清華大學化學系所學位論文
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時代快速變遷，科技也日異月新，人們對於科技的依賴也同時造就了新技術的發展。從造紙術的發明、陰極射線管，到平面液晶顯示器 (LCD, Liquid Crystal Display)；從傳統蠟燭、鎢絲燈、日光燈，到發光二極體 (LED, Light Emitting Diode)，在在顯示科技文明的演進。由其在原物料上漲以及環保意識抬頭的現今，人們紛紛投入耗電量低、效率高及低成本的材料研究，有機發光二極體 (Organic Light-Emitting Diode) 即為其中之一。本實驗室也在發光材料研究上，成功開發出一系列高效率以及穩定性高的紅、綠、藍三原色磷光材料，相較常見磷光發光材料所使用的貴重金屬 (如Ir、Os、Pt等)。 在論文第一部分，為針對實驗室之前的研究，探討在銥金屬上三螯合磷配位的反應機構及其延伸的研究；而第二部份，為了調整光色及發光效率，針對銥金屬錯合物上的輔助配位基進行改良，並探討其光物理特性及差異。
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奈米科技於近十年來被廣泛的應用在許多科學領域中；而應用在醫學科學領域上的奈米技術被稱為奈米醫學。結合材料科學、化學與化學生物方面的基礎知識作為操控奈米尺度材料性質的依據，並利用其多元的物理化學特性，我們可將材料應用在癌症治療與臨床診斷上。本篇論文研究主要在合成三種不同的生物可降解奈米載體，包括微脂體 (liposomes)、聚乳酸聚甘醇酸 [poly(lactic－co－glycolic acid), PLGA] 奈米粒子及磷脂質和PLGA高分子混合的複合奈米粒子 (PLGA@Lipid NPs)，並探討其在in vitro及in vivo實驗組中對細胞及生物體的影響。本論文分為三大部份，(1) 以毛細管微胞電動之雷射誘導螢光層析法偵測阿黴素 (doxorubicin, DOX) 在中國倉鼠卵巢癌細胞 (CHO-K1) 內的分布情形：證實微脂體載體可顯著改善藥物傳遞的效率；(2) 發展以光觸發藥物載體進行主動式標記癌症細胞的治療癌症策略；(3) 探討標記有奈米粒子的幹細胞在活體動物中的分化情形。 第一部份的研究目的為監測以liposomal form及free form DOX被傳遞到細胞後之胞內分布情形。DOX為一種廣泛使用的蒽環類 (anthracycline) 抗癌藥物，可有效抑制許多惡性腫瘤的生長，如卵巢癌及乳腺癌等。不論是free form或經由載體裝載 (例如liposomal form) 的DOX進入癌細胞後皆可引發癌細胞的死亡。DOX毒殺癌細胞的作用機制被認為是與細胞核中DNA的複製有關，DOX抑制可解開雙股螺旋DNA的拓撲酶II (topoisomerase II) 的活性，使DNA無法順利進行複製而抑制了癌細胞的增生。DOX雖具有毒殺癌細胞的效果，但在治療的過程中常發現DOX藥物本身或其相關代謝物具有損害心臟與肝臟的毒性；此外，也發現治療過程中癌細胞可對DOX或其代謝物產生抗藥性。Liposomal DOX已被証實能降低被網狀內皮系統 (reticuloendothelial system, RES) 吞噬，並延長其在血液中的循環時間，因此具有減緩毒性副作用的產生。本研究發展一套毛細管電泳微胞電動層析/雷射誘導螢光法 (Micellar electrokinetic chromatography－Laser induced fluorescence, MEKC－LIF) 來分析生化樣品中DOX的含量。以10 mM硼酸鹽緩衝溶液 (borate buffer) 內含100 mM 陰離子型界面活性劑 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) (pH = 9.3) 為遷移溶液(migration buffer)可有效率的分析樣品中的DOX。