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以EGFP為報導基因建構登革熱二型病毒PL046株之結構/非結構基因表現載體

登革熱病毒是屬於黃質病毒科黃質病毒屬，基因全長10.7 kb，是一條正股的單股 RNA，可以產生一個巨蛋白，並經由酵素切割成三個結構與七個非結構蛋白。 在本論文所呈現的研究中，我嘗試建構能表現登革熱病毒二型 PL046 株不同基因體區段的質體。希望能取得單一區段所產生的基因產物。為了能偵測到登革熱病毒的組裝訊號，首先建構了能表現 EGFP 的兩個質體，其上分別帶有登革熱病毒的結構及非結構基因，目的在藉 EGFP 的表現提升觀察表現的靈敏度。第二、為了能大量表現 E protein，將登革熱病毒二型 PL046 株之 E gene 建構於pLP質體上，目的在單獨產生 E protein，做功能性研究。以實驗室前人的結果為基礎，我建構完成了上列質體。以定序及限制酶反應進行分析，確認這些 constructs 都沒有 non-sense mutations。

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以螢光共振能量轉移揭示蛋白質PGB1分子內摺疊機制

蛋白質如何摺疊成特殊的結構，為目前學界不斷探討的重點。為了要能夠理解蛋白質摺疊機制，研究單功能區蛋白質（single-domain protein）變成了一個很重要的指標。本研究中，我們以Protein G B1 Domain（PGB1）作為研究之標的蛋白質，利用本實驗室所開發之蛋白質摺疊方法，Over-critical Folding Process，將PGB1由未摺疊態摺疊至自然態並觀察摺疊中間的結構變化。PGB1是一個小型蛋白質只有56個胺基酸，是Protein G的IgG-binding domain。藉由觀察PGB1自身的Trp43螢光光譜和acrylamide焠熄光譜，可發現PGB1之摺疊是一個二狀態反應（two-state reaction）的摺疊過程々而以動態光散射（dynamic light scattering）觀察分子大小的變化認為PGB1摺疊過程應具有另一個中間態存在。藉由螢光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）分析各主要二級結構之間在摺疊過程中的變化，發現PGB1的β-hairpin 2與α-helix在摺疊初期就已互相靠近，但其β-hairpin 1顯然較前者晚形成々綜合以上結果顯示蛋白質PGB1的摺疊是一個多狀態反應（multi-state reaction）。本研究藉由FRET方法為PGB1摺疊研究開啟新的一頁。

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仿生性雙硫醇架橋-雙核釕複合物及其衍生物模擬雙硫鐵產氫酶活化中心之研究

