清華大學化學系所學位論文
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表面增強式拉曼光譜由於其快速偵測及非侵入性的特性，已經被廣泛地應用在微生物領域的研究上。近年來，細菌表面增強式拉曼光譜中的生物標記也被成功地運用在細菌的抗生素藥物敏感測試。本論文的目標為探討細菌在表面增強拉曼光譜結合藥物敏感測試中的生物標記之分子來源及其所代表的生理意義。我們使用了表面增強拉曼光譜及超高效液相層析串聯電噴灑式質譜儀，鑑定了格蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌與格蘭氏陰性菌大腸桿菌之生物標記的分子來源為來自細菌代謝釋放之數個嘌呤衍生物，更利用質譜將細菌在飢餓壓力之下釋放的分子隨時間作定量分析 。除此之外，為了瞭解細菌釋放此嘌呤衍生物之緣由，我們分析了數個核糖核酸降解基因缺失的大腸桿菌細菌株的拉曼光譜及質譜，證實細菌釋放之嘌呤衍生物與飢餓誘發之核醣體核糖核酸降解之關聯性。
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目前已知S100蛋白質家族具有許多細胞內和細胞外功能，例如鈣穩態，細胞增殖和分化，凋亡，轉錄，組織發育和修復。近年來，S100蛋白引起了研究界的關注，因為S100蛋白與多種導致腫瘤的過程有關，其表達模式的改變與多種人類癌症有關。RAGE（晚期糖基化終產物的受體）是S100蛋白的一般受體之一，S100蛋白也與癌症控制蛋白p53和MDM2（鼠雙分2）有關。 S100，RAGE，p53和MDM2的蛋白質與蛋白質交互作用研究將有助於我們理解它們在癌症控制和生長中的作用。S100蛋白及其靶分子之間形成的大分子復合物結構將能提供有用的數據，這些數據可為尋求抗癌特異性治療分子的藥物研究提供支持。為了理解這一點，我們研究了蛋白質-蛋白質相互作用研究，包括S100A11，S100B，RAGE，S100A1，p53和MDM2蛋白質。 在研究項目1（第二章）中，我們通過1H-15N HSQC-NMR（heteronuclear single-quantum correlation-NMR）滴定法研究了S100A11和S100B蛋白之間的相互作用。然後，我們利用HADDOCK程序構建了S100A11–S100B異二聚體複合物，然後將其與之前報導的S100A11–RAGE V域複合物疊加。疊圖數據證明，S100B可能阻礙S100A11與RAGE V域的結合界面區域。此外，WST-1（水溶性四唑-1）測定法可提供這些蛋白質在體外癌症模型中作用的功能性讀數。我們的研究證實，S100B拮抗劑的改良可以在S100和RAGE的人類疾病治療中扮演重要的角色。 在研究項目2（第三章）中，我們將工作重點放在可能干擾p53-MDM2相互作用的拮抗劑的開發上，因為據推測，刺激wild-type p53活性的有效策略可能需要打斷p53-MDM2相互作用，從而恢復具有wild-type p53的腫瘤中p53腫瘤抑制能力。目前已知，S100A1蛋白與MDM2和p53蛋白的N末端結構域有相互作用，我們對於當S100A1蛋白與MDM2和p53蛋白相互作用時， S100A1的界面區域的研究十分感興趣，此介面區物將作為結構的藥物設計方法的一部分，以發展出合適的拮抗劑干擾p53-MDM2交互作用。我們應用核磁共振光譜研究了S100A1與MDM2和p53的N末端結構域之間的結合界面。使用NMR和HADDOCK方法進行的數據分析顯示出S100A1片段（17個殘基）可能成功阻止p53-MDM2相互作用。為了檢驗癌細胞系中的假設，我們合成了源自S100A1蛋白的17個殘基的肽，並將其連接到可穿透細胞的HIV-TAT肽上，並將其命名為Peptide 1。來自HSQC-NMR competitive bingding實驗，WST-1分析，蛋白質印跡和細胞週期分析的合作數據支持了我們的假設，並表明peptide 1可以成功干擾p53-MDM2相互作用並激活正常的p53功能導致癌細胞的細胞週期停滯和凋亡細胞死亡。此證明了針對癌症生長，開發更多訂製藥物分子的可能性。 總體而言，通過我們的研究工作，我們更理解分子層級上與S100A11，S100B，RAGE，S100A1，p53和MDM2蛋白質有關的蛋白質-蛋白質和/或蛋白質-配體之間的交互作用，並為他們在訂製的抗癌藥物分子的開發與應用做出了貢獻。
