臺北醫學大學醫學檢驗暨生物技術學系所學位論文
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論文摘要 粒線體基因中D-loop的高度變異區之分析 研究所名稱:台北醫學大學生物醫學技術研究所 研究生姓名: 羅梅真 畢業時間: 92 學年度第 2 學期 指導教授: 李宏謨 台北醫學大學 教授 曾嶔元 馬偕醫院 病理科主任 台北醫學大學 兼任副教授 粒線體DNA是細胞內獨立於核染色體外的DNA分子。相較於核染色體DNA，它具有母系遺傳，呈環狀結構，拷貝份數多，及變異性大等特點。因此適合族群演化及刑事法醫鑑識。過去的研究發現粒線體DNA在控制區，即D環上有較高的變異率，D環的長度約1.4 Kb，其上有高變異區（hypervariable region）呈現叢集現象。這些叢集區共分為HVR-I, HVR-II, HVR-III（高度變異區I, II, III）。在許多報告中其叢集的起始點及終止點不同。本實驗的研究計劃即是定義高變異（hypervariable region）區的區間。利用族群基因變異統計計算出HVR-I之起點與終點為nucleotide position (np) 16051-16362其鑑別率最好。基因歧異度(allelic diversity) h =0.992。HVRII之起點與終點為np 52-309CC其鑑別率最好，h =0.983。HVR-III的h值為 0.864，而且我們也算出HVR-IV的h值為0.614。 當D環上有單點異質點 (Heteroplasmy)存在時，尤其在親屬鑑定上容易產生爭議。因此本研究想知道若有異質點存在時其親屬相似度（likelihood ratio）數值如何？我們想要建立一個可信賴的數值,以判定當粒線體DNA 在一個群體中有一點核苷酸不一樣時,其可能為親屬之關係。由公式計算出本實驗中的一個家族（外婆、媽媽、兩個女兒、一個兒子），他們在np 204存在異質點，其likelihood ratio為1.78×105。。我們在外婆及二女兒的DNA序列看不出來具有異質點存在，事實上經由dHPLC 證明他們都是異質點。因此我們可以計算親屬相似度及dHPLC來輔助法醫鑑定工
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高壓氧治療可促進血管新生，進而加速和缺氧相關的傷口癒合，而血管內皮細胞生長因子 (VEGF) 及其接受器系統無論在生理或病理性的血管新生都是最主要的調控者。然而高壓氧調控血管內皮細胞活化的機制尚未明瞭。本實驗即是在探討高壓氧活化血管內皮細胞生長所扮演的角色及其可能的調控機制。我們由Real-time PCR及北方墨點分析數據證實，高壓氧可誘發血管內皮細胞生長因子基因的表現，並於4小時達到最高峰，且高壓氧所誘發VEGF mRNA的表現可被MEK的抑制劑PD98059及JNK的抑制劑SP600125所抑制。另一方面，西方墨點分析法顯示，VEGF蛋白最大表現量在8小時，ERK1/2的磷酸化則在15分鐘最強。此外，VEGF 的promoter上有hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) 和Activator protein-1 (AP-1) 轉錄因子的結合位，由electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 結果顯示，高壓氧處理1小時可明顯活化此二轉錄因子，且其DNA-protein的結合能力皆會被PD98059及SP600125所抑制。因此推測高壓氧可能是透過JNK-mitogenic-activated protein kinase及ERK-mitogenic-activated protein kinase 的訊息傳遞路徑，活化HIF-1和AP-1轉錄因子而啟動VEGF基因的表現，進而促進血管的新生。
