清華大學化學系所學位論文
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近年來，磁性奈米粒子成為廣泛應用於生物醫學研究的熱門材料之一，鑒於其高度的粒子總表面積對體積比，可在其表面合成高密度的親和性官能基，以提升分子與分子之間的親和作用力。此外，其獨特的磁性特質可輕易地將分析物從複雜的生物環境進行分離。表面功能化的氧化鐵磁性奈米粒子利用其修飾的親和官能基對標的生物分子具有專一性的辨識，可以應用在特定分子的分離及檢測。在此論文中，將合成不同的表面功能化粒子，進行表面功能基鑑定，並進而應用在不同的生物研究主題，其中包括：(1)基質功能化的磁性奈米粒子應用於小分子及金屬離子的偵測；(2)硼酸修飾凝集素的功能化磁性奈米粒子提高醣蛋白的純化效率。藉由穿透式電子顯微鏡分析，磁性粒子的粒徑及型態約為5到30奈米左右的尺寸。使用超導量子干涉磁量儀(SQUID)鑑定粒子的磁性特質；在粒子表面官能基分析可經由傅立葉轉換紅外線光譜儀(FT-IR)加以進行鑑定。 在論文的第一部分，我們發展一套結合Matrix@MNP和介質輔助雷射脫附離子化質譜(MALDI MS)為技術的分析方法成功地應用在小分子的檢測，在質譜上顯示了增強的分析物訊號強度而沒有基質所引發的雜訊干擾。之中，我們發現表層的矽烷層和氧化鐵的比例影響著基質在粒子表面固化的數量。藉由扣除的方法可以定量出粒子表面所固化的基質總數量。另外，此結合技術進而被發展在做為一個簡單且快速的金屬離子檢測工具，經由精確的分子量及金屬離子其具有的特徵同位素質量分析，可以對多種不同的金屬離子達到精準的鑑定。 不正常表現的醣蛋白往往可以做為診斷疾病的標的分子，至今還沒有一個有效的方法可以全面性的鑑定醣蛋白及其醣基所改變的位置。凝集素親和性探針可以對不同種類的醣蛋白提供專一性的辨認，但其限制是與醣基之間的交互作用力是屬於弱的非共價親和力。在論文第二部分的目的，是將凝集素表面修飾上硼酸官能基(BAD-lectin)，成為一個新混合型材料的醣蛋白探針，經由surface plasmon resonance (SPR)表面薄膜共振分析所得到與單醣修飾的金晶片具有增強的結合能力說明硼酸與醣基的順式二醇基(cis-diol)所形成的硼酸酯(boronate ester)共價性結合來解決凝集素弱親和力的缺點。進而將此混和型探針功能化於磁性奈米粒子(BAD-lectin@MNPs)上並結合質譜技術成功運用在醣蛋白的純化與分析。結果顯示具硼酸修飾的凝集素可達到2到30倍增強的醣蛋白偵測靈敏度。在HeLa細胞的醣蛋白質體研究中，可以鑑定到295條N端鏈結醣胜肽。其中236條N端鏈結醣胜肽(80%)分別由三種不同的BAD-lectin@MNPs所純化出，顯示這些探針的專一性。此也證明了表面修飾的硼酸並沒有使凝集素對不同種類的醣蛋白失去其選擇性，也在醣蛋白質體學上的表現說明此功能化奈米粒子可以做為有效的且具選擇性的醣蛋白檢測工具。 從這些結果說明了四氧化三鐵的磁性奈米粒子的優點，其中包括其具有高度應用性的表面化學可以做為在生物應用上一個通用的載體；獨特的磁性特質可以避免冗長的樣品除鹽及純化動作而造成生物樣品的損壞；具有高靈敏和高專一的表現可以用來解決低親和作用力分子及樣品中低含量分子的偵測問題。在未來方面，我們預期此表面功能化的磁性奈米粒子可以成為一種有效的分析平台來解決生物醫學上重要且具有挑戰性的問題。例如，在小分子和金屬離子的偵測上，DHB@MNP可發展成為另一個有效且直接的工具在真實的生物樣品中提供快速、靈敏、及準確的微量小分子和金屬離子檢測。而在醣蛋白質體的研究中，我們期許BAD-lectin@MNPs可進一步做為快速及全面的醣蛋白分析以應用於在臨床樣品中生物標靶分子的開發。
