高雄醫學大學醫學研究所學位論文
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許多關於神經肌肉結合點(neuromuscular junction，簡稱NMJ)的研究是利用細胞培養模式進行，最常見的模式是以NG108-15神經細胞與離體肌肉細胞或肌肉細胞株進行共同培養，但NG108-15為神經細胞瘤(neuroblastoma)與膠細胞(glial cell)雜交後所產生的細胞株，同時兼具兩者的特性，若欲研究單獨神經細胞特性對神經肌肉結合點發育的影響，使用NG108-15將無法排除膠細胞特性參與其中的可能影響，因此本論文使用純粹的神經細胞株(Neuro-2A)與肌胚細胞株(G-8)做共同培養(coculture)。此模式的建立，可提供更為有效的實驗模式，以探討神經細胞在沒有膠細胞存在之情況下參與NMJ形成的機轉。 NMJ形成的過程中，肌纖維膜上乙醯膽鹼受器(acetylcholine receptor, AChR)聚集是一典型的早期現象，而一氧化氮(nitric oxide, NO)會參與AChR聚集的過程已被許多研究證實，因此本實驗在建立Neuro-2A與G-8細胞共養(cell coculture)系統後，分別在不同的培養時間加入一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的抑制劑L-NAME，評估在細胞共養不同階段，NO產量受抑制後對於AChR聚集的影響，以觀察NO參與突觸形成過程的時間流程，並可證實新的神經-肌肉細胞共養模式成功建立。 實驗結果顯示，以帶有螢光的α-bungarotoxin標定AChR時，可偵測到與Neuro-2A神經細胞共養的G-8肌管上有AChR的聚集形成，並且隨著共同培養時間增加，具有AChR聚集之肌管數量也會隨著增加。雙重螢光染色結果也發現Neuro-2A的神經突起會延伸中止在G-8肌管表面，並且該位置的肌膜上會有明顯的AChR聚集形成。至於NOS抑制劑的影響方面，將L-NAME分別在細胞共養24小時與72小時後加入培養盤內，再觀察其後不同天數時AChR聚集之影響。結果於細胞共養24小時後的突觸形成早期時，抑制NOS對 AChR聚集無顯著影響，但在共養72小時後，亦即AChR聚集量將達高峰前加入L-NAME，則具有AChR聚集之肌管數量會顯著性大幅減少，此現象顯示AChR在初期只形成面積較小的斑塊狀聚集，此時對NO需並不大；而在稍晚時，小斑塊開始集結形成大面積的AChR聚集，此步驟即需要NO之參與。因此本實驗証實當Neuro-2A細胞引發G-8肌管AChR聚集時，NO的參與可促使大面積AChR聚集的形成，此過程應涉及細胞骨骼蛋白複合物D/UGC（dystrophin/utrophin glycoprotein complex）與較小的AChR聚集間的互相聯結，進而造成較大型的聚集出現。
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越來越多的證據顯示，自由基在人類許多疾病的發生、發展中有著十分重要的角色。現代醫學發現癌症的發生與自由基的侵襲有很直接的關係，因此，如何預防免於受到自由基的傷害是一項重要課題。本研究的目的在於評估香椿(Toona sinensis)與乳漿蛋白濃縮物(whey protein concentrate)對於過氧化氫引起肺癌及乳癌細胞株氧化性傷害之影響。在本研究中，以人類肺癌及乳癌細胞株當作實驗的材料，分別以不同濃度過氧化氫及不同時間作用，評估細胞存活率，求得50 % 細胞死亡(lethal concentration 50 %，LC50 )之過氧化氫作用濃度與作用時間，作為後續過氧化氫引起氧化傷害之作用模式。之後利用此模式，分別評估香椿與乳漿濃縮蛋白對於過氧化氫引起癌細胞株氧化性傷害的影響。