該系統對DOX的偵測範圍為11.3 ~ 725 ng/mL，定量極限 (the limit of quantitation, LOQ) 為43.1 ng/mL (S/N=10) ，偵測極限 (limit of detection, LOD) 為6.36 ng/mL (S/N=3) 。以此方法為基準，我們嘗試討論以25 µM的free DOX與liposomal DOX治療CHO-K1細胞後，DOX在細胞內的分布情形。被作用細胞在療程結束後以低張滲透及機械剪力的方式被打碎，再以不同離心力將細胞碎片分為三部分 ( < 1400 g vs. 1400~14000g vs. >1400g)，分別為富含細胞核部份 (< 1400 g)、富含胞器部份 (如粒腺體、溶酶體等) (1400~14000g) 及細胞質部份 (>1400g)。由liposomal form及free form的組別可觀察到DOX累積在細胞中達最大量的時間分別為6 h及12 h；這個定量的結果表示liposome可改善DOX被傳遞到細胞的能力。本研究成功的結合液相-液相萃取法 (liquid-liquid extraction method) 與MEKC－LIF，並應用於監測細胞內DOX的量分布；該系統亦可作為研究蒽環類抗癌藥物細胞毒性的研究。 第二部份研究的目標主要為解決現今化療過程中，投予藥物之理想劑量問題。一般說來，低劑量化療藥物對於抑制腫瘤生長的效果差；而高劑量卻容易造成病人難以負擔的毒性與副作用。本篇研究設計了一個新的抗癌藥物載體，主要為提高抗癌藥物在特定位置所累積的有效治療濃度。這裡採用了二個策略來完這個這目標：(1) 建構出可觸發 (stimuli-responsive)的藥物傳遞系統用來控制藥物的釋放；(2) 設計可進行主動的標靶傳遞系統。結合以上二個策略，將可降低傳統藥物的使用量，並促進藥物的治療效率。『主動式標靶』癌細胞需要使用特定的配體 [包括單株抗體、多肽及適體 (aptamer) ] 以辨認並結合癌細胞上特定的蛋白質標記分子或過度表現的表面抗原；本研究則選擇使用癌細胞表面過度表現的葉酸受器 (folate receptor, FR) 作為腫瘤標記物。我們製備表面攜帶葉酸分子的磷脂質/PLGA高分子複合奈米粒子 (folate/PLGA@Lipid NPs) 並以共價鍵修飾光敏感性的o-nitrobenzyl group (ONB) 於葉酸分子的-及-carboxylate groups上。藉光驅動觸發奈米載體表面的葉酸分子活化，進行主動式的標靶傳遞。本研究是首例將2-nitrobenzylamine (NBA) 修飾在生物可降解性奈米粒子 (folate/PLGA@Lipid NPs)上，並藉由光照觸發NBA分子的裂解，使folate分子回復原本可辨認葉酸受器的活性，續進行主動式標靶作用及持續性的藥物釋放。實驗之初，我們先將光敏感性的caged分子NBA及光觸發策略示範於表面具葉酸分子的13 nm 金奈米粒子 (folate/Au NPs) 系統上，並藉由光照証實其可回復folate分子的生物活性。接著我們製備裝載Taxol抗癌藥物的生物降解性脂質高分子混合的奈米粒子 (PLGA@Lipid NPs) 並在其表面修飾葉酸及NBA分子 (caged folate/PLGA@Lipid containing Taxol) ，以驗証光驅動藥物傳遞系統的概念。在細胞存活率實驗中，人類口腔癌細胞KB cell (FR-positive) 與裝載抗癌藥物Taxol (約21 ng) 的caged folate/PLGA@Lipid NPs共培養12小時後，移至4 oC下以汞燈曝照20分鐘以驅使 NBA之光解，讓葉酸分子恢復可以辨識葉酸受體的活性，細胞存活率降至51%，此結果足以驗証光觸發標靶的概念。本實驗的對照組則是於KB cells中施加21 ng的free Taxol (細胞存活率高達89%)。 第三部份的研究主要為探討奈米粒子是否會影響幹細胞在活體中的分化狀況。