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細胞膜蛋白質的活性主要受其轉譯後修飾所調控，如位於細胞膜外區域之醣基化修飾扮演著訊息接收的功能，而細胞膜內區域之磷酸化修飾則開啟下游的訊息傳遞路徑。然而，醣基化與磷酸化修飾的膜蛋白體在性質上因具有高疏水性、低化學劑量及質譜分析中較不易游離化而導致的離子抑制效應，和其同時具有相異的修飾型態使得其在蛋白體分析上仍然是一個相當大的挑戰。因此，本研究目的為開發一新穎分析策略，以去醣基化為基礎的圖譜標的法並結合固化金屬親和層析法(IMAC)與同位素標記相對與絕對定量(iTRAQ Labeling)之策略，以期能同時定量分析細胞膜上之醣基化蛋白質體與磷酸化蛋白質體及其修飾位置。 本研究藉由去醣基化胜肽(deglycopeptide)其游離效率較強而易出現於質譜圖中，來幫助鑑定醣基化胜肽(glycopeptide)。此概念首先利用HeLa細胞株來證明其可行性。圖譜依據兩項準則進行篩選:1) 皆具有共同序列(consensus sequence) Asn-Xxx-Ser/Thr而造成胜肽分子量1Da的位移；2) 胜肽去醣基化後，所得訊號強度比例達二倍的增加。值得注意的是，去醣基化後的膜蛋白樣品與原本樣品相比，其胜肽產量約有1.25倍的增加。再者，此分析方法最重要的優勢在於能同時鑑定和定量醣基化胜肽/磷酸化胜肽修飾及他們相對應的蛋白質在不同生物狀態下的表現量。因此，我們進一步將此分析分法結合了固化金屬親和層析法並應用在分析受到細胞白介素第二、五因子(interleukin 2/5)刺激之後的B細胞(BCL-1)其膜蛋白之醣基化與磷酸化修飾的改變。此外，在利用酵素(N-Glycosidase F, PNGase F) 進行去醣基化反應中同時加入了同位素18O標記於胺基酸Asn上，使得醣基化胜肽的鑑定更加可信。而在定量分析上，表現量上差異的醣基化蛋白質與磷酸化蛋白質顯示了許多蛋白質的醣基化與磷酸化參與了B淋巴癌細胞株中的免疫反應及細胞存活等訊息路徑。本研究期望能針對醣基化及磷酸化修飾之膜蛋白體的同步定量分析提供一個新穎的分析策略。 第二部分，本研究利用凝集素表面修飾上硼酸官能基所開發新混合型材料，BAD-lectin，應用於細胞層次的醣蛋白體分析。研究中使用了三種BAD-Lectin@MNPs,，其在醣基化胜肽純化上顯示了良好的專一性。再者，利用不同的質譜儀分析方法，三種BAD-Lectin@MNPs所純化出來之醣基化胜肽皆俱有其不同凝集素之相對應的特性醣鏈分子。我們期望此一新型材料結合質譜分析法能提供為偵測醣分子探針之工具，以利更深入的醣蛋白體分析。
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对人类健康的影响的各种疾病状态了解原子和功能的电平信息的S100蛋白 - 蛋白相互作用形成的大分子复合物，以及在下游的信号级联相关的变化，将是非常宝贵。 S100蛋白特异性的基础定义差分行为，与靶蛋白相互作用仍不清楚。大分子复合物的结构洞察S100蛋白蛋白复合物之间的相互作用较弱的情况下，尤其是在中医药的研究，以确定和选择潜在目标的直接后果。要回答这些重要的问题，我们选择， S100B S100A1和S100A6蛋白属于我的研究工作感兴趣的蛋白质S100蛋白家族。 本论文概述S100A6 - RAGE V域和S100B - FGF2复杂的蛋白质 - 蛋白质相互作用在细胞外空间的结构基础的描述，采用HADDOCK对接方式对接是由两个大分子生物物理信息。结构层次的信息披露在目前的工作都带来了有趣的可能性，这些协会的蛋白质 - 蛋白质复合物的功能后果。 在第1章中，我们简要地描述人类S100A1和S100A1拮抗剂药物研究发展的新兴权益的生物学作用。实质性的差异而得到的氨基酸序列的S100A1不同物种之间的形式形成的基础着手研究人类S100A1谐振分配。的NMR分配信息在本研究报告将是有益的理解的S100A1和它的潜在的拮抗剂的界面功能。 在第2章中，我们将重点放在了解S100A6和RAGE V区的残留层次的互动。