先將肺癌及乳癌細胞株培養於不同濃度的香椿與乳漿濃縮蛋白的培養基24小時，再個別給予30 mM/15 mM 過氧化氫溶液，作用2小時後，觀察其細胞存活率(cell viability)之變化、細胞毒性(cytotoxicity)、超氧陰離子歧化脢(superoxide dismutase，以下簡稱SOD)與穀胱甘肽還原脢(glutathine reductase，以下簡稱GRx)抗氧化酵素之活性變化、抗氧化物榖胱甘肽濃度(glutathione，以下簡稱GSH)、羰基化蛋白質(protein carbonyl)以及丙酮醛產物(malondialdehyde，以下簡稱MDA)的產量變化的情形。結果顯示:對肺癌細胞而言，給予0.01和0.05 mg/mL香椿與1和10 mg/mL乳漿蛋白濃縮物，可加強過氧化氫引起之氧化傷害，使細胞存活率下降，細胞毒性、protein carbonyl及MDA的產量增加，促使GRx活性增加，但SOD活性與GSH濃度則下降；對乳癌細胞而言，給予0.01和0.05 mg/mL香椿與10 mg/mL乳漿蛋白濃縮物，可加強過氧化氫引起之氧化傷害，使細胞密度下降，細胞毒性及MDA的產量增加，促使SOD與GRx活性及GSH濃度增加，減低羰基化蛋白質的產量。但當給予1 mg/mL乳漿蛋白濃縮物下，則會降低GSH濃度及GRx的活性。 歸納以上研究結果，我們建立一個過氧化氫作用的體外評估模式，並發現給予香椿與乳漿蛋白濃縮物，伴隨過氧化氫引起之氧化傷害時，皆會加強肺癌與乳癌細胞株的毒殺作用，但藉由抗氧化酵素活性及抗氧化物之測定結果，推測二細胞株本身之抗氧化物含量不同而對於香椿與乳漿蛋白濃縮物具有不同的反應機制。
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摘要 雄鼠視前區性別差異性神經核大於雌鼠約七倍。造成此核區差異的原因為初生期間雄鼠神經元凋亡數目比雌鼠少。本實驗室最近的研究結果指出雄鼠NMDA受器表現量較多在保護神經元免於凋亡扮演重要的角色。NMDA受器活化導致大量鈣離子進入細胞並間接活化轉錄因子如NFκB及CREB，這些轉錄因子調控凋亡有關的基因。本論文主要釐清生理性活化NMDA受器可能參與保護神經元免於凋亡的訊息傳遞路徑。以suppression subtractive hybridization (SSH) 及RT-PCR 證實將NMDA受器阻斷之後表現受影響的基因；以Western blot analysis比較正常雌、雄鼠及MK-801處理雌、雄鼠之間Bcl-2蛋白質表現量；以electro-mobility shift assay (EMSA)分析NFκB及CREB的DNA結合活性。結果顯示：（1）SSH後篩選出NMDA受器阻斷之後表現被抑制的基因包括促神經生長的基因（neurotrophic genes）如RBM3, alpha-tubulin及凋亡相關基因（apoptosis-related genes）如Bcl-2, cytochrome oxidase subunit II, cytochrome oxidase subunit III；（2）RT-PCR結果亦證實上述基因在MK-801處理雄鼠表現量少於正常雄鼠；（3）雄鼠Bcl-2 mRNA及蛋白質表現量在MK-801處理之後皆顯著減少；（4）正常雄鼠NFκB的DNA結合活性顯著大於雌鼠、MK-801處理雄鼠及MK-801處理雌鼠；（5）CREB的DNA結合活性正常雌、雄鼠及MK-801處理雌、雄鼠之間並無顯著差異。這些結果顯示性別發育過程NMDA受器活化可能調控基因參與神經元的生長及/或抗凋亡；且NFκB活化並turn on它的目標基因Bcl-2可能是保護神經細胞免於凋亡重要的訊息傳遞路徑之一。其他基因參與NMDA受器調控的性別發育過程的角色須進一步釐清。