氫能源是一種乾淨無污染並且可作為替代石化燃料的再生性能源。然而目前的氫氣製備，主要是以蒸氣重組 (steam reforming) 或電裂解水(water splitting)的方式來產氫，不僅效能不佳且成本昂貴。在自然界中，產氫酶與氫氣的代謝息息相關，其主要是催化氫分子和氫質子之間的互相轉換 (2H++2e- ⇆ H2)。在適合的反應環境條件下此酵素能快速地進行催化反應而產生氫氣。近年來利用結晶學的技術，科學家已成功地解出Desulfovibrio desulfuricans 以及Clostridium pasteurianum中鐵-鐵產氫酶 ([FeFe]-Hydrogenase) 的X-ray晶體結構。而這類酵素活化中心的氫簇分子 (H-cluster) 就是使其具有高效能產生氫氣的催化中心。因此我們的目標就在於模擬並合成出鐵-鐵產氫酶活化中心-氫簇分子(H-cluster)的化學結構-[(μ-DT)Fe2(CO)6] (DT: dithiolate)，並以置換其中心金屬、或在其雙硫架橋上取代成不同的官能基以及修飾上不同的磷衍生物來探討這些仿生酵素活化中心催化氫氣產生的效率以及機制。我們合成了一系列雙硫醇架橋之雙核釕複合物 [Ru2(S2C3H6)(μ-X) (CO)6] (X=H, COOH, N-Boc) 去模擬氫簇分子 (H-cluster) 的結構，並藉由核磁共振光譜(NMR)、電噴灑質譜儀(ESI-MS)以及傅立葉轉換紅外線光譜 (FT-IR) 來分析及鑑定其結構。其後我們利用有機相和水相兩種不同的反應系統來探討這些有機雙核釕金屬複合物的產氫活性。在有機相系統中主要是以甲酸 (Formic acid, HCOOH) 來當作氫氣來源，並外加三種具有不同的推拉電子特性之含磷化合物 (三苯基膦 (triphenylphosphine (P(Phe)3)), 三吡咯膦(tripyrrolephosphine (P(Pyr)3))及三吡咯啶膦(tripyrrolidinephosphine (P(Pyrldn)3)))來探討其照光催化之產氫活性分析。另一方面，在水相光催化產氫系統中，我們是以抗壞血酸 (ascorbic acid) 當作電子提供者並輔以一個釕金屬複合物光敏化劑 (Ru(bpy)32+)，使得仿生有機雙核釕金屬複合物在照光條件下可以催化裂解水，並測得其在水相系統下之光催化產氫效率。在產氫活性的比較上，有機相反應的效率較水相來的好；而在有機相當中，又以三吡咯啶膦(P(Pyrldn)3)的添加更能夠去增加其活性。在未來的應用上，我們希望透過此仿生性雙核釕複合物的建構，對於鐵-鐵產氫酶 ([FeFe]-Hydrogenase) 其活化氫簇分子中心的催化產氫機制有更進一步的探討，並使其能應用於未來氫能源工業上。

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HdeB、HdeB1、HdeD蛋白質參與克雷白氏肺炎桿菌CG43抗酸反應的探討

克雷白氏肺炎桿菌是一株伺機性的格蘭氏陰性菌，常造成院內感染，包含：肺炎、化膿性感染、尿道感染、敗血症等等。在侵入人體到達腸道前，必須經過強酸環境的胃，細菌如何從強酸的環境中存活下來，是一個重要的課題。已知，大腸桿菌有五種抗酸系統和具有十二個基因的酸適應島嶼（AFI）。我們利用生物資訊工具搜尋現有的CG43基因體序列，結果發現一類似酸適應島嶼的區域，其上的hdeB、hdeB1、hdeD和大腸桿菌AFI的hdeA、hdeB、hdeD序列相近。大腸桿菌的HdeA及HdeB蛋白存在其膜間質中，在酸性環境中活化成為伴隨蛋白（Chaperone）來保護被酸破壞的膜間質蛋白。我們在此研究中探討hdeB、hdeB1、hdeD基因產物是否也扮演類似抗酸的角色，並且進一步分析HdeB及HdeB1是否也具有Chaperone的功能。本研究室曾發現在靜置培養下，雙分子訊息傳遞系統調控基因rcsB或kvhA的缺損突變菌株會降低他們的啟動子活性，而在震盪培養下，我們發現在rcsB、kvhA、fur、phoP的缺損突變菌株中hdeDB和hdeB1啟動子活性下降，而rpoS的缺損反而對hdeDB啟動子活性有小幅度的提升；利用LacZ報告系統發現在弱酸環境中，hdeDB和hdeB1的啟動子活性都比中性環境略高；而hdeB、hdeB1或hdeD基因缺損突變株的抗酸能力較野生株低，其中hdeB1基因缺損突變株的抗酸能力最弱；最後，重組的HdeB蛋白被證實能夠保護ADH不被強酸破壞，此暗示著HdeB有伴隨蛋白的功能。

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具有偵測銅金屬離子之8-hydroxyquinoline衍生物磁振造影對比劑