生物分子核磁共振技术，利用共振分配的突变C3S人类S100A6和表征其与RAGE V区的互动。进一步结合常数突变S100A6与RAGE V域之间由恒温滴定热量的研究。是用来产生HADDOCK异源S100A6 RAGE突变V区复杂的模型。这项研究提供了结构性洞察S100A6配体识别和结合，从而强调目标RAGE受体的治疗方法的潜在作用。 在第3章中，我们研究非同源的互动S100B与FGF2使用多维核磁共振光谱。我们阐明的界面区域，为S100B FGF2复杂。我们利用计算对接的方法HADDOCK计算S100B FGF2的异源复合基于NMR实验限制。类比推断FGF2停靠S100B四聚体复杂的蛋白质 - 蛋白质接触面和FGF2 -D2域FGFR1互动接口之间，我们推测， S100B蛋白结合位点识别类似的FGF2与FGFR1 D2域。 S100B相关的假说FGFR1抑制FGF2结合位点突变和功能分析研究网站后来被证实。这些结果带来新的视角S100B和FGF2交互的理解，提出一个新颖的角色S100B在FGFR1受体灭活。
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近年來，螢光小分子應用研究逐漸受到科學家們的重視，本實驗室新合成一個螢光小分子-BMVC-12C，相較於正常的纖維母細胞株，若把此小分子與癌細胞混合，會觀察到6-10倍的螢光增強，此外，藉由雷射共軛焦的幫助，我們發現在正常細胞株內，BMVC-12C主要聚集於溶酶體(Lysosome)中，但癌症細胞中，BMVC-12C卻會離開溶酶體，進而聚集在粒線體(Mitochondria)。藉由BMVC-12C的螢光性質與位置的不同，可區分正常與癌症細胞株，並應用BMVC-12C於偵測早期癌症細胞研究上面。研究顯示BMVC-12C能夠針對癌症細胞有毒殺性，且此毒殺性與在粒線體中BMVC-12C的聚集含量有正比關係，若粒線體中的BMVC-12C愈多，則毒殺效果愈好。由於BMVC-12C會聚集與癌症細胞的粒線體中，為研究此小分子對於粒線體的影響，我們發現BMVC-12C會破壞癌症細胞的粒線體功能，進而產生毒殺作用。故BMVC-12C小分子除了可以應用於臨床的癌症細胞偵測外，更有機會成為新一代的抗癌藥物分子。 本研究結果顯示BMVC-12C的毒殺作用與螢光性質，皆會被位於粒線體膜上，抑制通透轉運孔洞的抑制劑-環孢靈(Cyclosporin A, CsA)所影響，此結果暗示BMVC-12C 的作用機制與粒線體上面的通透轉運孔洞有密切關聯性，我們認為BMVC-12C應可穿透此孔洞，進而與粒線體的基質內的DNA作用。由於CD與NMR光譜皆顯示粒線體DNA可能具有G4的四股結構，而我們也利用反轉錄聚合酶(RT-PCR)的實驗，證實BMVC-12C可抑制粒線體DNA的複製。故於此論文中，我們提出一個假設性的作用機制模型，我們認為BMVC-12C針對癌症細胞的抑制機制，是由於BMVC-12C可穩定粒線體DNA上面的G4四股結構，使粒線體DNA的複製作用被抑制，進而導致癌症細胞的死亡。
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本論文以實驗室自行架設之時間解析克爾光閘螢光光譜儀 (time-resolved optical Kerr gating fluorescence spectroscopy) 研究硝基苯酚塩負離子 (nitro- phenolate anion) 三種結構異構物：鄰位硝基苯酚塩負離子 (ortho-nitro- phenolate)、間位硝基苯酚塩負離子 (meta-nitrophenolate)、對位硝基苯酚塩負離子 (para-nitrophenolate)，在鹼性水溶液及乙二醇溶液中之分子內電荷轉移過程。 在靜態光譜中，我們發現吸收光譜與螢光光譜彼此之間皆非鏡像對稱，顯示水溶液及乙二醇溶液中硝基苯酚塩負離子於激發態皆產生結構改變。 