幹細胞已經被証實具治療神經退化性疾病、缺血及受損組織的潛力，為新興的細胞治療策略。運用成大化學系CS Yeh教授的團隊所發展的奈米沉澱法 (nanoprecipitation method)，在本實驗中，我們製備100 nm、且表面無穩定劑修飾的PLGA@QD655奈米粒子。在過去已發表的in vitro研究中已證實PLGA@QD655可標記間葉幹細胞 (mesenchymal stem cell, MSC)；若以高濃度的奈米粒子與細胞共培養長達四週後，並未觀察到明顯細胞毒性。此外，PLGA@QD655不會改變 MSCs的與生俱來的分化能力，他們仍然可以正常分化為脂肪細胞 (adipocyte)、骨細胞 (osteocyte) 及軟骨細胞 (chondrocyte)。而本研究中，我們深入探討已標記奈米粒子的間質幹細胞在進入動物體後，是否仍具有幹細胞的分化能力？實驗結果證實，我們可以成功地將PLGA@QD655標記在eGFP-MSCs上，並將標記後的eGFP-MSCs植入裸鼠皮下組織；且於四週之後以組織螢光染色法及IVIS螢光系統觀察MSCs的分化情形，所獲結果指出在活體老鼠中被標記PLGA@QD655奈米粒子的MSCs，其分化能力無顯著變化。
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本論文主要利用水熱法及綠色深共熔熔劑的離子熱法來合成12 個化合物。所有化合物的鑑定方式都是以單晶X 光繞射儀收集數據後進行結構解析，並以粉末X 光繞射圖譜比對理論圖譜確定樣品純度後，進行後續的性質測量。這些化合物依不同的金屬中心、不同骨架或光學等性質分為A, B, C 三個系統： 系統A 的主題是純三價釩亞磷酸鹽 (A1-A3)，在合成上首度使用四價硫酸釩 搭配相同的有機模板：環狀有機胺cyclohexylamine 以生成純三價釩化合物。其 中A1 具有互相交錯的二維超大環16R 隧洞，溶劑可填充體積高達45%；而進入骨架結構的硼，在化合物失去部分配位水時，扮演了穩定結構的重要角色，因此可以使A1 單純透過脫水，來達到罕見的固態氧化還原性質。在A1 反應物中，額外導入ZnO 可得到A2 雙層(double layer)結構，是首度發現的鋅釩雙金屬亞磷酸鹽；另一方面以Ga2O3 取代ZnO 來反應，則可得到稀有的掌性結構A3。 系統B 包含了具非中心對稱結構與光學性質的六個化合物(B1-B6)：B1 是純錫(II)亞磷酸鹽，具強的二次倍頻訊號，可自身放出白光；B2 是摻雜Mn2+的錫亞磷酸鹽，與B1 等結構，然較B1 具有更高的白光量子效率。B3 與B4 都具有中性的鋅亞磷酸草酸骨架，是兩個同分異構的多形體(polymorph)，有Sn2+摻雜在其中，具特殊的一維階梯形薄板結構，雖二者結構相似度高，但放光卻大不相同。接著我們首度使用蔗糖做為起始反應物來導引出兩個超大環20R 鋅亞磷酸鹽結構B5 與B6，各為非中心對稱20R 與掌性20R 結構的首例。 在系統 C 中，使用不同長度的直碳鏈單胺，來得到三個化合物(C1-C3)：C1是40R 雙金屬鎵鋅亞磷酸鹽，因摻雜了Mn2+而可自發性放出白光，且Mn2+的位置可被清楚定出；C2 則是鎵亞磷酸鹽mesolamellar 結構，有接近3 nm 的層間距； C3 可視為是C1 結構的擴張，將環數擴增至驚人的64R。系統C 的價值在於能利用特定形式的有機模板，來達成孔徑大小與結構連結的可預測性與可控制性。此外，具有如此大的層間距及環數，卻還能獲得單晶來解出結構更是前所未有的重要突破。 綜合以上，本論文在策略性的實驗設計下開發了三個系統，這些化合物不論是在結構上或性質上都能有創新的表現，且後續仍有很多值得繼續往深處挖掘的潛力存在。