過去幾年來越來越多的證據顯示腦內的金屬離子不平衡會導致許多疾病。由於磁振造影(MRI)具有非侵入性及高解析度之優點，使磁振造影成為臨床醫療診斷上相當重要之影像工具。且磁振造影之對比劑也愈來愈被重視，各種不同功能之對比劑也漸漸被開發。在本研究中，設計並合成可偵測細胞中二價銅離子之磁振造影對比劑[Gd(HQ-DO3A)]。在銅離子存在的環境下，[Gd(HQ-DO3A)]的內層水分子數及弛緩率有顯著上升。除此之外，[Gd(HQ-DO3A)]與其他金屬離子比較對於銅離子也有良好的選擇性。另一方面，當Cu2+ 存在時，因為Cu2+會削弱quinolin之螢光，使得原先由quinolin轉移至銪金屬(Eu3+)之能量減少，進而使銪金屬(Eu3+)所發出之螢光也被削弱。由結果顯示[Gd(HQ-DO3A)]相當具有潛力可成為利用磁振造影來偵測二價銅離子之雙功能磁振造影對比劑。

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利用飽和定點突變方法探討酵母菌氧化鯊烯環化酵素其胺基酸Val454與Asn700的功能並搭配表現之阿拉伯芥轉醣酵素進行固醇化合物轉醣衍生化的研究

氧化鯊烯環化酵素在真菌、哺乳類動物或者高等植物中催化氧化鯊烯進行環化和重組反應。此催化反應透過環氧基開環、多烯與碳陽離子間之誘導環化、氫化基和甲基之重組反應及最後具有高度專一性的去質子步驟，使得直鏈狀之氧化鯊烯環化形成多環的三萜類產物。在氧化鯊烯環化酵素的酵素活性區域內，有多個位在第一層或第二層的胺基酸已被證實，其對於穩定碳陽離子中間物或酵素催化活性具有很重要的關係。為了更進一步闡明其他胺基酸在氧化鯊烯環化酵素內所扮演的角色，我們利用酵母菌的氧化鯊烯環化酵素，針對其纈胺酸454號胺基酸 (Val-454) 和天冬醯胺酸700號胺基酸 (Asn-700) 進行飽和定點突變實驗，以探討此兩個胺基酸殘基在氧化鯊烯環化酵素中其功能性之角色。根據所進行的飽和突變產物分析結果，我們對纈胺酸454號胺基酸和天冬醯胺酸700號胺基酸的催化角色已有所了解。天冬醯胺酸700號胺基酸可能經由突變作用直接影響涵蓋苯丙胺酸699號胺基酸 (Phe-699)、異白胺酸705號胺基酸 (Ile-705) 至酪胺酸707號胺基酸 (Tyr-707) 活性區段的催化能力，因此天冬醯胺酸700號胺基酸對於多個碳陽離子中間產物具有重要的穩定作用；纈胺酸454號胺基酸其側鏈可能是輔助B環環化與幫助去質子步驟的一個重要角色，突變產物結果也指出，纈胺酸454號胺基酸可以穩定碳-10中間產物。這些研究證據均表示纈胺酸454號胺基酸和天冬醯胺酸700胺基酸位置對於氧化鯊烯環化酵素其一連串的催化作用，具有舉足輕重的角色。此外由於氧化鯊烯環化酵素的環化反應已被本實驗室研究多年，大致的環化機制已充分地被了解，所以我們想利用突變後的產物來開闢一個新的研究方向。因此我們轉殖、表現與純化阿拉伯芥中的一個轉醣酵素，並在膠凝體電泳上可看到一個約70千道爾吞胺基酸大小的蛋白質。此外我們利用基質輔助雷射吸附質譜技術成功鑑定出此純化蛋白為阿拉伯芥轉醣酵素，且利用偶合酵素法確認其對於膽固醇分子具有轉糖活性。由實驗結果顯示，其能催化四環固醇類產物轉變成固醇配醣體，我們期望利用此轉醣酵素針對我們所獲得的多個突變株其三萜類產物進行衍生化，以祈能利用這些衍生化產物應用於未來藥物學方面的研究。

