蹤該類成分之分布情形。實驗部分使用矽膠鍵結十八碳烷基、粒徑3 μm之層析管柱，以0.25%甲酸-水-氰甲烷混合液為移動相，線性梯度沖提，利用正離子電灑法（positive ion electrospray ionization）之離子化方式。定性分析方面，擇定質子加成離子之母離子（parent ion），進行子代離子掃描分析，所得質譜裂解碎片訊息，建入質譜圖庫。本分析法在多重離子裂解監控（multiple reaction monitoring, MRM）分析模式下，pterosin A、I及Z成分之最低檢出極限可達9.97 ng/mL、7.47 ng/mL及3.60 ng/mL；同日內、異日間測試，其RSD分別小於7.52％及11.95％；檢量線之線性相關係數達0.995以上。各萃取層之成分含量，pterosin A介於1.15至9615.4 μg/g之間，以蕨之二氯甲烷萃取層含量最高；pterosin I介於6.3至10845.5 μg/g之間，以熱帶麟蓋蕨之正己烷萃取層含量最高；pterosin Z介於11.0至15480.2 μg/g之間，以熱帶麟蓋蕨之正己烷萃取層含量最高。此外，也建立了蕨類具有pterosin化合物光譜特徵之特定成分的質荷比訊號分布資料表，可作為研究蕨類pterosin成分之重要參考。本研究利用高效液相層析裝置，結合光二極體陣列檢測器及串聯式質譜儀二種檢測器，應用於蕨類植物結構相近之複雜成分群檢測，具備快速、簡便、靈敏、高專一度之特性。
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本研究主要探討將靈芝廢渣 (L) 以及靈芝廢渣之木黴菌固態發酵物 (F) 混合於雞隻飼料中以提升雞隻非特異性免疫之可行性。一日齡愛拔益加肉雞以小雞飼料餵養一週後，將靈芝廢渣及其發酵物以4%和8%之比例混合於小雞飼料後餵養兩週，於雞隻滿三週齡時抽血測其週邊血吞噬活性以及自然殺手細胞活性，以確認先天性免疫之活性，並取糞便檢體測其腸道菌相，另一組為一日齡愛拔益加肉雞以小雞飼料餵養兩週後，將靈芝廢渣及其發酵物以4%和8%之比例混合於中雞飼料後餵養三週，於雞隻滿五週齡時抽血並取糞便檢體。另於體外試驗中，針對RAW 264.7細胞株進行細胞存活性、一氧化氮產生、與脂多醣之結合力以及吞噬活性試驗，並將靈芝廢渣及其發酵物和LGG乳酸桿菌、比菲德菌及大腸桿菌共同培養，看其對菌落增生之影響。體內實驗結果顯示，在吞噬活性方面，於三週齡時8%添加量之實驗組活性優於僅餵食小雞飼料之控制組，而五週齡時，各實驗組之活性皆優於僅餵食中雞飼料之控制組；自然殺手細胞之活性實驗中，三週齡小雞及五週齡小雞於靈芝廢渣發酵物之添加下皆有較好的自然殺手細胞活性。體內腸道菌相檢測中實驗組可提升雞隻腸道內之益生菌數量，但不影響大腸桿菌數量。而在體外試驗中，靈芝廢渣及其發酵物亦可在不造成巨噬細胞毒性之濃度內 (1 mg/mL以下) 有效活化巨噬細胞產生一氧化氮以及增進吞噬活性，並抑制巨噬細胞和脂多醣結合；靈芝廢渣及其發酵物和益生菌於體外共同培養，亦可促進益生菌增生。由此結果顯示，於雞隻飼料中混入靈芝添加物及其發酵物可提升雞隻之非特異性免疫，且β-glucan含量較高之發酵物於自然殺手細胞之毒殺活性較好，可知靈芝廢渣可開發為提升非特異性免疫之雞隻飼養添加，並可進一步測試是否可以取代抗生素之使用，且可對於提高靈芝廢渣之免疫調節指標成分β-glucan做進一步的研究。
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隨著地球臭氧層的破壞，使得皮膚曝曬在紫外線下的機會增加，導致皮膚提早老化和皮膚癌的發生；在光老化的過程中，基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，簡稱MMPs）扮演了一個重要的角色，本研究藉由抑制 MMP-2 和 MMP-9 的活性，使皮膚細胞外基質（Extracellular matrix，簡稱ECM）不受到 MMP-2 和 MMP-9 的分解而造成皮膚老化。因此，先前本實驗室已將台灣常用的 49 種藥用植物利用 MMP-2 和 MMP-9進行抗光老化的酵素活性篩選，其中以台灣大戟（Euphorbia formosana Hayata）植物抑制 MMP-2 和 MMP-9 的效果為最佳。 將台灣大戟植物利用人類纖維肉瘤細胞（Human fibrosarcoma cell） HT-1080 細胞中的 MMP-2 與 MMP-9 的活性追蹤方式進行成分的分離及純化，並利用化合物之核磁共振與物理數據等光譜數據，共計純化出 38 個化合物，包括：九個 aliphatic 類化合物、九個 triterpenoid 類化合物、六個 diterpenoid 類化合物、三個 steroid 類化合物、二個 phaeophorbide 類化合物、一個 coumarin 類化合物、一個 aromatic 類化合物、一個 norisoprenoid 類化合物、一個 purine alkaloid 類化合物、一個 polyketide 類化合物、一個 polyprenol 類化合物、一個 lignin 類化合物、二個 others 類化合物。