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時間是由許多齒輪組裝而成的，有許多時代的齒輪改變了世界也改變了你我的日常生活，人類的科技每分每秒都在進步，在這當中，有機發光二極體 (organic light-emitting diode, OLED) 是目前光電產業中，正在蓬勃發展的新穎前瞻技術，不管是上游先進材料之開發或者下游尖端元件之研製，在近二十年間，一直都是學術與企業界相繼進入的目標，近幾年來，顯示器與照明設備的應用市場更是許多國際知名廠商兵家必爭之地；所以開發出高效率、長時間穩定且低成本的紅、綠及藍色發光材料，將是這個領域中非常關鍵的重點項目。有鑑於此，許多的研究團隊都投注很多心力在發光材料研發領域上，其中又以第三列過渡金屬 (Os(II)、Ir(III) 與 Pt(II) 等) 為金屬中心所合成出來的有機金屬磷光 (phosphorescence) 材料最為重要，因為其在重金屬效應下，可以使磷光放光效率大為提升。 因此，本篇論文主要要探討的是一系列新型磷光材料的合成與應用，我們選擇以第三列過渡金屬─鋨金屬 (Osmium) 當作中心金屬，搭配一系列 N^NH 螯合配位基，再以中性的 diphosphine 當作輔助配位基，成功地合成了一系列具有八面體結構的鋨金屬錯合物；除了錯合物 5 之外，其它錯合物都具備高亮度的放光效率，放光區域則是從綠色到飽和紅色，而這些錯合物結構與吸收/放光光譜的特性，我們也可以經由理論計算方法 (computational approaches) 深入了解。此外，錯合物 1 – 4 以溼式製程 (solution-processed) 成功地製備了一系列 OLEDs 元件，並表現出非常優秀的元件性能，其中外部量子效率 (external quantum efficiency, EQE) 超過 15 %，電流效率 (current efficiency) 高於 48 cd/A，功率效率 (power efficiency) 也大於 50 lm/W，在最後值得一提的是，錯合物 4 是到目前為止，唯一一個以二價鋨金屬為磷光體，適合用來製備高效率綠色 OLED 元件的客體發光材料。 以上結果已發表在 Adv. Funct. Mater., 2012, 22, 3491.
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摘要 在生物系統中的許多蛋白質有其獨特的作用區域，可與特定的分 子結合，而且這些交互作用會決定蛋白質的活性與功能。研究蛋白質 與分子的交互作用有助於了解蛋白質在生物系統中如何發揮其功 能。這些作用的分子(統稱為ligands)包含蛋白、胜肽、核酸、金屬離 子及藥物等等…。本篇論文進行兩個研究案例，分別是蛋白與藥物之 交互作用以及蛋白與胜肽之交互作用。 在研究案例一中，我們從結構上來討論hEGF 與suramin 之交互 作用。人類表皮生長因子(hEGF)可促使多種生物細胞(包括腫瘤細胞) 的增生分化，而此生物活性是透過hEGF與細胞膜表面上的特定受體 (hEGFR)結合進而誘導產生一系列訊息傳導所致。Suramin (polysulfonated naphthylurea)作為生長因子阻斷劑，可以抑制非小細胞 肺癌腫瘤細胞(NSCLC，其細胞表面大量表現hEGFR)之細胞增生能 力。我們利用等溫滴定量熱法及核磁共振技術解析hEGF蛋白在生理 條件水溶液中的結構並觀測hEGF 與suramin 的交互作用。本篇論文 中提出的hEGF 水溶液結構與已發表之2:2 EGF–EGFR 複合物中的 hEGF 結構在C 端有明顯不同，未和hEGFR 複合之hEGF 水溶液結 構在C端形成一個疏水性基團。由這樣的構型差異推論：當hEGF與 hEGFR結合，hEGF本身會產生構型變化，解開其C端的疏水性基團 以利於受體之結合。有趣的是，根據我們解出的hEGF-suramin 複合 體結構，suramin 正好也是結合在hEGF 的C 端(Arg45 周圍)，可以 保護C端的疏水性基團，因而阻斷了hEGF和hEGFR的結合。 在研究案例二中，我們解出了HB-EGF-CT和mBAG-1-UBH的複 合物結構並討論兩者間的結合區域。