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中文摘要 蟹足腫是人類常見的疾病之一，是一種過度增生的疤痕組織，患者於創傷後，癒合的傷口超過原本皮膚的高度及傷口範圍，侵犯到周圍的正常組織。治療上相當困難，以傳統治療（手術及病灶內類固醇注射），復發率高達百分之五十。本病的制病機轉仍未明，細胞外成纖維細胞對細胞激素的反應及其下游的訊息傳遞基質膠原蛋白聚積可能為重要原因。 乙型轉型生長因子（TGF-β）可促進成纖維細胞的移行、增殖和膠原蛋白的製造，在許多慢性纖維化疾病當中，佔有相當重要的角色。 TGF-β主要相關的細胞內訊息傳導物質為Smads蛋白質，分為活化型轉錄因子Smad2、Smad3 和一般型轉錄因子Smad4及抑制型轉錄因子Smad6、Smad7。本實驗利用正常與蟹足腫成纖維細胞株施以各種濃度組合之TGF-β1投與方式，期望能找出其細胞內訊息傳遞及蛋白質的釋出之差異。 研究結果顯示正常成纖維細胞株之Smad2、Smad3、Smad4的表現沒有明顯的增加，而Smad6、Smad7有明顯增加。而蟹足腫成纖維細胞株的Smad2的表現有明顯的增加，Smad3、Smad4的表現沒有明顯的增加，Smad6、Smad7則沒有表現。綜合以上結果顯示乙型轉型生長因子對正常成纖維細胞株的作用是經由增加抑制型轉錄因子Smad6、Smad7來抑制活化型轉錄因子Smad2、Smad3，使之表現正常；而乙型轉型生長因子對蟹足腫成纖維細胞株而言，則是不經抑制型轉錄因子Smad6、Smad7的抑制調控，直接刺激活化型轉錄因子Smad2表現增加，故推測蟹足腫病變可能透過此一訊息傳遞之表現而增加細胞外基質蛋白的合成與堆積。
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中 文 摘 要 目前台灣，因社會結構的轉變，人力需求及推向國際化等因素，促使來台之外籍人士，包括勞工、教師、家庭看護工及新娘等日益增加。依行政院衛生署2000年公佈之統計分析，來台的外籍人士接受10種的健康檢查共發現13,424人不合格，其中「腸內寄生蟲檢查」這一項，有12,353人不合格，佔不合格者的92.02﹪，是所有檢查項目中最高的。 基於此，本研究針對1997至2001年間，至高雄醫學大學附設醫院作「身體健康檢查」之外籍人士寄生蟲檢查結果，依其國籍、性別、年齡及職業，加以分析探討。 本研究共檢查4,445件來自17個國家外籍人士的糞便檢體及血液抹片。血液抹片檢查結果，未發現任何寄生蟲之感染。糞便檢查結果，感染寄生蟲的有420件，陽性率為9.44﹪（420/4,445）。依寄生蟲的種類，有蠕蟲類9種和原蟲類7種，蠕蟲類中以鉤蟲（Hookworm）和鞭蟲（Trichuris trichiura）的陽性率較高，其陽性率分別為1.84﹪（81/4,445）及1.68﹪（75/4,445）。而原蟲類中陽性率較高者為人芽囊原蟲（Blastocystis hominis）1.19﹪（53/4,445）和哈氏阿米巴（Entameba hartmani）1.15﹪（51/4,445）。就國籍而言，以來自柬埔寨、越南和印尼這三個國家的陽性率較高。就性別而言，其中女性檢體陽性率11.40﹪（312/2,738）顯著高於男性檢體陽性率6.33﹪（180/1,707）（p<0.005）。就年齡而言，以19歲以下及60歲以上的檢體陽性率較高，但以20至29歲的檢體陽性數最多。就職業而言，以外籍新娘檢體陽性率15.3﹪（216/1,414）為最高。 痢疾阿米巴是法定傳染病之一，14件陽性檢體中，7件是來自外籍新娘和家庭看護工，她們深入家庭的生活，將會危及其照護與共同生活中的家人，值得有關單位注意，在防疫上，應有其因應對策。