上述38個化合物，其中seco-Helioscopinolde (EF12)、3β,7β-Dihydroxy-ent-abieta-8,13-diene-16,12-olide (EF13) 為新化合物。 將純化合物對於 MMP-2 和 MMP-9 作活性篩選，實驗結果發現這些化合物對於 MMP-2 與 MMP-9 的抑制效果不佳，與先前的研究結果活性表現不一致，推測是先前的研究中，利用萃取液直接對 MMP-2 和 MMP-9 作酵素反應，而在本研究中則是利用化合物對 HT-1080 細胞作試藥處理，經由細胞內的訊息調控後，取其細胞外液作 Gelatin Zymography 實驗，分析化合物對 MMP-2 與 MMP-9 的活性表現，因此，針對於 MMP 的抑制作用可能藉由不同的基因表現方式，而造成兩者之間對 MMP-2 與 MMP-9 活性表現的差異，期待未來可藉由不同的化合物調控 MMP 的蛋白表現或酵素活性，期待能開發作為新一代天然的抗光老化產品。
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本研究為尋求抗流行性感冒病毒(H1N1)藥物，進行訶子成分之分離及抗病毒活性測試，追蹤其有效活性成分。研究內容包括：一、化學探討- 由含水丙酮萃取物，經由大孔吸附樹脂、多葡糖聚脂及逆相層析等管柱，分離出 [1] Phenolcarboxylic acid: gallic acid (1), protocatechuic acid (2), chebulic acid (3)。 [2] Glloylglucoses: 1,6-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose (4), 1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose (5), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose (6)。 [3] Galloylshikimic acids: 4-O-galloylshikimic acid (7), 5-O-galloyl shikimic acid (8)。 [4] Ellagitannins: casuariin (9), chebulanin (10), corilagin (11), chebulagic acid (12), chebulinic acid (13), castalagin (14) 等十四個化合物。 二、抗H1N1流感病毒活性MTT測試- [ I ] 藥物及流感病毒同時加入細胞培養測試，以1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose(6)抗病毒活性最優，其細胞存活率為144.5 %，高於ribavirin (105.0 %)的效果，MIC值與正對照組ribavirin同為12.5 μg/ml，其次為chebulinic acid (13), 131.8 % ，MIC值為25 μg/ml。 [ II ] 加入藥物1小時後，再加入流感病毒。 在沒有藥物的保護作用之下，其細胞受病毒感染後，細胞存活率為8.5 %，而1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-?nβ-D-glucopyranose (6), 135.9 % 和chebulinic acid (13), 134.1 %之抗病毒活性最好，其細胞存活率比正對照組ribavirin, 112.6 %高。在細胞存活率的數據顯示，本組實驗之MIC以1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose效果最好為12.5 μg/ml，和ribavirin一樣。[ III ] 加入病毒一小時後，再加入藥物，評估治療效果。在沒有任何藥物的保護作用之下，其細胞受病毒感染後，細胞之存活率為7.9 %，正對照組ribavirin為111.6 %， 而所試驗之化合物中以chebulagic acid (12), 126.9 % 和chebulinic acid (13), 120.7 % 治療性抗病毒作用最好，高於ribavirin的作用，其次1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose(6)和castalagin (14)的細胞存活率分別為109.2 % , 110.8 % ，和ribavirin的效果一致。