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三氧化二砷目前用於治療前骨髓性白血病，會造成癌細胞凋亡，而達到治療之效果。在我們的研究顯示由單核球誘導樹突細胞產生過程中加入三氧化二砷，會抑制c-Rel、NF-κBp50 表現，進而調控樹突細胞的訊息傳遞，降低樹突細胞CD86之表現、降低樹突細胞IL-12p70、IL-1β、IL-10之分泌量、降低刺激異體淋巴球增殖之能力、降低刺激異體naïve T 細胞細胞內IFN-γ表現量及降低樹突細胞引起Th1/Th2之能力。根據此結果顯示三氧化二砷會在體外影響由單核球誘導產生之樹突細胞的功能，可能因此降低體內免疫功能。
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在數位參與台灣國家衛生院免疫治療法 ( Immunotherapy ) 之癌症末期病人中，有一位病人獲得顯著的緩解。本研究乃針對該免疫療法成功之肺癌末期患者案例，利用蛋白質體學配合西方墨點法來探測免疫療法引發的體液免疫所產生之特異性抗體的可能抗原。 我們以患者在接受免疫法治療前與治療77天後所採得之血清做為免疫前及免疫後抗體，以A549腺肺癌細胞株培養後萃取細胞蛋白質做為癌細胞抗原，經過2D-SDS-PAGE蛋白質分析後，以西方墨點法研究肺癌患者治療前、治療後所產生的抗體在識別A549腺肺癌細胞所萃取之細胞蛋白質有何不同。我們發現肺癌患者在治療77天後所獲之恢復期血清可辨識四個A549腺肺癌細胞萃取液之特殊蛋白質點，經過一連串蛋白質塊切割，膠內酵素切割萃取蛋白質成分，再經高效能MALDI-TOF質譜儀分析，透過NCBI蛋白質資料庫比對得知此四個蛋白質點分別是β-actin 、 Human Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 (IFIT-2) 、 keratin與Wnt-8a等四個蛋白質。 本研究之結果顯示經進一步研究後，這四個蛋白質將可能當作新的癌症生物指標，亦可嘗試發展成為癌症疫苗之用。
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論文摘要 戴奧辛抑制脂多醣體所誘導人類Astrocytoma U373 MG 細胞株之介白質素-6的釋放 張慧文 指導教授:楊沂淵 博士 環境污染對免疫系統的影響已被廣泛的研究且一直是引起爭論的話題，因此許多科學家對戴奧辛 (dioxin) 的研究深感興趣。戴奧辛的產生主要來自物質製造過程中使用含氯的石碳酸﹐或將含氯的化學物燃燒所產生。戴奧辛被懷疑對中樞神經發育會有不好的影響。而神經膠細胞在中樞神經的重要性是參與神經細胞損傷及修復。許多的研究證實，發炎反應通常參與許多神經性退化性疾病的病理過程。愛滋病、痴呆、阿滋海默症等神經病變疾病會使得腦脊髓液和腦中IL-6 (interleukin-6) 量增加。在本篇研究中，我們探討TCDD (2,3.7.8-Tetrachlorodibenzo -p-dioxin) 對人類神經膠細胞 (U373 MG cells) 產生IL-6細胞激素的影響。首先，以酵素免疫 (ELISA) 方法測量分析TCDD對人類Astrocytoma U373 MG細胞IL-6的釋放並不影響，但會抑制LPS (Lipopolysaccharide) 所誘導U373 MG細胞IL-6之釋放。因此，利用分析MTT、LDH試驗顯示，TCDD的作用並不會減少U373 MG細胞生存率。再者，藉由細胞化學免疫染色法及西方墨點法發現TCDD對U373 MG細胞中的ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) 並無顯著的影響。此外，藉由RT-PCR進一步探討TCDD作用於老鼠大腦皮質之AhR、ARNT、IL-1β和IL-6 mRNA表現的影響。實驗結果顯示TCDD會抑制AhR、IL-1β和IL-6 mRNA的表現。但TCDD在老鼠腦脊髓液中會誘導IL-6的表現。這些結果顯示TCDD曝露在不同的組織會造成不同的結果。無疑地，TCDD對體內的影響是多變且複雜，或許牽涉到許多細胞類型和細胞激素間的相互作用。