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過度的乙醇攝取，可能導致傷害細胞的自由基及活性氧量增加，進而造成人體多方面組織或器官的傷害，而抗氧化物則可減緩此種氧化性傷害之影響。本研究的目的即為評估褪黑激素與乳漿蛋白濃縮物對於乙醇引起嗜鉻細胞瘤細胞株（PC12 cell line）氧化性傷害的影響。褪黑激素，為一種由動物腦部松果腺體產生的荷爾蒙，除了本身特有的調節生理時鐘之功能外，同時，具有直接捕獲自由基與促進細胞抗氧化酵素產生的能力；至於乳漿蛋白濃縮物則具有提升細胞產生自由基掃除劑-- 麩胱甘肽的能力。麩胱甘肽具有中和活性氧與自由基的能力，進而可調節細胞的免疫力，並可輔助抗癌藥物的治療效果。在本研究中，我們採用一株類似神經細胞的老鼠嗜鉻細胞瘤細胞株為研究材料，分別利用不同濃度乙醇及不同作用時間，以細胞存活率為評估方法，求得造成50 % 細胞死亡之乙醇濃度及作用時間，建立一個急性乙醇作用的體外評估模式。接著我們應用此模式，再分別評估褪黑激素與乳漿蛋白濃縮物對於急性乙醇造成PC12 細胞株氧化性傷害的影響。評估方法為：細胞存活率的變化、乙醇造成細胞毒性、抗氧化物麩胱甘肽的產量、抗氧化酵素如超氧陰離子歧化酶、麩胱甘肽還原酶的活性變化及羰基化蛋白質產生之情形。實驗方式如下：我們先將細胞株置於含有不同濃度的褪黑激素與乳漿蛋白濃縮物的培養基中培養24小時，之後再給予150 mM乙醇，作用4小時後，觀察其變化。結果如下：（一）褪黑激素之影響：結果顯示10μM以上的褪黑激素，對於PC12 細胞株於急性乙醇作用下，可提升其細胞存活率、降低乙醇造成的細胞毒性及促進細胞產生麩胱甘肽；而在抗氧化酵素分析方面，褪黑激素濃度的提高對於超氧陰離子歧化酶活性，並無顯著性差異。但在有乙醇之組別中，給予PC12 細胞株1000μM的褪黑激素，與無褪黑激素組比較，其麩胱甘肽還原酶活性呈現下降現象，這或許可反應出高濃度的褪黑激素可中和自由基，所以麩胱甘肽還原酶將氧化態麩胱甘肽還原為麩胱甘肽的需求相對降低；另外針對乙醇造成蛋白質氧化作用的評估，結果顯示適量濃度（約10μM）的褪黑激素可降低PC12 細胞株羰基化蛋白質的濃度。（二）乳漿蛋白濃縮物之影響：結果顯示提高乳漿蛋白濃縮物濃度，在急性乙醇作用之下，並無法提升PC12 細胞株的存活率，但提高乳漿蛋白濃縮物濃度，則有降低乙醇對PC12 細胞株毒性的趨勢；而在麩胱甘肽濃度分析方面，結果顯示，當乳漿蛋白濃縮物濃度提高時，麩胱甘肽濃度皆呈上升現象；而在抗氧化酵素分析方面，高濃度的乳漿蛋白濃縮物，可促使麩胱甘肽還原酶活性上升，這或許是乳漿蛋白濃縮物促進細胞產生麩胱甘肽途徑之一。 綜合研究結果，我們建立一個急性乙醇作用的體外評估模式，同時發現適度的補充褪黑激素與乳漿蛋白濃縮物可以降低PC12 細胞株因急性乙醇作用所造成的氧化性傷害。
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壹, 中文摘要 30名男性精蟲來自20名未曾嚼食檳榔及10名嚼食檳榔的男性.這20名男性除了未曾嚼食檳榔也必須沒有暴露於二手煙的環境.我們所取得的正常男性精蟲利用游上法 (swim-up method)收集活動力較高的精蟲(high motility sperm)來進行體外實驗.加入不同濃度的檳榔素 (arecoline)與尼古丁(nicotine)想分析這兩種物質對精蟲的影響.高活動力的精蟲被分為5個小部分.其中4個部分加入不同濃度的檳榔素或尼古丁,還有一小部分當作是對照組.測量精蟲活動力及精蟲動力學於下列不同的時間點上;0, +1, +2, +3 和+4小時.經過4小時的作用後,精蟲細胞會被溶解抽取其蛋白質,以西方點墨法來探討環氧化酵素第二型的蛋白質表現.檳榔素對精蟲動力學參數如motility, average path velocity, curvilinear velocity, straight-line velocity和 linearity有顯著性的差異.但是在臨床上有嚼食檳榔和未嚼食檳榔的男性,其精蟲動力學參數是沒有統計上的意義.在體外實驗,我們發現檳榔素,而非尼古丁,會刺激環氧化酵素二型蛋白質的產生而且是dose-dependent manner.這是第一篇說明了檳榔素會刺激環氧化酵素二型蛋白質的產生,因而導致精蟲活動及力動力學參數減低的報告,顯示出檳榔素也許會影響男性的生殖系