而藉由動態光譜，我們發現除了間位硝基苯酚塩負離子乙二醇溶液，其他溶液中硝基苯酚塩負離子皆呈現極快之動態學過程。 理論計算結果中我們發現受光激發後NPPP經由結構扭轉將電子更進一步地往nitro group轉移，且偶極矩亦有增加之趨勢，顯示可能有TICT態 (twisted intra- molecular charge transfer state) 存在。 而掃描各結構能態位能值亦顯示扭轉結構之能量要遠低於FC態 (Frank-Condon state)，其中除了對位硝基苯酚塩負離子以外，其他異構物之扭轉過程中皆無能障存在，亦暗示形成TICT態之結構扭轉過程可能極為快速。 經比對相關文獻及理論計算結果，我們認為鄰位硝基苯酚塩負離子水溶液及乙二醇溶液、間位硝基苯酚塩負離子水溶液中最快之螢光衰減過程 (< 0.1 ps) 為形成TICT態之結構扭轉之過程，藉由扭轉結構將激發態佈居迅速從放光FC態轉移至非放光之扭轉結構能態，次快的螢光衰減過程因缺乏直接證據，我們僅能猜測可能為TICT態之生命期，此一生命期取決於IC、ISC或光化學反應過程。 鄰位硝基苯酚塩負離子乙二醇溶液受限於溶液黏滯力，結構扭轉過程變慢，且有較為明顯之solvation參與螢光衰減過程。 而對位硝基苯酚塩負離子水溶液及乙二醇溶液則因激發態位能曲線存在一能障阻礙結構扭轉過程進行，而在兩種溶液環境中觀察到相近的螢光衰減速率。
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飛行時間式二次離子質譜術使用於工業材料與生醫研究是一個已確立的技術，其所提供的化學資訊如元素和分子離子相當豐富，簡化和解釋二次離子質譜數據對於未來的應用是重要的。基於這個概念，我們提出以飛行時間式二次離子質譜術於大腸桿菌訊號增強、防油紙中防油成分鑑定及早期胃癌診斷之研究。 穩定的膠體奈米粒子如金和銀奈米粒子已經研究在使用於增強二次離子訊號。半導體氧化鋅奈米粒子具有化學和熱穩定之獨特性與寬的能帶(3.37 電子伏特)，促使我們探討使用氧化鋅奈米粒子增強模式生物:大腸桿菌的二次離子訊號的可行性。實驗過程為首先將經過冷凍乾燥後的大腸桿菌菌落上頭沉積氧化鋅奈米粒子，製備完成的試片接著進行飛行時間式二次離子質譜分析(使用鎵一次離子源)，我們評估增強的訊號為質荷比688 (PE C32:1)和質荷比719 (PG C32:1)，皆是來自於脂質膜。初步結果顯示氧化鋅奈米粒子沉積在大腸桿菌可大約增強3倍訊號。 全氟和多氟化合物(簡稱PFCs)是人造化學品並且廣泛用於工業與消費性產品，包括防油紙。由於缺乏了解PFCs組成、毒性和裂解產物，因此需要開發新的分析方法來鑑定PFCs。在此，我們提出使用飛行時間式二次離子質譜術用於快速和便利鑑定防油紙中的PFCs。特徵的碳氟類離子和含磷酸基的碎片離子可使用飛行時間式二次離子質譜(使用鎵一次離子源)做偵測且質荷比可高達800。飛行時間式二次離子質譜圖有助於推論可能的防油劑分子結構為14:2/10:2 S-diPAPs。PFCs厚度藉由使用角度解析X光光電子光譜儀估計小於1奈米，並且從CF3/CF2的強度比值證明CF3官能基優先垂直於並接近防油紙表面。總結這部分研究，飛行時間式二次離子質譜術提供幾乎無樣品製備與快速鑑定PFCs的優點，對於監控新穎的PFCs和其降解產物是重要的分析技術。 代謝體學包含廣泛、同時和有系統性的鑑定生物系統中的小分子內生性代謝物。飛行時間式二次離子質譜成像術有能力偵測胃癌組織中的有機物和無機物分布，具有偵測早期胃癌的潛力，能增加成功處理的機會。在此，我們收集病人的胃組織樣品，其病理分期從早期到晚期為:IA期(病人1),II期(病人2)和IIIA期(病人3和病人4)。飛行時間式二次離子質譜分析(使用25 kV鎵離子,1pA脈衝電流)首先得到500 × 500 微米平方面積的離子影像，再將胃黏膜層經過選區後的影像轉換成離子強度即可做比較。主成分分析結果顯示可區別癌與正常組織。在癌組織統計出低訊號強度的鐵、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、尿酸、硫和碳氮與高訊號強度的丙酸、蘋果酸、檸檬酸和棕櫚酸。本研究進一步探討胃的成癌生理機制發現無機鐵可能與其他9種有機成分無關。