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慢性腎衰竭病人 (chronic renal failure, CRF)的淋巴球、單核球及嗜中性白血球有細胞凋亡增加之現象。細胞凋亡(apoptosis)的發生會經由不同的因素刺激引起，如 DNA損傷、尿毒毒素、氧化壓力及細胞激素等等的刺激，這些病人免疫功能較一般人差且較容易受到感染，CRF病人免疫功能不良與細胞激素分泌不平衡(如 tumor necrosis factor (TNF-α) 及 IL-2)有關。因此，本論文將針對CRF病人中，探討未接受透析之CRF患者(non-dialysis CRF, non-D)，與接受腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)或血液透析 (Hemodialysis, HD) 之末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)病人之單核球，探討尿毒素、透析方式對單核球細胞凋亡標記及細胞激素分泌之影響。本研究分成4組，選擇10位未接受透析治療的ESRD病人, 14位CAPD病人，16位HD治療的病人，並以10位健康自願供血者為對照組，收集單核球用脂多醣 ( lipopolysaccharide, LPS)刺激24小時，利用酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定細胞激素間白素-10 (Interleukin-10, IL-10) 及間白素-18 (Interleukin-18, IL-18)分泌能力，以及用流式細胞細胞儀 (flow cytometry) 分析細胞凋亡標記的變化。實驗結果顯示經LPS刺激後，CAPD 及HD之單核球所分泌的發炎性細胞激素interlukinIL-18較對照組高 (p<0.05)，其抗發炎細胞激素之IL-10分泌量也高於未接受治療之慢性腎衰竭病人 (p<0.05)。HD病人單核球細胞表面CD95蛋白及CD120b蛋白的表現量在HD病人有明顯增加之情況，同樣地，CD36及CD68在HD病人也有表現增加之現象，且Fas 與 TNFR2及凋亡清除蛋白CD68 MFI間呈正相關，顯示在血液透析時單核球的活化和細胞凋亡及細胞激素系統有密切關係。
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唐氏症 ( Down’s syndrome ) 是細胞遺傳學最常發生的染色體變異(chromosomal aberration)。主要變異的形式為第21對染色體多出一條；即為 trisomy 21。目前對於此疾病無論是臨床症狀、細胞遺傳學或分子遺傳學已有很多相關的研究，但是對於染色體為何在生殖細胞有絲分裂 ( mitosis) 或減數分裂 ( meiosis) 階段容易形成trisomy的原因迄今仍未明瞭。最近有研究報告指出氧化性壓力 (oxidative stress) 可能與trisomy的形成有關，並進而在其細胞內產生氧化壓力。而粒線體是細胞內產生自由基的主要胞器，我們推論在唐氏症患者的細胞內其粒線體功能缺陷，可能與唐氏症病患的病程有關。本研究我們針對唐氏症病患羊水細胞內粒線體DNA (mtDNA) 的拷貝數目 (copy number) 、粒線體DNA斷損突變 (mtDNA deletion) 進行研究分析，並進而探討其與氧化性傷害的相關性。我們以PCR方法檢測粒線體DNA發生的斷損突變，發現於病患羊水細胞內常有5335 bp deletion。並以real-time PCR測定粒線體DNA拷貝數。以流式細胞儀測定羊水細胞脂質過氧化物 (lipid peroxide) 含量，並以螢光染劑C11-BODIPY lipid probes檢測過氧化物對唐氏症病患羊水細胞傷害的程度。由實驗結果顯示唐氏症病患羊水細胞粒線體DNA拷貝數較正常人羊水細胞粒線體DNA拷貝數減少至0.9倍，此外也發現以primer pair L8251-H13845檢測細胞內有5335 bp粒線體DNA斷損突變，經DNA序列分析其斷點為核苷酸序列8273-13607，在DNA序列8263-8272及13598-13607具有”CCTATAGCAC”的10個nucleotide長的direct repeat。粒線體的數目減少與粒線體DNA斷損突變是否影響粒線體功能進而促成trisomy cell bio-aging的形成需進一步探討。病患的羊水細胞中氧化傷害的指標物質脂質過氧化物（lipid peroxides）及8-OHdG則較正常人羊水細胞高。我們推測唐氏症病患羊水細胞有較高的oxidative stress導致mtDNA 受損及copy number減少。