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本研究主要以黃嘌呤 (xanthines) 為基本骨架，在其相關分子結構上進行化學修飾，合成一系列新型黃嘌呤衍生物 KMUP-1, 3及4，並經由離體組織和細胞培養等實驗模式，來探討其藥理機轉。 之前我們實驗室發表的文獻已間接證實在離體相關實驗中， KMUP-1, 3 及 4 會活化一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase , eNOS)的表現，進而促進一氧化氮(NO, Nitric Oxide)產生以達到血管鬆弛作用。為了確定一氧化氮的釋放是否經由KMUP-1, 3 及 4 活化一氧化氮合成酶的表現,而且NO/cGMP 與血基質氧化酶(heme oxygenase, HO) 系統是互相關連的，因此本實驗推測KMUP-1, 3 及 4可能具有調控血管內皮eNOS、HO-1與HO-2蛋白質表現作用。 本實驗以西方墨點法 (western blot) 證實KMUP-1, 3 及 4可促使人類臍帶內皮細胞一氧化氮合成酶(eNOS) 之表現增加。另一方面也以西方墨點法證實KMUP-1, 3 及 4會增加HO-1與HO-2之蛋白質表現。而KMUP-1, 3 及 4 增加HO-1與HO-2蛋白質的表現會因為前處理L-NAME 100 ?M）與ODQ （guanylyl cyclase inhibitor, 10 ?M）而減弱。 另外，在人類臍帶內皮細胞 (HUVECs)，以放射性免疫分析方法利用 [125I]cGMP 進行分析評估 cGMP 之釋放量，結果發現KMUP-1, 3 及 4 (10-9~10-5 M) 呈現劑量相關性增加細胞內 cGMP 的量。當分別前處理L-NAME (100 ?M), ODQ (10 ?M) 與ZnPPⅨ (Zinc protoporphyrin Ⅸ, 10 ?M) 三十分鐘後，具有意義的抑制KMUP-1, 3 及 4所釋放的cGMP含量。 在人類臍靜脈離體實驗中，以5-Hydroxytryptamine (5-HT, 10 ?M)誘導收縮，KMUP-1, 3 及 4 (10-9~10-5 M) 累積投予均會產生劑量相關性的血管鬆弛作用。當前處理ODQ（10 ??M）之後，血管鬆弛作用則呈現明顯遞減。 基於以上的實驗結果，顯示KMUP-1, 3 及 4 可以調控一氧化氮合成酶 (eNOS) 的表現，增加NO的釋放量造成血管鬆弛效果，因為NO的釋放亦可活化HO-1與HO-2 蛋白質表現。因此，KMUP-1, 3 及 4造成血管鬆弛效果的機轉包括活化eNOS 產生NO ，活化heme oxygenase 產生CO (Carbon monoxide) ，而NO與CO 皆能活化sGC 而促使GTP 轉變成 cGMP而達到血管的鬆弛作用。
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許多證據都指出EBV與SLE之間是密切相關的，然而台灣地區目前仍缺乏有力的資料來加以證實，本研究希冀能夠釐清在台灣地區EBV與SLE是否具有相關性；另外本研究也希望能夠瞭解EBV病毒活動情形是否會影響SLE病程的發展。 利用其周邊血球萃取DNA後，以PCR與南方點墨法檢測EBV DNA存在情形，結果在100名患者中有80位測得EBV DNA的存在，陽性率為80 %，而在200位正常人中則有91位可以測得EBV DNA，陽性率為45.5 % ( OR 4.8，95% CI 2.73-8.42，P < 0.0001 )。 