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本論文分成兩個主題進行討論，分別為（一）高導電度無電鍍銅於聚苯胺/PET複合纖維織製備與鑑定，與（二）Polythiophene衍生物之MADLI-TOF 光譜的研究。第一部分中我們先將PET(polyethylene terephthalate)纖維塗布上聚苯胺，利用同步還原取代反應將3-mercaptopropanesulfonic acid反應至聚苯胺上，再進行無電鍍銅反應，鍍液的組成簡單，僅有醋酸銅、乙二胺及聯胺。以此法進行一次析鍍得到的銅/聚苯胺/PET複合纖維經掃描式電子顯微鏡(SEM)、X光粉末繞射(XRPD)以及導電度量測儀的鑑定顯示，銅鍍層已完整覆蓋住纖維表面，呈現多晶結構，有(111)、(200)、(220)三種晶面。導電度可達約3.7×105 S/m。X光電子能譜儀(XPS)也顯示鍍層近乎由單一銅金屬組成。第二部分中我們利用雷射基質輔助脫附游離飛行時間質譜(MALDI-TOF)偵測含不同側鏈以及帶氯、帶溴結尾的polythiophene高分子，利用isotope pattern比對方式深入解析並比較其光譜之差異性。我們發現雷射激發分子時，有可能將碳-鹵素鍵打斷並產生分子重排及裂解的反應，導致光譜產生許多預期結構以外的訊號；且側鏈的極性越大、鏈長越長越容易發生斷裂的現象，在本論文中會有數種案例的詳細解析。
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本論文藉由Langmuir-Blodgett (LB)技術成長無毒性的magnesium arachidate (MgA)薄膜來修飾4-Phenylbutyltrichlorosilane(4-PBTS)/SiO2/n+-Si2的基材表面，藉著改變MgA薄膜層數(兩層、四層、六層及八層)和基板於LB槽的移動速率(1 mm/min、4 mm/min及6 mm/min)來調控表面性質，以探討對成長於其上之rubrene薄膜結晶性及rubrene薄膜電晶體電性之影響。薄膜之物性將藉著原子力顯微鏡(AFM)、X光光電子能譜(XPS)、X光反射率(XRR)、X光繞射(XRD)與近緣X光吸收細微結構光譜術(NEXAFS)等技術對MgA和rubrene薄膜的表面形貌、分子排列及晶相結構進行綜合探討。 透過原子力顯微影像瞭解到rubrene成長於兩層MgA薄膜的表面形貌為柱狀結構，而成長於四層以上的表面形貌則主要為片狀結構，造成此差異性的因素，推測與MgA薄膜的覆蓋程度有相關性，並且藉由XRD的量測可知，片狀結構為主的rubrene薄膜皆具有結晶相。經由接觸角的量測可得所有基材之表面能量皆在21-23 mN m-1之間，其差異性不大。因此表面能量並非促使rubrene結晶性成長之因素，推測是MgA薄膜所形成的雙層膜層狀堆疊之台階狀結構側邊官能基(-COO−)，與rubrene的苯基產生π-π作用力，使rubrene沿著MgA薄膜的台階側邊垂直基材表面成長，形成片狀且具晶相的結構。其中rubrene成長於八層且基板移動速率為1 mm/min的MgA薄膜上，由於此MgA薄膜堆疊成較緻密之台階結構，且分子較為直立，與基材表面夾角為72°，使得與rubrene作用力較強，因此由XRD可發現其結晶性最佳，製作為元件後可得到最好的載子遷移率，其值可達0.107 cm2V-1s-1。本實驗利用無毒性之鎂離子作為反離子(counterion)形成MgA薄膜，可增進rubrene薄膜的結晶性成長，以提高製作為元件後的電性效能。