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利用定點飽和突變技術對於酵母菌氧化鯊烯環化酵素中Gly383及Thr384進行功能性分析並藉由表現之蒺藜苜蓿轉醣酵素對三萜類化合物進行醣基衍生化之研究

在酵母菌以及哺乳類動物中，氧化鯊烯環化酵素(ERG7或OSC)催化直鏈狀的氧化鯊烯((3S)-2,3-oxidosqulaene)進行環化/重組反應而產生羊毛硬脂醇。在不同的生物物種中，像是動物、真菌和植物會藉由不同的環化酵素和反應機制形成不同的產物。這個複雜的環化/重組反應機制，包含了氧化鯊烯上的環氧基(epoxide)被質子化而起始環化反應，以及一連串的氫化基、甲基的重組和最後高度專一性的去質子化步驟。根據先前的研究，在環化酵素中對於活性區域及立體化學結構具有重要影響的胺基酸進行突變，可以得到單環、三環和四環等多樣性固醇類產物。為了更進一步瞭解其他關鍵胺基酸對於OSC在環化過程及反應機制所扮演的角色，利用飽和定點突變的方式，分析存在於酵素假設活性區中的相對應胺基酸，Gly383 及Thr384。在ERG7T384X 和 ERG7G383X突變株中，分離出許多四環和三環產物，包括parkeol、9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol、protosta-16,24-dien-3β-ol 和 (13αH)-isomalabarica-14(26),17,21-trien-3β-ol 等。而藉由酵素結構模擬圖我們也注意到Gly383 和Thr384位在受質C-17原脂醇碳陽離子旁的環狀區域（loop）上。Gly383 和Thr384 對於穩定C-14 和C-17原脂醇碳陽離子，以及最後脫氫反應的C8 / C-9 碳陽離子中間物似乎扮演重要的角色，對這兩個胺基酸進行突變可能會對酵素活性區域的結構及環化/重組反應造成影響，而得到這些非專一性的多樣性產物。 三萜皂苷是一群具有相似化學結構的多樣性產物，由三萜皂苷配基和醣基所組成，為分布於高等植物中的二級代謝產物且多方面的生物活性可被廣泛應用。大部分的三萜皂苷其C-3上的OH 基都接有醣基或醣鏈，而此結構也被認為是其具有生物活性的關鍵。在利用定點突變研究氧化鯊烯環化酵素重排和環化機制的實驗當中，分離出許多四環的中間物及脫氫位置不同的產物，為了使這些產物有更多的應用性。我們合成出由蒺藜苜蓿所分離出的轉醣酵素基因-UGT73K1，並得到大小為 52-kDa 的蛋白質。未來希望將氧化鯊烯環化酵素的突變產物作為此轉醣酵素的受質，在其C-3上的OH 基接上醣基並作相關的活性測試，使此多樣性產物能有廣泛的生物活性，也期盼在生物製藥方面有進一步的發展。