BCL2-associated athanogene 1 (BAG-1)是一個重要的調節蛋白，可與多種抑制細胞凋亡相關之訊息 分子結合。老鼠BAG-1 的ubiquitin 類似區域(簡稱mBAG-1-UBH)由 97 個胺基酸所組成，已被證實可與proHB-EGF存在細胞質中的尾端 (簡稱HB-EGF-CT)交互作用，且此作用具有重要的生物意義 (即為兩 蛋白對細胞存活的協同作用)。本篇論文中，我們對mBAG-1-UBH和 HB-EGF-CT 進行主鏈和支鏈上各原子的化學位移判定並且進行結構 計算。我們利用等溫滴定量熱法及二維、三維核磁共振技術(1H-15N HSQC滴定和13C-filter NOESY)來決定此交互作用之結合強度以及結 構上的結合區域。HB-EGF-CT在mBAG-1-UBH結構上的結合位置位 於其C 端及12 之間的轉折區域。HB-EGF-CT 摺疊成環狀結構(不 具任何二級結構)，用兩端(N和C端)來和mBAG-1-UBH 作用。兩蛋 白間的作用力包含疏水性、正負電荷及靜電作用力。
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第一章節： 線型多苯環分子因其於有機薄膜電晶體中具有良好的效率，一直都受到科學家的重視。因此我們利用鉑以及釕金屬催化合成三個不同系列的的線型多苯環分子，並量測以及探討其光學以及電化學性質，研究發現其分子隨著共軛苯環數的增加其 Band gap 也跟著下降。並利用變溫 NMR 觀察其苯環間扭曲的現象。 第二章節： 第一部份：結合實驗室所建立DBC分子以及線形多芳香環碳氫化合物的合成策略，我們合成了三個不同系列以 Dibenzo[g,p]chrysenes (DBC)分子為核心架構，並於不同的位置延長其共軛的苯環單元的Cata-condensed polyaromatic hydrocarbons， 並探討其光化學以及電化學性質與分子的扭曲度以及芳香度的關係。 第二部份：以相同合成策略，我們也嘗試了使用鉑以及釕金屬錯合物催化環化反應，合成以 Triphenylene 為核心的 Cata-condensed PAHs，但其反應選擇性不如預期，伴隨著副產物的生成。 第三章節： 第一部份：我們利用DDQ促進Scholl反應，可將第二章所建立一系列 Cata-ondensed PAHs上的 Fjord region 進行環化反應，合成具有低Clar sextet 的盤狀多芳香環碳氫化合物，也研究了 Clar sextet 所在的位置與電化學以及光化學性質上的關係。 第二部份：我們沿用第二章節所使用的合成策略，使用 PtCl2 催化Bis(biaryl)diynes 進行兩次成環反應，接著同樣以DDQ來促進 Scholl 反應合成一系列大型的盤狀PAHs化合物且同樣具有較少的 Clar sextets，使分子上的 π 電子共軛效率更加，可有效率的降低此類化合物的Energy gap。 第四章節： 最後一章節我們嘗試於平面多芳香環碳氫化合物 Dibenzo[de, op]bisanthracene (DBBA)上的 Interior 碳原子進行化學反應，但測試了許多不同的條件皆無法證明反應可發生於中心的 sp2 碳原子上，實驗中我們也發現了許多特別的反應，於 DBBA 分子上具有不錯的位向選擇性，例如 Friedal-craft 反應、Nucleophilic addition、Epoxidation以及分子間的 Scholl 反應。