正對照組ribavirin之MIC為12.5 μg/ml，而以上四個有效化合物之MIC均為25 μg/ml。 結論：(1) 由化學結構與活性相互關係之探討得知，多酚性化合物對流行性感冒病毒(H1N1)之抑制、預防及治療作用，以1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-?nβ-D-glucopyranose (6) 及chebulinic acid (13)呈現最顯著之抗病毒作用。同時，取代之galloyl或chebuloyl等acyl group，總數目之多寡將影響其活性之大小。 (2) 依化學結構分類，小分子之Phenolcarboxylic acid類化合物僅以protocatechuic acid (2)之作用較佳；Glloylglucoses類化合物則以接五個galloyl基之1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose (6) 抗H1N1病毒效果最好；Galloylshikimic acids類之抑制H1N1病毒作用不明顯；Ellagitannins類化合物呈現最佳之抗H1N1作用，但糖基上若有兩個以上之OH基未接取代基時，其作用顯著下降。
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本研究目的為探討蘿藦科(Asclepiadaceae )植物Mondia whitei L.根部甲醇萃取物之活性成分。初期結果顯示甲醇萃取物之正己烷層與水層具降血糖活性；而乙酸乙脂層則具抗血管新生活性。經由各種層析管柱及不同溶媒系統層析後，共有三十四個化合物被分離純化。根據物理數據、核磁共振光譜判定及文獻資料比對後，其結構分別確定為：2-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyde (1)、L-Phenylalanine (2)、Oleanolic acid acetate (3)、Oleanolic acid (4)、Oleanolic aldehyde acetate (5)、Lantanone (6)、β-Amyrin acetate (7)、α-Amyrin acetate (8)、β-Sitosterone (9)、6β-Hydroxystigmast-4-en-3-one (10) 、6β-Hydroxystigmasta-4,22-dien-3-one (11)、β-Sitosterol (12)與 Stigmasterol (13)之混合物、β-Sitosterol-3-O-β-D-glucoside (14)、Palmitic acid (15)、Stearic acid (17)、Linoleic acid (17)及Linolenic acid (18)之混合物、Methyl palmitate (19)及Methyl linoleate (20)之混合物、Uridine (21)、Adenosine (22)、Myo-inositol (23)、Tyrosol (24)、Methyl caffeate (25)、Methyl chlorogenate (26)、Osthole (27)、Bergenin (28)、(+)-Lariciresinol (29)、(+)-Catechin (30)、Quercetin (31)、Rutin (32)、Isoquecetrin (33)、Hyperoside (34)。根據其骨架的不同，分別歸類為胺基酸類：2，三萜類：3∼8，固醇類：9∼14，脂肪酸類：15∼20，核苷酸類：21~22，六碳糖醇類：23，酚類：1, 24~26，香豆素類：27，異香豆素類︰28，木脂素類：29，黃酮類：30~34。繼而利用鼠肌纖維母細胞 (Mouse myoblast cells；C2C12 cells)葡萄糖攝取，評估經純化後之化合物活性，結果顯示由正己烷層分離出之化合物在濃度1 μM下具有促進葡萄糖攝取之活性有化合物3 (117.66 ± 2.41%)、4 (109.47 ± 2.83%)、6 (124.56 ± 3.31%)、7 (108.71 ± 0.85%)、8 (108.38 ± 2.02%)。以 MTT assay進行抑制人類臍靜脈內皮細胞增生來評估抗血管新生作用，結果顯示乙酸乙脂層分離出之化合物在濃度30 μM下具有抑制細胞增生之活性有化合物25 (32.95 ± 2.51%)、31 (80.67 ± 3.43%)。