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溶藻弧菌胺醯組胺酸雙胜肽酶之晶體結構與突變分析

胺醯組氨酸雙胜肽酶(PepD，EC 3.4.13.3)為胜肽酶家族M20中的一員，具有寬廣受質專一性，包括可水解肌雙胜(carnosine)及相關之加長肌雙胜(homocarnosine)以及一些三胜肽。基本上PepD可催化水解Xaa-His雙胜肽而釋放出N端的胺基酸。在此論文中，主要研究溶藻弧菌PepD的蛋白質結構、生化特性和金屬催化機轉。利用蛋白質結晶學解出PepD的晶體結構，結果顯示PepD為同源單體所組成的一個二聚體，每個單體包含一個“蓋子區域”和一個雙鋅離子依存的“催化區域”。不同於其他M20家族的二聚體，PepD二聚體結構展現一個獨特的十字構形是經由蓋子區域接觸面間的交互作用力所形成。突變分析確定幾個重要的殘基對於蛋白質結構、受質的辨認、與酵素的活性扮演著關鍵的角色。另一方面，銅離子取代PepD活性中心的雙鋅離子，結果產生兒茶酚氧化活性。我們發現”雙銅−PepD”能氧化末端帶有極性的兒茶酚衍生物，而無法氧化兒茶酚或是帶有非極性支鏈的3,5−叔丁基鄰苯二酚(DTC)。蛋白質−配體入塢結果顯示，此類帶有極性末端的兒茶酚衍生物可與”雙銅−PepD”結合。綜合言之，此研究對胺醯組氨酸雙胜肽酶的酵素結構-功能-反應機制之關係提供更進一步的了解，同時加速開發抗體−酵素導向之前導藥物治療(ADEPT)。此外，我們證實了金屬取代是造成PepD水解酵素功能酵和氧化活性之間轉換的關鍵，因此對於酵素趨異演化開啟了一個嶄新的方向。

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高通量酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)測定蛋白質酪氨酸亞硫酸化

蛋白質酪氨酸亞硫酸化作用，是被蛋白質酪氨酸亞硫酸化酵素所催化，這是一個普遍的轉譯後修飾作用(PTM)。大多數會被輸送到高基氏體網路的分泌及穿膜蛋白，都有可能被硫酸化。蛋白質亞硫酸化作用藉由改變蛋白質間的作用力進而調節許多生理與病理的反應，包括止血作用，白血球的運送，以及病毒的感染…等。因此，開發一個容易使用的平台，對於能夠廣泛的偵測TPST的酵素活性，以及檢測被亞硫酸化的蛋白質是非常重要的。傳統被用來偵測蛋白質亞硫酸化作用的方法包括繁瑣的放射性標記與質譜儀分析；然而，同位素的來源昂貴，以及在酸性條件下，酪氨酸殘基上的亞硫酸基團非常不穩定，這些都是對於一個高通量的分析法所需要令人擔心的因素。在這項研究中，我在酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)上結合了PAPSS與TPST催化反應，利用GST-PSGL-1當作受質。此方法在最佳化的條件下，提供了高靈敏性、高通量、以及節省時間與花費的優點。利用ELISA為基礎的TPST分析系統，能夠被廣泛的用來尋找潛在的TPST受質以及抑制劑甚至是蛋白質間相互作用力之分析。此外，我們更能整合此系統到蛋白質晶片上，將有助於未來蛋白質體學的研究。

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應用於Legumain 偵測之磁振造影對比劑 Gd-NBCB-TTDA-Legumain 之研究

磁振造影是目前臨床醫學上常使用的診斷工具，不同於其他造影技術，其對軟組織的成像具有相當的效果，但靈敏度卻稍顯不足。因此本研究設計合成一條由8個胺基酸所組成的胜肽，其對Legumain酵素具有目標性，且在多種腫瘤上都有過度表現。並在胜肽N端鍵結NBCB-TTDA，形成對腫瘤組織中的Legumain具有專一辨識功能的磁振造影對比劑Gd-NBCB-TTDA-Legumain。在20 MHz、37.0 ± 0.1 °C下，Gd-NBCB-TTDA-Legumain所求得弛緩率(r1)為4.94 mM-1s-1。在T1弛緩時間變化量的實驗中發現，當有存在3T3-Legumain cell lysate時，T1約上升20 %。在細胞毒性實驗中發現，在高濃度(1 mM) Gd-NBCB-TTDA-Legumain培養下，細胞存活率仍達85 %以上，推測若以低劑量打入動物體內不具有抑制細胞生長的危險性。在體內(in vivo)實驗研究中，Gd-NBCB-TTDA-Legumain可目標化至CT-26腫瘤且提高其訊號強度，而使腫瘤位置容易辨別。結果顯示此磁振造影對比劑有潛力對有Legumain表現之腫瘤進行診斷及追蹤。