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黑殭菌素(Destruxin)是由昆蟲寄生性真菌(entomogenous fungi)之一的黑殭菌(Metarhizium)所分泌出的毒素，在已分離出的三十餘種中，本研究中採用的是Destruxin B(DB)作為抗腫瘤製劑。經發酵後自發酵液中抽取純化後，先以毛細管電泳及質譜儀鑑定其純度，純化出的DB 以Acetonitrile 為溶劑配製。在本實驗中，我們採用DBA/2品系老鼠經methylcholanthrene 所引導出的L5178Y 淋巴癌細胞作反應。分別用in vitro 及in vivo 的模式觀察到DB 對於對腫瘤細胞之生長影響。結果中發現1.29 μM 及2.58 μM 的DB 對腫瘤細胞生長有顯著的抑制作用，當劑量超過5.17 μM 時有毒殺腫瘤細胞的作用。然而相同劑量的DB 對正常脾臟細胞及纖維母細胞株則沒有抑制作用。利用流式細胞儀觀測藥物引發細胞週期停滯於G2/M 時期，並進一步誘使其發生細胞凋亡的現象。此外，也探討了會影響細胞週期行進和調控細胞凋亡的相關蛋白表現，了解到一些DB 作用下L5178Y 細胞的分子機轉。在DB 的刺激下，L5178Y 細胞株的CDK1(cdc2)蛋白表現會降低、p53 蛋白增加、caspase-3 蛋白被活化，使得細胞週期停滯並且會發生細胞凋亡。最後再以DBA/2 品系老鼠作in vivo 試驗，藉由建立攜有L5178Y 淋巴癌細胞的DBA/2 品系小鼠為動物模式，以腹腔注射方式投予DB，觀察到DB 可以延緩小鼠死亡的時間點，證實了其在體內抗癌的效果。本實驗冀望為未來抗癌藥物開展一個新的領域。
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Mouse macrophage inflammatory protein (mMIP) -1α是屬於C-C chemokines的一員，吸引的對象細胞包括巨噬細胞和淋巴球等，進而造成發炎反應；已知MIP-1α的表現能在腫瘤生長處，協同宿主的抗原呈現細胞 (antigen-presenting cells, APCs) 引發具專一性的抗腫瘤細胞毒殺反應；依此特性製作mMIP-1α轉殖的腫瘤細胞疫苗，再結合體外處理的APCs，設計出複合式疫苗，預期對老鼠的腫瘤細胞生長能夠有加強抑制的效果。利用核酸轉殖 (transfection) 的技術，將一個含有mMIP-1α基因的載體送入老鼠的腫瘤細胞，CT26 (BALB/c) 及B16F10 (C57BL/6J) ，並利用酵素聯結免疫吸附分析測試 (ELISA) 篩選出能持續表現mMIP-1α的單株細胞；自老鼠的股骨、脛骨取出骨髓細胞，加入mGM-CSF、mIL-4等細胞激素刺激其中的單核球分化成為樹突細胞 (dendritic cells, DCs)。我們的假設為：先以mMIP-1α轉殖的腫瘤細胞疫苗注射老鼠，使其在注射部位產生發炎反應，隔天再於同一位置注射經體外處理後攜帶有腫瘤抗原的樹突細胞疫苗，預期接受此種複合性疫苗的老鼠更能有效降低或抑制腫瘤細胞的生長，表示mMIP-1α不但能在體內增加週邊DCs浸潤到疫苗注射部位，其所引起的發炎反應也可進一步刺激、活化額外注入的DCs，進一步增強抑制腫瘤生長的免疫反應。 