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本論文的研究是著重於發展醣體功能化的奈米粒子(nanoparticle, NP)以及細胞專一標的、生物影像和癌症治療等多方面運用之研究。表達在HepG2細胞表面的去唾液酸醣蛋白接受器 (Asialo-glycoprotein receptor，ASGP-R)可以專一性識別非還原末端(non-reducing end)含有半乳糖 (galactose)或乙醯胺基半乳糖 (N-acetyl-galactoseamine，GalNAc)的醣體(glycans)，因此選擇ASGP-R作為標的蛋白質接受器(receptor)進行研究。不同奈米載體如磁性奈米粒子、二氧化矽奈米粒子和孔洞材料奈米粒子表面裝配具有專一標的配位基(ligand)-其為三價體半乳糖。此三價體半乳糖分子同時也裝配到多價體(dendrimer)分子(dendritic glyco-borane, DGB)結構體上去發展中子捕獲抗癌試劑。我們利用以奈米粒子(NP)或是樹狀體(dendrimer)當作良好的多價載體(multivalent carrier)，結合有機合成方式，使奈米粒子表面或是分子裝配三價半乳糖，再經由受質引導的吞噬作用(receptor- mediated endocytosis)專一性的標的HepG2肝癌細胞。在此篇研究中，所有的奈米粒子表面皆有修飾螢光基團(Cyanine 3, Cy3)，螢光基團的修飾是經由不同的化學競爭反應，使奈米粒子表面除了裝配螢光團之外，奈米粒子仍可修飾幾乎相同表面高濃度的配位基-半乳糖。 利用化學共價鍵結的方式在磁性奈米粒子表面同時修飾具有不同比例的螢光團和半乳糖衍生物，用以發展多功能HepG2細胞專一標的之試劑。經由實驗證實，半乳糖衍生物修飾之磁性奈米粒子可以經由受質引導的吞噬作用專一地進入HepG2細胞，並且T-Gal-s-Cy3@MNP被此細胞吞噬的最多，同時我們發現，倘若能夠在奈米粒子表面修飾之小分子配位基可以調整其空間位向使其配合接受體的空間排列，則可使經由受質引導的吞噬作用發揮到最大。在此處的研究，所有醣體修飾的奈米粒子都不具有毒性，在生物應用上應有很大的潛力。 利用有機合成的方式，合成雙烯架橋分子使其裝配在螢光二氧化矽奈米粒子表面，藉此增加表面可修飾官能基的數量與增加極高反應性，二序列兩次點擊反應包含strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 和 Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition(CuAAC)來建構表面具有抗癌藥物(paclitaxel, PTX)和三價半乳糖體的螢光二氧化矽奈米粒子，此方法中，昂貴的化合物或是不易合成的分子可經由SPAAC的形式裝配到奈米粒子表面，因其反應不須外加任何試劑，更可在反應之後直接回收珍貴之分子，而利用三價半乳糖分子修飾的表面除了可以增加水溶性之外亦可以有專一標的HepG2細胞的功能，此種TGal-PTX@Cy3 SiO2NP奈米碳針表面裝配包含螢光、專一標配位基和抗癌藥物，可以提供第一時間(real-time)細胞專一標的之抗癌藥物細胞毒殺效果。 在硼中子捕獲治療中(BNCT)，必須仰賴傳遞除足夠的10B原子至標的之癌細胞，施予中子至含10B細胞，激發態之不穩定的硼分子隨後放出一定距離的能量，最終死細胞，然而在此領域的研究中，常受限於含硼藥物的毒性、低水溶性與低癌細胞專一性，因此在筆者研究中發展兩種中子捕獲試劑，包含醣體多價體 (dendritic glyco-borane, DGB)和孔洞材料架構之T-Gal-B-Cy3@MSN，DGB多價分子與T-Gal-B-Cy3@MSN皆具有三價半乳糖，可能供水溶性與專一標的性，在DGB的實驗中證實，其為極好的硼中子捕獲試劑，跟美國食品藥物管理局准許的硼中子試劑BSH比較，具有十倍以上的毒殺效果，在孔洞材料架構之T-Gal-B-Cy3@MSN方面，是發展「特洛伊木馬」的策略，孔洞材料具有多孔體積，可置入極大值的含硼藥物 (此處用o-carborane)，平均一個奈米粒子就要含約重量百分之五十的硼原子在其內部，這樣的策略解決孔洞材料當藥物載體之藥物釋放動力學之限制，在表面又修飾三價半乳糖分子，可以提供專一標的HepG2細胞之能力，相信這兩種硼中子捕獲試劑，應在中子捕獲治療上有極大的潛力。
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