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大安水蓑衣（Hygrophila pogonocalyx Hayata）為爵床科水蓑衣屬（Hygrophila）多年生水生挺水植物，為台灣特有種，產於台中縣臨海鄉鎮。根據本實驗室先前實驗結果顯示，大安水蓑衣95％乙醇萃取物，具清除自由基的活性（HO•、O2•‾及ABTS•‾，IC50 = 0.78、12.75及 7.94 ug/mL），因其被國際自然及自然資源保育聯盟 (IUCN)，列為瀕臨絕滅級 (endangered )，故本研究將組織培養的大安水蓑衣地上部以 95％ 乙醇萃取，並進行成分分離及其活性探討。經管柱層析分離純化得到十三個化合物，由物理和光譜相關數據解析後，分別為flavones 結構 luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside（1），luteolin 7-O-β- D-glucuronide（2）；flavonols 結構 quercetin（3），isoquercitrin（4），rutin（5），myricetrin（6）；phenylethanoid glycosides 結構 acteoside（7），isoacteoside（8），β-ethoxylacteoside（9）；alkylated glycoside 結構 3-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]oct-1-en-3-ol（10），3-O-[β-L-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]oct-1-en-3-ol（11）；及 steroid 結構 β-sitosterol（12）及 stigmasterol（13），以上十三個化合物均首次由大安水蓑衣中分離得到。此十三個化合物，除化合物 3 及 4 因量少、化合物 12 及 13 因為混合物未測試外，化合物1、2、5 ~ 11 進行神經生長因子分化的 PC12 細胞活性篩選試驗，在細胞存活率測試中，於100 μM 濃度下，發現九種化合物的細胞存活率皆大於 85%，進一步進行以六-羥基多巴胺誘導神經生長因子分化的 PC12 細胞毒性模式，結果顯示化合物 luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside（1）具最佳細胞保護活性。十三個化合物，除化合物 12 及 13 因為混合物未測試外，化合物 1 ~ 11 進行人類黑色素細胞內酪氨酸酵素活性試驗，在細胞存活率測試中，於100 μM 濃度下，發現十一種化合物的細胞存活率皆大於 85%，進一步對人類黑色素細胞內酪氨酸抑制活性測試，結果顯示化合物 acteoside（7） 具有較佳抑制酪氨酸酵素活性效果。
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葡萄科植物是具清熱效果的藥材，一般民間用法為消炎、治療肝病或搗敷治癰腫。本論文以市面常見的六種葡萄科植物做抗氧化及人類乳癌細胞株MCF-7毒殺試驗為主。 在利用不同溶媒萃取葡萄科植物評估抗乳癌細胞株MCF-7毒殺試驗和抗氧化試驗中，其包含清除DPPH自由基、螯合亞鐵離子、抑制超氧陰離子之生成、還原三價鐵離子能力測定及抗肝脂質過氧化等幾項。在清除DPPH自由基方面結果顯示，用乙醇及50%乙醇萃取的葡萄科植物具有不錯效用，其中50%乙醇萃取細本山葡萄(枝)在還原能力測定及螯合亞鐵離子實驗中皆達到50%以上的抑制率。至於抑制超氧陰離子之生成方面47個樣品則都無明顯效用。本研究整體來看，利用50%乙醇萃取的葡萄科植物在抗氧化方面都比用其他溶媒更有效用。在抗氧化實驗中：細本山葡萄及烏蘝莓在螯合亞鐵離子的能力中效用分別有達到70%及60%以上。清除DPPH自由基試驗中翼莖葡萄最有效，清除率高達95%以上。抗肝脂質過氧化試驗中以廣東山葡萄最好，其抑制率有95%以上。白蘝對於抗氧化雖然無特別效用，但在人類乳癌細胞株MCF-7毒殺試驗上有很好的成效其抑制細胞生長率為95%以上。在全部實驗方面，山葡萄及烏蘝莓的葉部位都具有很好的抗氧化能力及毒殺乳癌細胞株功效；山葡萄的葉在MCF-7細胞毒殺試驗中的抑制率為82%。本論文希望藉由六種葡萄科植物的抗氧化能力來達到預防癌症發生及治療乳癌的輔助藥材。