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根據研究顯示，身為顯著多功能蛋白質家族的S100蛋白會參與調節數個重要的生物途徑；然而，所有S100蛋白成員的活性都取決於其細胞特異性的表達模式和鍵結目標。S100蛋白透過和RAGE受體的交互作用來觸發發炎反應，並啟動信號級聯和以NF-κB依賴性方式調節發炎反應、細胞增殖、細胞分化及腫瘤發展。此外亦有證據指出，多種S100蛋白透過和p53蛋白結合並抑制其抑制腫瘤的活性來參與腫瘤性疾病。因此，對於定義S100蛋白與目標蛋白交互作用的差異行為之蛋白特異性的基礎，我們依然不了解。尤其是在S100蛋白質複合物之間相互作用弱的情況下，對形成的大分子複合物的結構見解將對藥物研究產生直接影響，以識別和選擇潛在的目標。為了回答這些重要問題，我們選擇屬於S100蛋白家族的S100A12、S100A9、S100A4和p53蛋白作為研究工作的目標。 在第二章中，S100A9和S100A12皆與人類S100鈣結合蛋白家族相關，而其EF-hand的位置與鈣離子結合後將會促進其與目標蛋白的交互作用，並改變其構型。RAGE(Receptor for Advanced Glycation End products)中的V domain對於和S100A9的結合至關重要，其和S100蛋白家族的結合亦有助於細胞增殖。在本論文中，我們證明了S100A12蛋白會阻礙S100A9與RAGE V domain的結合。我們使用螢光和NMR光譜來分析S100A9與S100A12的交互作用，並以1H-15N HSQC滴定及HADDOCK程序所獲得的數據建立S100A9-S100A12二元複合體，而後將該複合體和S100A9與RAGE V domain以相同方向疊合。結果顯示S100A12蛋白可阻斷S100A9與RAGE V domain之間的交互作用，也意味著S100A12可作為S100A9和RAGE V domain相互作用的拮抗劑。這項結果對於開發以S100家族蛋白為基礎的抗癌藥物來說相當有利。 在第三章中，在數種腫瘤形式中過度表達的S100A4是一種小型鈣離子結合蛋白，其與轉移相關之特性使得他在癌症轉移中起著相當重要的作用。根據先前的研究指出，腫瘤抑制因子p53是S100A4的主要目標之一，透過p53，S100A4可調節膠原蛋白的表達和細胞增殖；且當S100A4與p53相互作用時，其能破壞野生型p53的穩定性。在當前的研究中，透過H-15N HSQC滴定及HADDOCK程序所獲得的結果可知，在有鈣離子的情況下，S100A4會與p53的非穩定TAD (transactivation domain)段和pentamidine分子作用。根據我們的結果亦得知p53的TAD段和pentamidine分子在S100A4上的結合位置相近，該發現表示其競爭性的結合機構可干擾S100A4和p53的結合，並增加p53的水平。此外，利用MCF 7細胞的WST-1測試，我們比較了p53活性的不同方面，並發現當pentamidine分子存在時，p53的活性就會提高，也導致其細胞增殖降低。總體而言，我們的研究指出，干擾S100A4和p53的交互作用可阻止癌症的進程；也就是說，S100A4-p53抑制劑可作為癌症治療的新途徑之一。 綜上所述，我們證明了蛋白質-蛋白質和蛋白質-藥物的交互作用對於理解尚未明白的相互作用相當重要，且其亦可用於針對細胞增殖相關疾病（如癌症）治療方法的設計。
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通篇研究主要的目的為製備與分析具有雙/三過渡金屬的有機金屬錯合物。我們製備具有不對稱結構的配位基HNC(Ph)N(H)Dipp，並用其來穩定第六族過渡金屬(鉬; 鉻)，成功合成出具有雙鉬/鉻金屬四重鍵的燈籠形錯合物M2(NC(Ph)NDipp)4 (M = Cr (2) and Mo (3))。 此外，相似的配位基HNC(Me)N(H)Dipp穩定高價數Mn與Fe金屬能夠單離出六當量配位基分別配位於雙金屬的錯合物Li6M2(μ-NC(Me)NDipp)2(κ1-NC(Me)NDipp)4 (M = Mn (5) and Fe (6))。去質子化的配位基與二氯化鈷進行反應能夠單離出三鈷金屬團簇Li3Co3(μ-NC(Me)NDipp)2(μ3-N,N’-NC(Me)NDipp)2(κ1-NC(Me)NDipp)2 (7)。CuCl2能夠催化LiNC(Me)N(Li)Dipp (4) 進行N−N耦合反應，產生雙銅金屬錯合物Li2Cu2(NC(Me)NDipp-NC(Me)NDipp)Cl4 (8)。 2−8的1H-NMR, X-ray crystallography皆已被完整的鑑定。此外，逆磁的8的13C-NMR。具順磁性的5與6也透過SQUID對其磁性進行近一步的探討。
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