以血清測定抗體方面，在所有67位患者與67位正常人的血清中都未測得有anti-EBV-VCA IgM抗體的存在；在anti-EBV-VCA IgG抗體方面， SLE患者陽性率為98.51 % ( 66 / 67 )，而正常人陽性率則為97.01 % ( 65 / 67 )；另外，anti-EBV-VCA IgA抗體部分，SLE患者呈現陽性反應者為59.70 % ( 40 / 67 )，正常人出現陽性反應則為22.39 % ( 15 / 67 )，OR 5.14，95% CI 2.42-10.91，P < 0.0001；anti-EBV-EA IgA抗體部分患者陽性率為 56.72 % ( 38 / 67 )，而對照組陽性率則為13.43 % ( 9 / 67 )，OR 8.44，95% CI 3.60-19.81，P < 0.0001。 EBV感染可分為三種活動時期，分別為初次感染( primary EBV infection ) (2) 再活化( reactivation ) (3) 潛伏感染( latent EBV infection )，並且在血清學上有不同的表現，利用血清學結果分類後發現，67位SLE患者中，55.22 % 體內EBV處於再活化時期，44.78 %為非再活化時期，而正常人中則只有14.93 % 體內EBV為再活化狀態，85.07 % 皆為非再活化時期 ( OR 9.10, 95% CI 3.77-21.96, P < 0.0001 )。 另外，我們也發現，EBV病毒活動情形與SLE患者病情波動有密切相關，病情持續的患者中，有67.5% 其EBV病毒處於再活化時期，而病情安定的患者則只有38.89% 是處於再活化時期，( OR 3.26, 95% CI 1.03-10.37, P = 0.041 ) 綜合上述的結果，可以發現，在台灣地區，EBV感染與SLE具有十分密切的關係，尤其是EBV再活化與SLE之間，具有更顯著的相關性，另外，EBV再活化與病情持續之亞群兩者間亦存在著有意義的相關性
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[摘要] 背景－高三酸甘油脂血症(Hypertriglyceridemia，HTG)是一種原因複雜的代謝性異常疾病。我們評估環境因子與脂蛋白C-III(apolipoprotien C-III，APOC III) Sst І以及脂蛋白脂解脂(lipoprotein lipase，LPL) Hind III基因多型性對台灣原住民HTG之相關性。 方法－本研究利用橫斷性研究，將250位台灣南部原住民(包括排灣族與阿美族)分為HTG-90人以及NTG-正常TG組當作健康對照。HTG的定義為TG>150mg/dl(NCEP，2001)。研究資料收集是由已訓練之訪員利用結構式問卷。將萃取的DNA，利用聚合鏈反應（ Polymerase Chain Reaction, PCR）分析再以RFLP（restriction fragment length polymorphism）方法分析APOC III(Sst І)以及LPL(Hind III)基因的多型性。 結果－APOC III(Sst І)主要對偶基因(S1)以及稀少對偶基因(S2)，在HTG組的S1和S2對偶基因頻率為66.1﹪和33.9﹪，而在NTG組的S1和S2對偶基因頻率為73.6﹪和26.4﹪(P<0.1)。但是獨立分析女性樣本時，S2對偶基因頻率在HTG組有顯著的偏高(P<0.03)。LPL(Hind III) 對偶基因型，在HTG組的H-和H+對偶基因頻率為15.7﹪和84.3﹪而NTG組的H-和H+對偶基因頻率為21.1﹪和78.9﹪，並無顯著差異。經由多變項邏輯迴歸分析，發現阿美族、嚼檳榔習慣、攝取較多澱粉類食物以及偏高ApoC3含量與HTG之危險性有顯著相關。進一步，我們發現ApoC3含量在不同APOC III基因多型性S1S1、S1S2、S2S2會有劑量效應而增加的趨勢。 結論－本研究的分析結果得知，台灣原住民族群其APOC III(Sst І)基因多型性可能與HTG之危險性有相關。