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以三種不同培養基篩選出143株海洋細菌株，經醱酵培養後，萃取液初步以抑制一氧化氮合成酶 (NOS) 的活性與利用Phenylephrine誘發大鼠 (Sprague-Dawley Rat) 胸主動脈收縮活性平台進行篩選出具有抑制血管收縮的菌株。結果自143株海洋菌株萃取液中發現二株對於RAW 264.7細胞具有細胞毒性，分別為 Streptomyces sp. (#HYC21) 和 Pseudoalteromonas sp. (#HYC13)，另一株 Pseudomonas aeruginosa (#M1B) 則具有抑制血管收縮的活性，後續針對這三株具有生物活性的菌株以PPY、PY和PYG 培養基分批擴大培養，進行一系列的分析、分離、純化與構造解析，計分離、決定出二十一個化合物，包括：二個環肽類抗生素 (cyclic peptide antibiotics) 的actinomycin X2 (1)、actinomycin D (2)；二個多溴酚類抗生素 (polybrominated phenolic antibiotics) 的 pentabromopseudilin (8) 和3,3′,5,5′-tetrabromo-2,2′-biphenyldiol (9)；三個膽酸及其類似物 (cholic acid and its analogs) 的cholic acid (10)、deoxycholic acid (11)、glycocholic acid (12)；五個喹啉生物鹼 (quinoline alkaloid) 分別為2- heptylquinol-4-one (13)、2-heptyl-3-hydroxyquinolin-4(1H)-one (14)、2-(1′E-nonenyl)quinol-4-one (15)、2-nonylquinol-4-one (16)、 3-heptyl-3-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-2,4-dione (17)；二個酚類化合物 (phenolics) 的2-(2-hydroxyphenyl)-2-thiazoline-4-methanol (18)、4,4′-isopropylidenebisphenol (19)；一個吩嗪生物鹼 (phenazine alkaloid) phenazine-1-carboxamide (21) 及五個環化雙胺基酸 (diketopiperazine) 分別為cyclo-L-Pro-L-Val (3)、cyclo-L-Pro-L-Ile (4)、cyclo-L-Pro-L-Leu (5)、cyclo-D-Pro-L-Phe (6)、cyclo-L-Pro-L-Phe (7)、cyclo-L-Pro-L-Trp (20)。此外，由M1B所分離得到的化合物在生物活性及作用機制，刻正持續探究中。
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本研究利用抑制一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxide synthase, iNOS) 來篩選34株單離自本土的真菌，藉以找尋出具有抗發炎活性的真菌株，發現其中13株真菌的醱酵培養液或菌絲體萃取物，對於離體RAW264.7細胞產生一氧化氮具有顯著的抑制作用。後續選定其中兩株包括：Psathyrella velutina (#96110901) 及Neosartorya sp. (#325) 進行其活性成分研究，再選擇以麥芽抽取物為培養基加以擴大培養後，針對醱酵液及菌絲所含代謝物進行一系列的分析、分離、純化與結構解析，計分離出10個化合物，分別為：psathyrone (1)、5-hydroxymethylfurfural (2)、bis-2,5-hydroxymethylfuran (3) 2-(4-hydroxy-2-octyl-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)acrylic acid (6)、2-(4-hydroxy-2-octyl-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)acrylic acid methyl ester (7)、maltol (8)、succinic acid (9) 和fumaric acid (10)，以及一混合物含 (22E,24S)-24-methylnorcholesta-5,7,22-trien-3β-ol (4) 和 (22E,24R)-24-methylnorcholesta-5,7,22-trien-3β-ol (5)(1：1)，其中psathyrone (1) 是過去未曾報導過的新化合物，化合物6和7則是首次由自然界中分離得到之天然物。天然物純質進一步進行抑制iNOS試驗，結果顯示化合物6和7對於離體RAW264.7細胞產生一氧化氮具有顯著的抑制作用，其半抑制濃度 (IC50) 分別為12.17 ± 1.49和11.36 ± 0.97 μM。