我們的實驗結果顯示，不論是BALB/c或C57BL/6J老鼠，在單獨注射mMIP-1α轉殖的腫瘤細胞疫苗時，對腫瘤細胞的生長都沒有明顯的抑制效果，但是在注射樹突細胞疫苗時，抑制腫瘤生長的效果明顯增強，而在結合兩種疫苗後，發現其效果略勝於單獨注射樹突細胞疫苗；同時我們將兩疫苗注射於同點與不同點的結果相比較，在BALB/c老鼠並沒有看出差異，但在C57BL/6J老鼠的結果發現注射於同一點所產生的抑制能力較強，顯示兩種疫苗之間是有互相加成的效果。結論是，樹突細胞疫苗對腫瘤生長的抑制已經有很好的效果，雖然mMIP-1α轉殖的腫瘤細胞疫苗沒有如預期的結果，但當兩者結合後，仍達到加成的效果；也許未來能以樹突細胞疫苗為主，配合不同條件的mMIP-1α或其他趨化激素轉殖的腫瘤細胞疫苗做研究，期待找出更強的疫苗組合，以達到抑制腫瘤生長的效果。
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戴奧辛(dioxin)因具有高毒性、廣泛性與累積性，已被列為人類確定致癌物。戴奧辛為約210種不同的化合物總稱，主要組成為兩個氧原子聯結一對苯環類化合物，而其結構和荷爾蒙相似，被證明可嚴重影響人體的新陳代謝﹐干擾賀爾蒙的平衡等；而本實驗中使用四氯戴奧辛(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)，則為戴奧辛族群中最具毒性的化合物。有研究顯示，在懷孕婦女長期暴露在戴奧辛過高的環境下，會增加胚胎流產及子宮內胎兒成長遲滯(intrauterine growth retardation)的機率。本實驗探討TCDD對人類胚胎滋養層細胞(trophoblast cells)之細胞生理與粒線體功能的影響進行研究，並進一步探討其造成傷害的訊息機制。在戴奧辛刺激下，以西方墨點法可觀察到人類滋養層細胞缺氧誘發因子-1?(hypoxia inducible factor-1?，HIF-1?)蛋白表現增加，可誘導活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的增加，造成粒線體DNA斷損突變(deletions)增加，我們於經過TCDD處理的胚胎滋養層細胞中偵測到7599bp deletion；並且造成粒線體DNA拷貝數(copy number)減少至52％。此外，代表DNA氧化損傷的分子標記-8-羥基去氧鳥糞嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine)及脂質過氧化物(lipoperoxide)，在TCDD刺激下呈現6.5倍與2.58倍增加的情形，表示TCDD對人類胚胎滋養層細胞產生氧化性傷害，並造成粒線體ATP含量減少。我們發現經TCDD處理後，細胞保持在缺氧狀態及大量ROS產生。以流式細胞技術儀(FACS analysis)分析經Annexin V及PI染色的細胞，則可觀察到當細胞以TCDD 24小時刺激後，增加53%細胞凋亡。我們進一步以西方墨點法分析細胞凋亡蛋白質變化，其結果顯示p53、Bax隨刺激時間的增加，其蛋白表現隨之增加。而Bcl-2蛋白則有蛋白表現減少的趨勢。此外，顯示由TCDD刺激誘發細胞缺氧時，細胞可能會誘導p53蛋白質表現，之後經由Bax蛋白質調控，改變Bcl-2/Bax平衡，而促使細胞凋亡。此外，我們藉由PI3K/Akt抑制劑(wortmannin)的添加處理證實戴奧辛誘導人類滋養層細胞缺氧誘發因子-1??(hypoxia inducible factor-1?，HIF-1?)蛋白表現增加是經由PI3K/Akt pathway，我們也進一步分析其ROS是否參與調控HIF-1?蛋白，當細胞預先處理L-N-acetylcysteine後發現HIF-1?蛋白表現有減少的趨勢，我們更加確認TCDD誘導HIF-1?蛋白表現是經由ROS調控的PI3K/Akt pathway。經由上述實驗結果，我們推論戴奧辛經由引發人類滋養層細胞產生大量ROS造成氧化性傷害，粒線體功能缺損，增加細胞凋亡。我們亦證實當人類滋養層細胞在TCDD刺激處理後增加了2.67倍細胞侵入能力。此外，缺氧亦被認為與胎盤發育不全，組織缺氧，缺少血液供應有關。綜合以上實驗結果，我們推論由TCDD處理引發的缺氧及ROS大量產生可能是造成胎兒死亡的主要因素。